ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THU HOÀI NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THU HOÀI NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Đinh Thúy Hằng GS TS Nguyễn Lân Dũng Hà Nội - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu trình bày luận án trung thực, phần công bố tập san tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý đồng tác giả Phần lại chưa công bố công trình khác Tác giả luận án Nguyễn Thu Hoài LỜI CẢM ƠN Thành công Luận án kết cố gắng nỗ lực thân suốt trình nghiên cứu, tìm hiểu đề tài Đồng thời thân nhận giúp đỡ tạo điều kiện thầy cô hướng dẫn, anh chị bạn đồng nghiệp Trước tiên, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán Phòng Sinh thái Vi sinh vật, Phòng Công nghệ Enzyme - Protein Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ sở vật chất khích lệ trình thực tập Nghiên cứu sinh Với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi cảm ơn tới TS Đinh Thúy Hằng - Trưởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - ĐHQGHN người trực tiếp định hướng nghiên cứu, hướng dẫn bảo tận tình cho suốt trình thực luận án Đồng gửi lời cảm ơn tới GS.TS Nguyễn Lân Dũng - chuyên gia cao cấp Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - người cho nhiều lời khuyên bảo giúp đỡ thời gian nghiên cứu luận án Tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - ĐHQGHN tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp hoàn thành Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Thường vụ Đảng ủy, Ban Tổng Giám đốc Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga tạo điều kiện giúp đỡ khuyến khích, động viên suốt trình làm Nghiên cứu sinh Tôi mong muốn cảm ơn đến Phân viện trưởng bạn đồng nghiệp Phân viện Công nghệ sinh học, Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga nhiệt tình giúp đỡ, động viên, tạo điều kiện thời gian sở vật chất suốt thời gian tham gia làm Nghiên cứu sinh Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Bùi Thị Việt Hà - Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật, thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - ĐHQGHN trực tiếp giảng dạy giúp đỡ khóa học Nghiên cứu sinh Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè người thân ủng hộ, cổ vũ động viên vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015 Nguyễn Thu Hoài MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU 10 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 12 Xử lý chất thải hữu theo công nghệ phân hủy kỵ khí sinh methane điều kiện nhiễm mặn 12 1.1.1 Ô nhiễm chất thải hữu môi trường nhiễm mặn 12 1.1.2 Xử lý ô nhiễm chất hữu phân hủy kỵ khí 14 1.1.3 Xử lý chất thải hữu phân hủy kỵ khí điều kiện nhiễm mặn 18 1.2 Bản chất sinh học phân hủy kỵ khí sinh methane 21 1.3 Đa dạng di truyền đặc tính sinh học VSVSMT 25 1.3.1 Phân bố VSVSMT tự nhiên 25 1.3.2 Vị trí phân loại VSVSMT 26 1.3.3 Đặc tính sinh học VSVSMT 30 1.4 1.3.3.1 Cơ chất trình phân hủy kỵ khí sinh methane 30 1.3.3.2 Sinh hóa trình phân hủy kỵ khí sinh methane 32 1.3.3.3 Một số phương pháp nghiên cứu quần xã VSVSMT 35 1.3.3.4 VSVSMT môi trường nước lợ nước biển 37 Công nghệ xử lý chất thải hữu phân hủy kỵ khí sinh methane 40 1.4.1 Một số công nghệ phổ biến 40 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phân hủy kỵ khí sinh methane 43 1.4.2.1 Cân dinh dưỡng 43 1.4.2.2 Các yếu tố lý hóa sinh học 44 1.5 Nghiên cứu VSVSMT công nghệ phân hủy kỵ khí tạo biogas Việt Nam Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 46 48 48 2.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 48 2.1.2 Hóa chất, môi trường thiết bị 48 2.2 Phương pháp nghiên cứu 49 2.2.1 Làm giàu phân lập VSVSMT 49 2.2.1.1 Làm giàu VSVSMT 49 2.2.1.2 Phân lập VSVSMT 50 2.2.