i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN HỦY PHENOL PHÂN LẬP TỪ NƢỚC NHIỄM DẦU Ở BỜ BIỂN VŨNG TÀU, TỈNH BÀ RỊA - VŨNG TÀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Thái Nguyên, năm 2015 ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN HỦY PHENOL PHÂN LẬP TỪ NƢỚC NHIỄM DẦU Ở BỜ BIỂN VŨNG TÀU, TỈNH BÀ RỊA - VŨNG TÀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K43 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh ThS Nguyễn Thị Đoàn Thái Nguyên, năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh TS Lê Thị Nhi Công tận tình hướng dẫn dìu dắt trình nghiên cứu, học tập hoàn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tố Uyên - Phó trưởng phòng – Phụ trách phòng CNSH môi trường toàn thể cán nhân viên phòng, đặc biệt ThS Vũ Thị Thanh tận tình giúp đỡ bảo suốt trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận Để hoàn thành khóa luận này, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Đoàn thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm với lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu trường Viện Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình bạn bè động viên giúp đỡ nhiều để hoàn thành tốt khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hƣơng ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Vai trò mạng lưới ngoại bào màng sinh học 11 Bảng 3.1 Danh mục số hóa chất sử dụng 20 Bảng 3.2 Các loại môi trường nuôi cấy 20 Bảng 3.3 Danh mục số máy móc thiết bị sử dụng 21 Bảng 3.4 Các thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 4.1 Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn phát triển môi trường khoáng Gost có bổ sung 50 ppm phenol (có glucose) 34 Bảng 4.2 Mức độ tương đồng trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng VTPG5 so với số chủng vi khuẩn 41 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc hóa học phenol Hình 2.2 Cấu trúc không gian biofilm với mạng lưới ngoại bào xung quanh 12 Hình 3.1 Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR 28 Hình 4.1 Mẫu nước nhiễm dầu lấy từ bãi sau thành phố Vũng Tàu 32 Hình 4.2 Mẫu làm giàu môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm phenol (có glucose) 33 Hình 4.3 Tập đoàn vi sinh vật môi trường khoáng Gost thạch bổ sung 50 ppm phenol (A) mẫu làm giàu glucose (B) mẫu làm giàu có glucose 33 Hình 4.4 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng vi khuẩn sau 48h nuôi cấy 35 Hình 4.5 Khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn 36 Hình 4.6 Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm phenol 37 Hình 4.7 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng VTPG5 38 Hình 4.8 Điện di đồ DNA tổng số chủng vi khuẩn 38 Hình 4.9 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA chủng vi khuẩn VTPG5 39 Hình 4.10 Điện di đồ sản phẩm PCR chủng VTPG5 sau tinh 40 Hình 4.11 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng Rhodococcus sp VTPG5 nhiệt độ khác sau 48 nuôi cấy 42 Hình 4.12 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 43 Hình 4.13 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng Rhodococcus sp VTPG5 pH khác sau 48 nuôi cấy 44 Hình 4.14 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng pH đến khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 44 iv Hình 4.15 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng Rhodococcus sp VTPG5 nồng độ muối NaCl khác sau 48 nuôi cấy 45 Hình 4.16 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 46 Hình 4.17 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng Rhodococcus sp VTPG5 nguồn carbon khác sau 48 nuôi cấy 47 Hình 4.18 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng nguồn carbon đến khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 47 Hình 4.19 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng Rhodococcus sp VTPG5 nguồn nitơ khác sau 48 nuôi cấy 48 Hình 4.20 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 48 Hình 4.21 Màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 sau 48 nuôi tĩnh điều kiện tối ưu nhuộm dịch tím tinh thể 0,1% 49 Hình 4.22 Khả sinh trưởng phát triển màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 nồng độ phenol khác sau ngày 49 Hình 4.23 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá khả sinh trưởng phát triển màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 nồng độ phenol khác 50 Hình 4.24 Biểu đồ thể khả phân hủy phenol màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 sau ngày nuôi cấy 50 v DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Biofilm : Màng sinh học Bp : Base pair (cặp base) cm, mm : centimeter, milimeter DDBJ : DNA Data Bank of Japan DNA : Deoxyribonucleic acid ĐC : Đối chứng (mẫu vi sinh vật) EPS : Extracellular Polymeric Substances (hợp chất ngoại bào) kDa : KiloDalton LB : Luria-Broth mg, g, kg : milligram, gram, kilogram nm, µm : nanometer, micrometer NOMs : Natural Organic Matters (các chất hữu tự nhiên) OD : Optical Density (mật độ quang học) PAHs : Polycyclic Aromatic Hydrocarbon PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) ppm : parts per million (đơn vị phần triệu, mg/l) RNA : Ribonucleic acid rRNA : Ribosomal ribonucleic acid µl, ml, l : Microliter, milliliter, liter vi MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nội dung đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài .3 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học đề tài 2.1.1 Đặc điểm chung phenol 2.1.2 Màng sinh học (biofilm) 2.1.3 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả tạo màng sinh học (biofilm) vi sinh vật 12 2.1.4 Các phương pháp phân loại vi sinh vật 15 2.2 Tình hình nghiên cứu nước 16 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 16 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 17 PHẦN ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 19 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 19 3.2 Địa điểm thời gian thực đề tài .19 3.2.1 Địa điểm 19 3.2.2 Thời gian 19 3.3 Vật liệu, hóa chất thiết bị sử dụng .19 3.3.1 Vật liệu 19 3.3.2 Hóa chất môi trường 19 3.3.3 Thiết bị dụng cụ 21 3.4 Nội dung nghiên cứu 21 3.5 Phương pháp nghiên cứu 22 vii 3.5.1 Thu thập mẫu 22 3.5.2 Phân lập chủng vi khuẩn có khả sử dụng phenol 22 3.5.3 Đánh giá khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn 23 3.5.4 Khảo sát khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn tạo màng tốt nguồn chất phenol 25 3.5.5 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân loại chủng vi khuẩn VTPG5 25 3.5.6 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả tạo màng sinh học (biofilm) chủng vi khuẩn 29 3.5.7 Đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học vi khuẩn 31 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn vừa có khả phân hủy phenol vừa có khả tạo biofilm .32 4.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả phân hủy phenol 32 4.1.2 Khả tạo biofilm chủng vi khuẩn phân lập 35 4.1.3 Khảo sát khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn tạo màng tốt nguồn chất phenol 36 4.2 Đặc điểm hình thái phân loại chủng vi khuẩn VTPG5 37 4.