Đang tải... (xem toàn văn)
ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH GEN CAST TRÊN HEO RỪNG TÂY NGUYÊN ( Sus crofa ) ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH GEN CAST TRÊN HEO RỪNG TÂY NGUYÊN ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH GEN CAST TRÊN HEO RỪNG TÂY NGUYÊN ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH GEN CAST TRÊN HEO RỪNG TÂY NGUYÊN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC = = = =*** = = = = KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH GEN CAST TRÊN HEO RỪNG TÂY NGUYÊN ( Sus crofa ) TS Nguyễn Văn Hạnh Viện công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hữu Đức Học viện Nông nghiệp Việt Nam Sinh viên thực : Trần Thị Loan Lớp : K58CNSHD Mã sinh viên : 586926 Hà Nội – 09/2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn kết khóa luận trực tiếp thực hiện.Các số liệu kết công bố khóa luận hoàn toàn trung thực, xác chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng Sinh viên năm 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hạnh, phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu, đồng thời tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Đức – Phó trưởng khoa Công nghệ sinh học, Trưởng môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện nông nghiệp Việt Nam bên cạnh, bảo, hướng dẫn, động viên cho lời khuyên quý báu suốt trình hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Việt Linh, ThS Đỗ Trung Kiên, tận tình bảo,luôn theo sát thí nghiệm để đưa lời khuyên bổ ích kịp thời cho từ ngày bước vào phòng thí nghiệm Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam, tận tình bảo cho suốt trình học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến bố, mẹ toàn thể người thân gia đình bạn bè hỗ trợ, động viên, khuyến khích suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên năm 2016 MỤC LỤC 4.1 Kết tách chiết DNA 4.2 Nhân gen CAST xác định đa hình gen CAST 4.2.1 Kết nhân gen CAST 4.2.2 Xác định đa hình gen CAST PCR - RFLP 4.3 Tần số kiểu gen tần số alen 4.4 Mối liên kết suất thịt heo rừng với đa hình gen CAST 4.5 Mối liên kết chất lượng thịt heo rừng với đa hình gen CAST PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 5.2 Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề Heo rừng loài vật nuôi phổ biến nhiều tỉnh thành nước phẩm chất thịt thơm ngon, gần mỡ, cholesteron đặc biệt có da dầy, giòn ngậy.Nhờ nguồn thức ăn tự nhiên nên thịt heo rừng xem loại thực phẩm sạch, thơm ngon bổ dưỡng, đưa vào thực đơn nhà hàng chưa lâu loại thịt đặc sản nhanh chóng người tiêu dùng Việt Nam ưa chuộng, xuất thị trường giới.Phong trào chăn nuôi heo rừng ngày lan rộng giá thịt hấp dẫn nhu cầu tiêu dùng ngày tăng mạnh.Trước nhu cầu thị trường,các tính trạng liên kết với chất lượng thịt: tỷ lệ nạc, độ mềm, màu sắc độ thịt quan tâm nghiên cứu.Với phát triển kỹ thuật đại sinh học, hình thành xu hướng nghiên cứu chọn lọc giống vật nuôi dựa vào thị ADN Chọn lọc giống vật nuôi dựa vào thị ADN, rút ngắn thời gian tăng khả xác hiệu chọn lọc Do vậy, nhiều công trình phân tích đa hình gen giống heo chung heo rừng nói riêng ngày xuất nhiều Nghiên cứu để tìm mối liên kết đa hình gen với tính trạng kinh tế giống heo rừng ( đặc biệt heo rừng Tây Nguyên) quan trọng công tác giống Nhờ thành tựu giải mã gen heo phát triển mạnh mẽ kỹ thuật di truyền phân tử, có nhiều thị di truyền phân tử liên quan đến tính trạng có ý nghĩa kinh tế heo tốc độ sinh trưởng, chất lượng thịt, tỷ lệ nạc, khả sinh sản, chống chịu bệnh…đã xác định Cho đến nay, có nhiều gen ảnh hưởng đến chất lượng thịt xác định như: CAST, MYF5, RYR1 … Nhưng theo Brym Kaminski (2006) có bốn gen ảnh hưởng mạnh là: RYR1, PRKAG3, CAST IGF2 Gen calpastatin (CAST) gen có vai trò quan trọng đa dạng di truyền ảnh hưởng đến chất lượng thịt độ mềm, độ rỉ dịch, hương vị Ở heo, CAST nằm nhiễm sắc thể (2q2.1- 2q2.4) (Ernst et al., 1998) Kết nghiên cứu Rybarczyk et al (2008) cho thấy đa hình gen CAST/HinfI