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học VSVSMT 51 2.2.2.1 Quan sát đặc điểm hình thái 51 2.2.2.2 Xác định ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng VSVSMT 51 2.2.3 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường chủng khiết 52 2.2.3.1 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường 52 2.2.3.2 Tách DNA tổng số chủng khiết 53 2.2.3.3 Điện di DNA gel agarose 54 2.2.4 Phương pháp PCR- DGGE 54 2.2.4.1 Khuếch đại đoạn 16S rDNA cho phân tích DGGE 54 2.2.4.2 Điện di biến tính DGGE 55 2.2.4.3 Cắt băng gel 55 2.2.5 Phân tích trình tự 16S rDNA chủng VSVSMT 56 2.2.6 Thiết lập phân tích thư viện gen mcrA(clone library) 57 2.2.6.1 Nhân PCR tinh sản phẩm 57 2.2.6.2 Phản ứng ghép nối gen vào vector 57 2.2.6.3 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt 57 2.2.6.4 Tách dòng giải trình tự gen mcrA 58 2.2.6.5 Phân tích trình tự gen mcrA dựng phân loại 59 2.2.7 Phân tích hóa học 59 2.2.7.1 Phân tích COD hòa tan 59 2.2.7.2 Xác định hàm lượng muối nước 60 2.2.7.3 Xác định tổng thể tích khí sinh trình phân hủy kỵ khí 61 2.2.7.4 Xác định hàm lượng methane mô hình thí nghiệm 61 2.2.7.5 Xác định hoạt tính sinh methane 62 2.2.8 Thiết lập mô hình phân hủy kỵ khí chất thải hữu điều kiện nước lợ nước mặn 63 64 2.3 Sơ đồ mô tả bước thí nghiệm Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Làm giàu VSVSMT từ trầm tích biển Nha Trang Cát Bà 65 65 3.1.1 Làm giàu VSVSMT môi trường nước lợ 65 3.1.2 Làm giàu VSVSMT môi trường nước mặn 67 3.2 VSVSMT chiếm ưu mẫu làm giàu 70 3.2.1 Mẫu làm giàu methanol acetate 70 3.2.2 Mẫu làm giàu rong biển Ulva sp 72 3.2.2.1 Phân tích PCR-DGGE đoạn 16S rDNA 3.2.2.2 Đánh giá VSVSMT mẫu làm giàu rong biển qua thư viện gen mcrA 72 73 3.3 Phân lập VSVSMT từ mẫu làm giàu 78 3.4 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủng VSVSMT phân lập 84 3.4.1 Khả sinh methane chủng VSVSMT phân lập 84 3.4.2 Ảnh hưởng độ mặn tới sinh trưởng hai chủng M7 M37 86 3.4.3 Các đặc điểm sinh học chủng M37 88 3.5 Tạo nguồn VSVSMT để hỗ trợ trình phân hủy kỵ khí điều kiện nước lợ nước mặn 93 3.5.1 Lựa chọn nguồn VSVSMT phù hợp 93 3.5.2 Tạo giống khởi động VSVSMT 95 3.5.3 Bảo quản nguồn VSVSMT điều kiện phòng thí nghiệm 99 3.6.Thiết lập vận hành mô hình kỵ khí xử lý chất thải hữu theo phương pháp phân hủy kỵ khí sinh methane điều kiện nước lợ nước mặn 99 3.6.1 Thiết lập mô hình 99 3.6.2 Vận hành mô hình 101 3.6.3 Đánh giá VSVSMT chiếm ưu mô hình 105 KẾT LUẬN 108 KIẾN NGHỊ 109 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AF Anaerobic Filter Bp Base pair BKM Bùn kỵ khí ưa mặn BSA Bovin serum albumin VSVSMT Vi sinh vật sinh methane CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide COD Chemical oxygen demand DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2’- deoxyribonucleotide 5’- triphosphate EDTA Ethylenediamintetraacetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropylthio - β - D – glucosamine LB Môi trường Luria – Bertani mcrA Đoạn gen mã hóa cho tiểu phần α methyl - coenzyme M reductase MPN Most probable number MQ Mili – Q SDS Sodium dodecyl sunfate TAE Tris – acetate – EDTA TE Tris – EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine PCI Phenol - Chloroform - Isoamyl alcohol PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Realtime PCR UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Đặc điểm chi thuộc VSVSMT 28 2.1 Thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt PCR cho DGGE 55 2.2 PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA để định danh VSVSMT 56 3.1 VSVSMT mẫu làm giàu NTLRE3 rong biển Ulva sp 75 3.2 VSVSMT phân lập từ mẫu làm giàu trầm tích biển Nha Trang Cát Bà 79 3.3 Vị trí phân loại mười chủng VSVSMT phân lập dựa so sánh trình tự đoạn 16S rDNA 82 3.4 Khả sinh khí biogas mức độ phát huỳnh quang tế bào chủng VSVSMT phân lập 85 3.5 Ảnh hưởng nồng độ NaCl tới sinh trưởng hai chủng VSVSMT M7 M37 86 3.6 Nguồn hữu mô hình 101 3.7 Sự biến động COD (mg/L) mô hình nghiên cứu 102 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Một số nguồn chất thải hữu vùng ven biển Việt Nam 13 1.2 Chuyển hóa cacbon hữu phân hủy hiếu khí kỵ khí 14 1.3 Hầm biogas loại nhỏ phổ biến gia đình nông thôn Việt Nam 17 1.4 Các nhóm vi sinh vật tham gia vào trình phân hủy kỵ khí sinh methane 21 1.5 Vi khuẩn acetogen VSVSMT bùn kỵ khí từ bể biogas 24 1.6 Cây phân loại thể vị trí VSVSMT so với ngành cổ khuẩn khác dựa trình tự 16S rRNA 27 1.7 Hình thái tế bào số loài VSVSMT mô tả 29 1.8 Con đường hình thành methane từ acetate, methanol CO2 32 1.9 Sơ đồ mcr-operon VSVSMT Methanosarcina mazei 33 1.10 Hình ảnh VSVSMT kính hiển vi huỳnh quang 34 1.11 Cơ chế tác động chất ức chế oxyanion nhóm VI tới trình khử sulfate vi khuẩn khử sulfate 39 1.12 Bể tự hoại hai ngăn 40 1.13 Sơ đồ bể biogas xử lý chất thải có hàm lượng hữu cao 41 1.14 Cấu tạo nguyên lý hoạt động bể UASB 42 1.15 Cấu tạo nguyên lý hoạt động tầng lọc kỵ khí 42 2.1 Rong biển (Ulva sp.) sử dụng thí nghiệm phân hủy kỵ khí sinh methane 48 2.2 Các bước phân lập chủng khiết VSVSMT phương pháp ống thạch bán lỏng 50 2.3 Nguyên lý phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí sinh từ bể phân hủy kỵ khí 61 2.4 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng methane thiết bị sắc ký khí 62 2.5 Mô hình phân hủy kỵ khí chất hữu sinh methane hệ thống đo tổng lượng khí sinh phương pháp cột nước 63 [...]... Vi t Nam 17 1.4 Các nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy kỵ khí sinh methane 21 1.5 Vi khuẩn acetogen và VSVSMT trong bùn kỵ khí từ bể biogas 24 1.6 Cây phân loại thể hiện vị trí của VSVSMT so với các ngành cổ khuẩn khác dựa trên trình tự 16S rRNA 27 1.7 Hình thái tế bào của một số loài VSVSMT đã được mô tả 29 1.8 Con đường hình thành methane từ acetate, methanol và CO2 32 1.9 Sơ đồ mcr-operon... tới sinh trưởng của hai chủng VSVSMT M7 và M37 86 3.6 Nguồn hữu cơ trong các mô hình 101 3.7 Sự biến động của COD (mg/L) trong các mô hình nghiên cứu 102 6 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Một số nguồn chất thải hữu cơ tại các vùng ven biển Vi t Nam 13 1.2 Chuyển hóa cacbon hữu cơ trong phân hủy hiếu khí và kỵ khí 14 1.3 Hầm biogas loại nhỏ phổ biến ở các gia đình nông thôn Vi t... hiển vi huỳnh quang 34 1.11 Cơ chế tác động của các chất ức chế oxyanion nhóm VI tới quá trình khử sulfate ở vi khuẩn khử sulfate 39 1.12 Bể tự hoại hai ngăn 40 1.13 Sơ đồ bể biogas xử lý chất thải có hàm lượng hữu cơ cao 41 1.14 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của bể UASB 42 1.15 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của tầng lọc kỵ khí 42 2.1 Rong biển (Ulva sp.) sử dụng trong thí nghiệm phân hủy kỵ khí sinh. .. kỵ khí sinh methane 48 2.2 Các bước phân lập chủng thuần khiết VSVSMT bằng phương pháp ống thạch bán lỏng 50 2.3 Nguyên lý của phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí sinh ra từ bể phân hủy kỵ khí 61 2.4 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng methane trên thiết bị sắc ký khí 62 2.5 Mô hình phân hủy kỵ khí chất hữu cơ sinh methane và hệ thống đo tổng lượng khí sinh ra bằng phương pháp cột nước 63 7 ... 2.1 Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE 55 2.2 PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA để định danh VSVSMT 56 3.1 VSVSMT trong mẫu làm giàu NTLRE3 bằng rong biển Ulva sp 75 3.2 VSVSMT phân lập từ các mẫu làm giàu của trầm tích biển Nha Trang và Cát Bà 79 3.3 Vị trí phân loại của mười chủng VSVSMT phân lập dựa trên so sánh trình tự đoạn 16S rDNA 82 3.4 Khả năng sinh khí biogas và mức độ phát huỳnh