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào 37 4.2.2 Phân loại phân tử chủng VTPG5 dựa vào việc xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA 38 4.3 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến hình thành màng sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn 42 4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 42 4.3.2 Ảnh hưởng pH 43 4.3.3 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl 45 4.3.4 Ảnh hưởng carbon 46 4.3.5 Ảnh hưởng nitơ 47 4.4 Đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn 49 viii PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 46 Hình 4.16 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 Từ hình 4.15 4.16 thấy, chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 có khả hình thành màng sinh học tốt nồng độ muối từ 0,5 - 2% tốt nồng độ 1,5% Ở nồng độ muối cao 2% chủng vi khuẩn có khả phát triển khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn có xu giảm dần tăng nồng độ Điều chứng tỏ, chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 có khả chịu mặn tốt, phổ sinh trưởng rộng có khả thích nghi cao với môi trường 4.3.4 Ảnh hưởng carbon Nguồn carbon có ảnh hưởng nhiều đến trình hình thành màng sinh học góp phần xây dựng thành phần tế bào Do đó, việc kiểm tra tìm nguồn carbon lý tưởng thích hợp cho việc tạo màng sinh học cần thiết Vì lý đó, tiến hành thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng nguồn carbon tới phát triển chủng Rhodococcus sp VTPG5 Nguồn carbon sử dụng loại đường khác như: glucose, lactose, mantose, saccarose Kết thể hình 4.17 4.18 47 ĐC Saccarose Lactose Glucose Mantose Hình 4.17 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng Rhodococcus sp VTPG5 nguồn carbon khác sau 48 nuôi cấy Hình 4.18 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng nguồn carbon đến khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 Kết từ hình 4.17 4.18 cho thấy, chủng Rhodococcus sp VTPG5 có khả tạo màng tốt loại đường, nhiên chủng vi khuẩn có khả tạo màng tốt môi trường có bổ sung nguồn carbon glucose Kết giải thích do: glucose loại gluxit đơn giản không bị thủy phân nữa, loại đường đơn giúp thể vi sinh vật dễ dàng hấp thu chuyển hóa glucose có khả đồng hóa nhanh sử dụng nhanh 4.3.5 Ảnh hưởng nitơ Nitơ nguyên tố đa lượng có ý nghĩa lớn trình sinh trưởng, phát triển vi sinh vật Nó có chức xây dựng nên acid amin, nucleotide acid nucleic coenzym Trong hình thành màng sinh học, nitơ cần thiết 48 việc tạo hợp chất ngoại bào – thành phần quan trọng tạo nên màng sinh học Do đó, sử dụng nguồn nitơ vô nitơ hữu để nghiên cứu ảnh hưởng đến khả tạo màng gồm: KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4, pepton, cao men Kết thể hình 4.19 4.20 ĐC KNO3 NaNO3 Pepton Cao men (NH4)2SO4 Hình 4.19 Khả bắt giữ tím tinh thể màng sinh học chủng Rhodococcus sp VTPG5 nguồn nitơ khác sau 48 nuôi cấy Hình 4.20 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 Từ hình 4.19 4.20 ta thấy, chủng Rhodococcus sp VTPG5 có khả tạo màng tốt nguồn nitơ vô hữu Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có khả hình thành màng sinh học tốt bổ sung nguồn nitơ muối (NH4)2SO4 Như vậy, điều kiện tối ưu cho hình thành màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 nhiệt độ 37oC, pH 7, nồng độ muối NaCl 1,5%, nguồn carbon glucose, nguồn nitơ (NH4)2SO4 49 4.4 Đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn Để đánh giá khă phân hủy phenol chủng vi khuẩn lựa chọn, tiến hành nuôi tạo biofilm thể tích 15 ml môi trường tối ưu bình trụ, với điều kiện tối ưu lựa chọn Sau 48 nuôi cấy nhận thấy hình thành màng sinh học chủng Rhodococcus sp VTPG5 rõ rệt (hình 4.21) ĐC VTPG5 Hình 4.21 Màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 sau 48 nuôi tĩnh điều kiện tối ưu nhuộm dịch tím tinh thể 0,1% Sau hút dịch nuôi cấy giữ lại màng sinh học, tiến hành bổ sung vào lọ tương