BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI HÀ THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TỪ ĐẤT RUỘNG TẠI KHU VỰC XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI HÀ THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TỪ ĐẤT RUỘNG TẠI KHU VỰC XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60 42 01 20 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trình thực hoàn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn cán phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh- KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, tạo điều kiện cho học tập hoàn thành đề tài Tôi xin cảm ơn thầy cô bạn bè động viên, tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài Lời cảm ơn sâu sắc xin dành cho gia đình người thân yêu động viên giúp đỡ Hà Nội, ngày 12 tháng 07 năm 2013 Tác giả Hà Thị Thu Hằng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các kết nghiên cứu, số liệu trình bày luận văn trung thực không trùng với công trình tác giả khác Hà Nội, ngày 12 tháng 07 năm 2013 Tác giả Hà Thị Thu Hằng CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP : Diaminopimelic Acid CFU : Colony Forming Unit CMC : Cacboxyl methyl cellulose DNA : Deoxyribonucleic Acid HSCC : Hệ sợi chất HSKS : Hệ sợi khí sinh ISP : International Streptomyces Project RNA : Ribonucleic Acid rRAN : Riboxom Ribonucleic Acid PG : PeptidoGlycan m : meso MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Điểm đề tài NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vị trí phân loại xạ khuẩn 1.1.1 Vị trí xạ khuẩn hệ thống sinh sinh giới 1.1.2 Phân loại xạ khuẩn 1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 10 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 10 1.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn 11 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa xạ khuẩn 11 1.2.4 Sinh sản xạ khuẩn 13 1.3 Cellulose cellulase 13 1.3.1 Cellulose 13 1.3.2 Cellulase 14 1.3.3 Hệ enzyme phân giải cellulose 15 1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose Việt Nam giới 15 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu vi sinh vật 18 2.1.1.Vi sinh vật 18 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 18 2.2 Môi trường 19 2.2.1 Môi trường phân lập xạ khuẩn 19 2.2.2 Môi trường bảo quản giữ giống 19 2.2.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 20 2.3.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 22 2.3.3 Phương pháp bảo quản chủng giống 22 2.3.4 Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 22 2.3.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá xạ khuẩn 23 2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase xạ khuẩn 23 2.3.7 Phương pháp thống kê xử lý kết 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Sơ lược đặc điểm tự nhiên khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 25 3.2 Phân lập xạ khuẩn từ đất ruộng khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 27 3.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc 27 3.2.2 Đặc điểm hệ sợi 31 3.2.3 Nghiên cứu sắc tố tan chủng xạ khuẩn phân lập 34 3.2.4 Xác định khả sinh cellulase xạ khuẩn 37 3.3 Đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử chủng T5, T9 41 3.4 Ảnh hưởng số yếu tố môi trường đến khả sinh cellulase chủng xạ khuẩn 43 3.4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 43 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH BẢNG Trang Bảng 3.1 Các loại trồng đất ruộng khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 26 Bảng 3.2 Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ruộng khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc ……………………………………………28 Bảng 3.3 Đặc điểm HSKS, HSCC chủng xạ khuẩn nghiên cứu 31 Bảng 3.4 Sự phân bố xạ khuẩn theo nhóm màu 32 Bảng 3.5 Đặc điểm sắc tố tan 18 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 34 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính cellulase môi trường chứa CMC …… 37 Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính cellulase môi trường chứa bột giấy… 38 Bảng 3.8 Hoạt tính cellulase 18 chủng xạ khuẩn phân