ứng gồm: 20 ml khoáng Gost, 0,1% vitamin, glucose 0,1%, phenol nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm 250 ppm Đem nuôi tĩnh tủ ấm 37oC Sau 24 nuôi cấy, hút ml dịch để tiến hành đo OD bước sóng 600 nm vòng ngày Sau ngày, thu kết thể hình 4.22 4.23 ĐC 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm 250 ppm Hình 4.22 Khả sinh trưởng phát triển màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 nồng độ phenol khác sau ngày 50 Hình 4.23 Biểu đồ mật độ quang học đánh giá khả sinh trưởng phát triển màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 nồng độ phenol khác Từ hình 4.22 4.23 thấy chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 có khả phát triển tốt tất nồng độ phenol, nhiên nồng độ phenol 200 ppm chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển tốt Do vậy, chọn nồng độ phenol 200 ppm để tiến hành đánh giá khả phân hủy phenol màng sinh học chủng vi khuẩn Tuy nhiên, để đánh giá cách xác tiến hành gửi mẫu phân tích khả phân hủy phenol màng sinh học phương pháp đo quang Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Kết phân tích thể hình 4.24 Hình 4.24 Biểu đồ thể khả phân hủy phenol màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 sau ngày nuôi cấy 51 Kết phân tích cho thấy hàm lượng phenol lại sau ngày mẫu có màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 0,469 mg/l (so với mẫu ban đầu 200 mg/l) Từ tính hiệu suất phân hủy phenol màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 99,8% Sở dĩ, hàm lượng phenol mẫu đối chứng sau ngày giảm so với mẫu đối chứng ngày 5,4 mg/l (tương đương 2,7%), trình thử nghiệm phenol bị phân hủy phần nhờ điều kiện tự nhiên như: ánh sáng, bay Từ kết thu cho thấy, khả phân hủy phenol màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 tốt Như vậy, màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 tạo thành đề tài nghiên cứu vừa có khả tạo màng tốt vừa có khả phân hủy phenol cao Do đó, ứng dụng chủng vi khuẩn việc xử lý phenol dẫn xuất khác phenol gây ô nhiễm môi trường Hiện nay, công bố khả phân hủy phenol màng sinh học nước giới hạn chế mà nghiên cứu chủ yếu tập trung khả phân hủy phenol dạng tế bào tự Nhóm tác giả Liu Y.J cộng năm 2009 phân lập hai chủng Acinebacter sp XA05 Sphingomonas sp FG03 từ bùn hoạt tính đất ô nhiễm phenol có hiệu suất phân hủy phenol 78% 68% sau 60 với hàm lượng ban đầu 100 ppm (Liu cs, 2009) [38] Năm 2010, Suhaila Y.N cộng công bố nghiên cứu chủng vi khuẩn Rhodococcus UKM-P phân lập từ nước ô nhiễm dầu có hiệu suất phân hủy phenol đạt 98,5% sau ngày nuôi lắc với hàm lượng phenol ban đầu 50 ppm (Suhaila cs, 2010) [49] Tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam, Cung Thị Ngọc Mai cộng (2010), phân lập chủng BTL11 từ nước thải khu công nghiệp có khả phân hủy 100 ppm phenol với hiệu suất 99% sau 14 ngày xử lý (có bổ sung 0,5% glucose) (Cung Thị Ngọc Mai cs, 2010) [1] Tiếp đến năm 2014, Vũ Thị Thanh cộng công bố nghiên cứu chủng vi khuẩn Bacillus sp DX3 phân lập từ nước nhiễm dầu có hiệu suất phân hủy 52 phenol đạt 99,95% sau ngày nuôi lắc với hàm lượng phenol ban đầu 150 ppm (Vũ Thị Thanh cs, 2014) [9] So sánh với chủng vi khuẩn khác giới Việt Nam khả phân hủy phenol chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 tốt Điều khẳng định việc xử lý phenol biofilm cho hiệu xử lý cao so với dạng tế bào tự Bởi biofilm vi sinh vật có khả chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh, chúng liên kết chặt chẽ với tạo thành khu hệ vi sinh vật thực trao đổi chất hiệu hạn chế cạnh tranh vi sinh vật khác vi khuẩn lơ lửng tự nước (Cheng cs, 2010) [19] Như vậy, với chủng vi khuẩn khác, chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 mà phân lập góp phần làm phong phú thêm số lượng chủng vi sinh vật có khả phân hủy phenol cao nước nhiễm dầu để phục vụ cho công nghệ phân hủy sinh học nguồn nước ô nhiễm sau 53 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ mẫu nước nhiễm dầu thu thập bãi sau thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, phân lập chủng vi khuẩn Trong đó, VTPG5 vừa tạo màng sinh học mạnh vừa có khả phát triển tốt nguồn chất phenol Xác định đặc điểm sinh học chủng VTPG5 Chủng vi khuẩn đặt tên Rhodococcus sp VTPG5 đăng ký ngân hàng DDBJ với mã số LC057207 Khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp VTPG5 tốt nhiệt độ 37oC, pH 7, nồng độ muối NaCl 1,5%, nguồn carbon glucose, nguồn nitơ (NH4)2SO4 Màng sinh học chủng Rhodococcus sp VTPG5 tạo điều kiện tối ưu có hiệu suất phân hủy phenol đạt 99,8% sau ngày nuôi cấy với hàm lượng phenol ban đầu 200 ppm 5.2 Kiến nghị Nghiên cứu thêm khả phân hủy phenol màng sinh học từ hỗn hợp chủng vi khuẩn có khả tạo màng sinh học tốt phân lập nhằm nâng cao hiệu xử lý phenol nước ô nhiễm dầu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cung Thị Ngọc Mai, Trần Hải Đăng, Nguyễn Văn Bắc, Nghiêm Ngọc Minh (2010), “Khả phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân phenol chủng vi khuẩn BTl11 phân lập từ nước thải khu công nghiệp”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(3B), 1739-1744 Đinh Thúy Hằng, Lê Gia Hy, Lưu Thị Bích Thảo (1998), “Vi sinh vật phân hủy hydrocarbon dầu mỏ”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 16(3), 1-12 Lê Gia Hy (2010), Giáo trình vi sinh vật học, Nxb Khoa học tự nhiên công nghệ, 111-120, 136-140 Lê Thị Nhi Công, Cung Thị Ngọc Mai, Nghiêm Ngọc Minh (2013), “Một số yếu tố sinh lý sinh hóa ảnh hưởng tới khả tạo màng sinh học chủng nấm men Trichosporon asahii QN-B1 phân hủy phenol phân lập từ Hạ Long, Quảng Ninh”, Tạp chí sinh học, 35(3se), 106-113 Nguyễn Quang Huy, Ngô Thị Kim Toán (2014), “Khả tích lũy photpho tạo biofilm chủng Bacillus licheniformis A4.2 phân lập Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 30(1), 43-50 Nguyễn Quang Huy, Trần Thúy Hằng (2012), “Phân lập chủng Bacillus có hoạt tính tạo màng sinh vật (biofilm) tác dụng kháng khuẩn chúng”, Tạp chí sinh học, 34(1), 99-106 Nguyễn Thành Đạt (2004), Cơ sở Sinh học vi sinh vật, Nxb giáo dục Trương Thế Kỷ (2000), Hóa hữu 1: hợp chất hữu đơn chức đa chức, Nhà xuất y học Vũ Thị Thanh, Lê Thị Nhi Công, Nghiêm Ngọc Minh (2014), “Nghiên cứu khả phân hủy phenol chủng vi khuẩn ĐX3 phân lập từ nước thải kho xăng dầu Đỗ Xá – Hà Nội”, Tạp chí Sinh học, 36 (1SE), 28-33 Tiếng Anh 10 Agarry S.E, Durojaiye A.O and Solomon B.O (2008), “Microbial degradation of phenols”, International Journal of Environment and Pollution, Vol 32(1), 12-28 11 Aksu Z, Bulbul G (1990), “Determination of the effective diffusion coefficient of phenol in calcium alginate immobilized Pseudomonas putida”, Enzyme Microbial Technology, pp 334-348 12 Allen S.K, Allen C.W (1997), “Phenol concentrations in air and water samples collected near a wood preserving facility”, Bull Environ Contam Toxicol, 59(5), 702-707 13 Bendinger B., Rijnaarts H.H.M., Altendorf K., Zehnder A.J.B (1993), “Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolicacids”, Applied and Environmental Microbiology, 59(11), pp 3973-3977 14 Bidleman T.F, Walla M.D, Roura R, Carr E, Schmidt S (1993), “Organochlorine pesticides in the atmosphere of the southern ocean and Antarctica, January - March, 1990”, Marine Pollution Bulletin, 26(5), 258-262 15 Burmolle M., Webb J.S., Rao D., Hansen l.H., Sorensen S.J and Kjelleberg S (2006), “Enhanced