lập………….39 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nguồn cacbon tự nhiên đến hoạt tính cellulase chủng T5 T9 43 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng hoạt tính cellulase chủng T5 T9 45 HÌNH Trang Hình 2.1 Bản đồ phường Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc 21 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ loại trồng đất ruộng khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 26 Hình 3.2 Khuẩn lạc xạ khuẩn 29 Hình 3.3 Một số chủng xạ khuẩn phân lập 30 Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ chủng xạ khuẩn theo nhóm màu 33 Hình 3.5 Sắc tố tan số chủng xạ khuẩn phân lập 36 Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính cellulase 18 chủng xạ khuẩn phân lập 39 Hình 3.7 Hoạt tính cellulose chủng T5, T9 40 Hình 3.8 Cuống sinh bào tử bào tử chủng T5, T9 42 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn môi trường chứa nguồn cacbon tự nhiên 44 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt tính cellulase chủng T5 T9 45 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trình hình thành tạo độ phì cho đất, chúng tham gia tích cực vào trình chuyển hóa phân giải nhiều chất hữu phức tạp bền vững cellulose, chất mùn, kitin, keratin, lignin… Ngày xạ khuẩn ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp lên men (sản xuất axit hữu lactat, axetat, glutamat…), chế biến tạo sản phẩm enzyme Một số chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme như: cellulase, proteinase, amylase… Hầu hết loài xạ khuẩn thuộc giống Actinomycetes có khả hình thành kháng sinh (Streptomyxin, Oreomyxin…), vitamin nhóm B (B1, B2 B5 B6 B12), chúng ứng dụng công nghiệp dược phẩm, y học…[1] Trong vài thập kỉ trở lại với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nông nghiệp, chăn nuôi, y tế bảo vệ môi trường… Cellulose thành phần chủ yếu tạo nên khung xương tế bào thực vật Trung bình năm ước tính có khoảng 30 tỉ chất hữu xanh tổng hợp trái đất có tới 70% cellulose Hàng năm trái đất phải nhận lượng chất thải khổng lồ (chất thải sinh hoạt, xác thực vật, xác động vật, chất thải công nghiệp,…) Thành phần chủ yếu loại chất thải cellulose Để phân giải lượng lớn cellulose trái đất, khu hệ vi sinh vật đất đóng vai trò quan trọng việc khép kín chu trình chuyển hóa vật chất, đặc biệt chu trình cacbon Cellulase ứng dụng sản xuất thức ăn cho gia súc, xử lý chất thải nông nghiệp, sản xuất loại đường probiotin mà nguyên liệu dùng chủ yếu dùng vi sinh vật sống 36 Hình 3.5 Sắc tố tan số chủng xạ khuẩn phân lập 37 3.2.4 Xác định khả sinh cellulase xạ khuẩn Từ chủng xạ khuẩn phân lập đem thử hoạt tính enzyme cellullase môi trường chứa 1% CMC 1% bột giấy Ta thu kết trình bày bảng 3.6 3.7 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính cellulase môi trường chứa CMC STT Chủng xạ khuẩn Đường kính lỗ Đường kính mật độ Hoạt tính khoan vòng phân giải D (D - d) ±m d (mm) (mm) (mm) T1 10 22 12±0,23 T2 10 25 15±0,35 T3 10 22 12±0,56 T4 10 24 14±0,53 T5 10 38 28±0,98 T6 10 26 16±0,25 T7 10 33 23±0,75 T8 10 23 13±0,45 T9 10 35 25±0,83 10 T10 10 22 11±0,16 11 T11 10 25 15±0,30 12 T12 10 27 17±0,48 13 T13 10 33 23±0,65 14 T14 10 22 12±0,9 15 T15 10 23 13±0,32 16 T16 10 21 11±0,15 17 T17 10 22 12±0,22 18 T18 10 20 10±0,35 38 Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính cellulase môi trường chứa bột giấy STT Chủng xạ khuẩn Đường kính lỗ Đường kính mặt độ Hoạt tính khoan vòng phân giải ( D -d) ±m d ( mm ) D (mm ) ( mm ) T1 10 20 10±0,21 T2 10 17 7±0,11 T3 10 22 12±0,50 T4 10 21 11±0,25 T5 10 30 20±0,81 T6 10 18 8±0,08 T7 10 25 15±0,39 T8 10 22 12±0,31 T9 10 27 17±0,79 10 T10 10 22 12±0,45 11 T11 10 20 10±0,32 12 T12 10 21 11±0,12 13 T13 10 25 15±0,35 14 T14 10 22 12±0,14 15 T15 10 21 11±0,28 16 T16 10 20 10±0,29 17 T17 10 20 10±0,12 18 T18 10 16 6±0,09 39 Bảng 3.8 Hoạt tính cellulase 18 chủng xạ khuẩn phân lập Hoạt tính Số chủng Rất mạnh Mạnh Trung bình Yếu CMC BG CMC BG CMC BG CMC BG Số lượng chủng 0 14 14 Tỷ lệ (%) 0 22.2 5.5 77.8 77.8 16.7 Mức độ hoạt tính: Rất mạnh Mạnh : D - d ≥ 30 mm : 20 mm ≤ D - d ≥ 30 mm Trung bình : 10 mm ≤ D - d