biofilm formation and increased resistance to antimicrobial agents and bacterial invasion are caused by synergistic interactions in multispecies biofilms”, Applied and enviromental Microbiology, 72(6), pp 3916-3923 16 Clayton G.D., Clayton F.E (1994), “Patty’s industrial hygiene and Toxicology.4th ed”, John wiley & sons inc: New York, vol 2A, pp 132 17 Costerton J.W, Ingram J.M, Cheng K.J (1974), “Structure and function of the cell envelope of gram – negative bacteria”, Bacteriology Reviews, 38(1), 87-110 18 Czaczyk K, Myszka K (2007), “Biosynthesis of Extracellular Polymeric Substances (EBS) and Its Role in Microbial Biofilm Formation”, Polish Journal of Environmental Studies, 16(6), pp 799-806 19 Cheng K C., Demicri A and Catchmark J M (2010), “Advances in biofilm reactors for production of value – added products”, Applied Microbiology and Biotechnology, 87(2), 445-456 20 Davey M.E, O’Toole G.A (2000), “Microbial biofilm from ecology to moclecular genetics”, Microbioogyl and Molecular Biology Reviews, 64(4), 847-867 21 Dolan R.M (2000), “Role of biofilms in antimicrobial resistance”, American Society for Artifical Iternal Organs Journal, 46(6), pp 47-52 22 Donlan R.M (2002), “Biofilm microbial life on surfaces”, Emerging Infectious Diseases Journal, 8(9), pp 881-890 23 Eriksson E, Auffarth K, Henze M & Ledin A (2002), “Characteristics of grey wasteeater”, Urban Water, 4(1), 85-104 24 Garrett T.R, Bhakoo M, Zhang Z (2008), Rewiew: “Bacterial adhesion and biofilms on surfaces”, Progress in Natural Science, 18(9), pp 1049-1056 25 Gyorik M, Herpai Z, Szecsenyi I, Varga L, Szigeti J (2003), “Rapid and sensitive determination of phenol in honey by high performance liquid chromatography with flu-orescence detection”, Journal of Agricultural Food Chemistry, 51(18), 5222-5225 26 Hijnen W.A.M., Biraud D, Cornelissen E.R., Van der Kooij D (2009), “Threshold concentration of easily organic carbon in feedwater for biofouling of spiral-wound membranes”, Environmental Science and Technology, 43(13), 4890–4895 27 Hirayama K.K, Tobita S and Hirayama K (1991), “Metabolic pathway of phenol in Rhodotorula rubra”, The Journal of General and Applied Microbiology, 37(4), 379-388 28 Huang Z, Zhou W, Zhou C, Han S, Zhang A, Feng F, Liu C, Wang L (2003), “Determination of semivolatile compounds in drinking water by tandem mass spectrometric detection”, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 71(5), 1026-1033 29 Jomeo T (2008), “Bacteria biofilm”, Current topics in Microbiology and Immunology 322, Atlanta – United states of American 30 Kato T, Haruki M, Imanaka T, Morikawa M, Kanaya S (2001), “Isolation and characterization of long-chain-alkane degrading Bacillus thermoleovornas from deep subterranean petroleum reservoirs”, Bioengineering, 91(1), 64-70 Journal of Bioscience and 31 Keck J., Sims R C., Coover M., Park K., Symons B (1989), “Evidence for cooxidation of polynuclear aromatic hydrocarbons in soil”, Water research, 23(12), 1467-1476 32 Kumar C.G & Anand S.K (1998), “Significance of microbial biofilms in food industry: a riview”, International Journal of Food Microbiology, 42, 9-27 33 Lane DJ (1991), “16S-23S rRNA sequencing”, Nucleic acid technique bacterial systematics, 125-175 34 Lazarova V., Manem J (2009), “Innovative biofilm treament technologies for waste treamant”, in Bryers J.D (Editor), Biofilm II: Process Analysis and Application, New York: Wiley – Liss, Press, pp 159-206 35 Le Thi Nhi Cong, Ho Thanh Huyen, Nghiem Ngoc Minh (2012), “Phenol degradation of a biofilm formeg by a mixture of marine bacteria”, VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 28(2S), 75-81 36 Leonard D and Lindley N.D (1998), “Cacbon and energy flux constraints in continuous cultures of alcaligens eutrophus grown on phenol”, Microbiol, Vol.114, 241-248 37 Liu G, Ye Z, Tong K & Zhang Y (2013), “Biotreatment of heavy oil wastewater by combined upflow anaerobic sludge blanket and immobilized bilogical aerated filter in a pilot – scale test”, Biochemical Engineering Journal, 72, 48-53 38 Liu Y J., Kuschk P., Zhang A., Wang X C (2009), “Characterisation of phenol degradation by Acinetobacter sp XA05 and Sphingomonas sp FG03”, Chemistry and Ecology, 25(2), 107-177 39 Mohan J, Prakash R, Behari J.R (2004), “Electrochemical detection and catalytic oxidation of phenolic compounds over nickel complex modified graphite electrode”, Applied Ecology and Environmental Research, 2(2), 25-33 40 Moreira dos Santos CY, de Almeida Azevedo D, Radler de Aquino Neto F (2004), “Atmospheric distribution of urban organic compounds from coal-fired which areas near a power station”, Atmospheric Environment, 38(9), 1247-1257 41 Morikawa M (2006), “Benefical biofilm formation by industrial bacterial Bacillus subtilis and related species”, Journal of Biosience and Biogengineering, 101(1), pp 1-8 42 Moscoso M., Garcia E., Lopez R (2006), “Biofilm formation by Streptococcus pneumoniae: Role of choline, extracellular DNA, and capsular polysaccharide in microbial accretion”, Journal of Bacteriology, 188(22), 7785-7795 43 O’Toole G A., Kolter R (1998), “Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis”, Molecular Microbiology, 28(3), 449 – 461 44 O’Toole G.A, Kaplan H.B., Kolter R (2000), “Biofilm formation as microbial development”, Annual Review of Microbiology, 54, pp 49-79 45 Rodgers M, De Paoar D, Clifford E (2008), “Dairy waste water treatment using a horizontal flow biofilm system”, Journal of Environmental Management, 86(1), 114-120 46 Sleytr U.B (1997), “Basic and applied S – layed research: an overview”, FEMS Micobiology Reviews, 20, pp 5-12 47 Smith H.L, Waltman P (1995), “The Theory of the Chemostat: Dynamics of Microbial Competition”, vol 13 of Canbridge Studies in Mathematical Biology, Cambridge University Press, Campridge, UK, 1995 View at Zentralblatt Math, View at MathSciNet 48 Steyn B (2005), “Proteomic analysis of the biofilm and biofilm – asociated phenotypes of Pseudomanas aeruginosa cultured in batch”, PhD dissertation, The Faculty of Natural and Agricultural Sciences, University of Pretoria, Pretoria 49 Suhaila Y.N, Ariff A.B., Rosfarizan M., Latif I.A., Ahmad S.A., Norazah M.N., Shukor M.Y.A., (2010), “Optimization of Parameters for phenol Degradation by Rhodococcus UKM-P in Shake Flask Culture”, Proceeding of the World Congress on Engineering, 1, 601-604 50 Sunesson A.L, Gullberg J, Blomquist G (2001), “Airborne chemical compounds on dairy farms”, Journal of Environmental Monitoring, 3(2), 210-216 51 Todar K.G (2000), “Nutrition and growth of Bacteria”, Todar’s Online Textbook of Bateriology, pp 52 Zhou J., Bruns M A and Tiedje J M (1996), “DNA Recovery from soils of diverse combosition”, Applied and Environmental Microbiology, Vol62(2), pp 316-322 53 Zhu J, Newhook R, Marro L, Chan C.C (2005), “Selected volatile organic compounds in residential air in the city of Ottawa, Canada”, Environmental Science and Technology, 39(11), 3964-3971 PHỤ LỤC Kết phân tích hàm lượng phenol chủng Rhodococcus sp VTPG5 Kết đăng ký trình tự gen 16S rRNA ngân hàng DDBJ [...]... dung của đề tài  Mục tiêu của đề tài:  Phân lập, tuyển chọn được chủng vi khuẩn vừa có khả năng tạo màng sinh học vừa có khả năng phân hủy phenol cao từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu  Tối ưu hóa các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh học (biofilm) của chủng vi khuẩn được lựa chọn  Nội dung của đề tài  Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn. .. khả năng oxi hóa các hydrocarbon xảy ra nhanh hơn Do đó, hiện nay biofilm đang được ứng dụng rất nhiều trong vi c xử lý nước nhiễm dầu mỏ Vì vậy, để góp phần vào vi c xử lý phenol nói riêng và nước nhiễm dầu mỏ nói chung, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu ... vi khuẩn vừa có khả năng tạo màng sinh học, vừa có khả năng phân hủy phenol tốt  Phân loại và định tên chủng vi khuẩn lựa chọn  Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường: nhiệt độ, pH, nồng độ muối NaCl, ảnh hưởng của nguồn carbon và nguồn nitơ đến khả năng tạo màng sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn 3  Đánh giá khả năng phân hủy phenol của màng sinh học chủng vi khuẩn đó ở các điều kiện... môi trường: nhiệt độ, pH, nồng độ muối NaCl, ảnh hưởng của nguồn carbon và nguồn nitơ đến khả năng tạo màng sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn - Đánh giá khả năng phân hủy phenol của màng sinh học chủng vi khuẩn đó ở các điều kiện tối ưu 22 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.5.1 Thu thập mẫu Lấy mẫu nước ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu Mẫu được lấy ở các vị trí và các độ sâu khác nhau Tại các vị trí... hình nghiên cứu trong nước Trong nước đã có một số công trình nghiên cứu thành công về màng sinh học vi sinh vật phân hủy cơ chất: Ở Vi n Công nghệ sinh học, nhóm nghiên cứu Lê Thị Nhi Công và cộng sự (2012) đã tiến hành tạo màng sinh học đa chủng từ các chủng vi khuẩn: 11- B3, 17B5, 21- N8, 23- N1 và 24- N8 được phân lập từ các vị trí ô nhiễm dầu ven biển Vi t Nam Các tác giả đã đánh giá khả năng phân. .. của đề tài  Ý nghĩa trong khoa học Phân lập được chủng vi khuẩn vừa tạo màng sinh học vừa có khả năng phân hủy phenol cao Đồng thời, tối ưu hóa được các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh học là tiền đề trong vi c nghiên cứu thực hiện ngoài hiện trường sau này  Ý nghĩa trong thực tiễn Phát triển lĩnh vực công nghệ sinh học môi trường với sự thành công trong vi c sử dụng màng sinh. .. năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tạo màng tốt trên nguồn cơ chất phenol - Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt được nuôi qua đêm để làm tươi mới chủng, thu lượng sinh khối đầu vào OD 600 là 0,3 để khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn - Bổ sung dịch sinh khối mỗi chủng vào bình tam giác dung tích 100 ml, có chứa 20 ml khoáng Gost dịch, 0,1% vitamin,... nhiễm độc ở Vi t Nam Như vậy, nghiên cứu về màng sinh học sẽ mở ra khả năng ứng dụng vai trò của các vi sinh vật đối với các hệ sinh thái và môi trường sống của con người 19 PHẦN 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy phenol 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu Quy mô phòng thí nghiệm 3.2 Địa điểm và thời... sự lại tiếp tục nghiên cứu một số yếu tố sinh lý sinh hóa ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học chủng nấm men Trichosporon asahii QN-B1 phân hủy phenol phân lập từ Hạ Long, Quảng Ninh Đặc biệt, chủng nấm men này 18 có khả năng phân hủy phenol tương đối cao (trên 90% với nồng độ ban đầu là 200 ppm) (Lê Thị Nhi Công và cs, 2013) [4] Nhóm nghiên cứu ở trường khoa học tự nhiên - đại học Quốc gia Hà... tên phân loại của một số vi sinh vật 2.1.4.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử Ngày nay, những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới đó là phân loại học phân tử” Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học