có ảnh hưởng đến chất lượng thịt heo, cụ thể kiểu gen AB có ảnh hưởng đến thịt đùi, bắp thịt, kiểu gen BB AA ảnh hưởng đến thịt thăn Bên cạnh đó, nhà khoa học giới có nhiều nghiên cứu đa hình đánh giá tần số kiểu gen CAST số giống heo (Meishan, Landrace, Yorkshire, Duroc, Pietrain, Hampshire tổ hợp lai thương phẩm chúng) cho thấy đa hình có ảnh hưởng đến chất lượng thịt.Chính vậy,chúng tiến hành xác định tính đa hình số gen liên quan đến chất lượng thịt heo rừng , góp phần phát triển thị di truyền phân tử phục vụ cho công tác chọn giống thông qua việc nghiên cứu “ Phân tích đa hình gen CAST heo rừng Tây Nguyên’’ - 1.2 Mục tiêu Sàng lọc số điểm đa hình nucleotide (SNPs) gen CAST giống heo Tây Nguyên nghiên cứu - - Tìm mối tương quan SNPs đặc trưng gen CAST ảnh hưởng đến số tăng trọng chất lượng thịt heo rừng Tây Nguyên 1.3 Nội dung nghiên cứu Thu thập 34 mẫu lợn rừng Tây Nguyên: 18 mẫu lợn đực 16 mẫu lợn Tách chiết DNA từ mẫu tai heo rừng Tây Nguyên Đánh giá đa hình kiểu gen CAST Phân tích mối tương quan SNPs đặc trưng liên kết với tính trạng tăng trọng chất lượng thịt heo rừng Tây Nguyên Thu thập hình ảnh, phân tích kết viết báo cáo PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc đặc điểm sinh học heo rừng 2.1.1 Nguồn gốc Heo rừng thuộc giới động vật (Animalia), ngành dây sống (Chordata), phân ngành có xương sống(Vertebrata), nhóm động vật có hàm (Gnathosomata), lớp có vú (Mamalia), phân lớp thú cao hay thú có (Eutheria), guốc chẵn (Artiodactyla), họ heo (Sus), loài heo rừng (Sus Scrofa) Theo tài liệu trường Đại học University of Michichan Museum of Zoology (2006), heo rừng có tên khoa học Sus scrofa Heo rừng bắt nguồn từ Châu Âu, Châu Á Bắc Phi.Tuy nhiên theo chân người, có mặt nhiều nơi giói Sống chủ yếu vùng núi, ẩm ướt Heo rừng giống heo hoang dã hóa, chia thành hai nhóm giống: nhóm giống mặt dài nhóm giống mặt ngắn Heo rừng hay gọi lợn lòi, coi tổ tiên heo nhà 2.1.2 Đặc điểm ngoại hình Heo rừng có thân hình cân đối, nhanh nhẹn, di chuyển linh hoạt, gầy, dài đòn, lưng thẳng, bụng thon, chân dài, nhỏ móng nhọn, cổ dài, đầu nhỏ, mõm dài nhọn, tai nhỏ vểnh thính, mũi thính khỏe, gốc chân lông có ngọn, lông mọc theo sống lưng cổ dày Phần vai trước thường cao chân sau làm cho hình dạng heo rừng vai cao mông thấp Mông, bụng gọn, đuôi dài không cong uốn lại heo nhà ve vẩy Hai vai bên chân phía trước có u mỡ sụn lồi thành chai cứng Độ lớn dày u chai cứng mỡ sụn tăng theo tuổi (3 - cm) Mặt heo rừng dài, mõm nhọn, tai nhỏ dựng đứng ép sát đầu Mắt to, lồi, màu đen, híp phần cuối đuôi mắt, tia nhìn tợn Mũi heo rừng mềm mạnh khỏe phù hợp với phương thức kiếm ăn sống hoang dã chúng đào bới đất, dũi mô đất để đào củ, gốc cây, côn trùng Răng nanh đặc điểm bật heo rừng Răng nanh mọc dài khỏi mõm lợn - năm tuổi Heo rừng có nanh dài, bên mọc cái, mọc 1/4 hàm Heo rừng động vật ăn tạp nên đặc điểm nanh phát triển đặc biệt heo rừng giống động vật nuôi sữa khác không phát triển hệ thống răng, heo rừng có 44 Răng cửa phía hàm dài, hẹp chìa thẳng phía trước để làm nhiệm vụ xẻng Răng hàm trong, cấm mọc có cỡ lớn với hàm thứ thứ cộng lại Cấu tạo xương mặt xương hộp sọ làm heo rừng có hàm mõm dài, phần thường chiếm 75% đầu lâu sọ.Trên sống lưng heo rừng từ trán sát đuôi có mào lông (bờm), sợi lông dài khoảng - 15 cm.Riêng heo rừng tháng có lông sọc dưa đẹp tạo đường vằn màu nâu vàng lẫn trắng chạy dài theo thân màu nâu nhạt đỏ nhạt chạy lông đen tùy giống Bộ lông giúp lợn ngụy trang để giấu đánh lạc hướng kẻ thù môi trường tranh tối tranh sáng rừng.Trong khoảng - tháng, sọc dưa nhạt màu dần năm tuổi, chúng có lông thức mang màu đặc trưng giống ổn định chết 2.1.3 Khả sinh trưởng sinh sản giống heo rừng Chúng thường đẻ năm lứa, lứa từ – 12 Heo sơ sinh có trọng lượng 0,5 – 0,9kg/con Heo rừng – tháng tuổi trọng 30 – 50kg Có chu kỳ động dục 21 ngày, động dục ngày liên tục, thời gian chửa 115 ngày (100-140) ngày Số đẻ lứa đến 12 con, trung bình đến Tuổi thành thục sinh dục 8-10 tháng tuổi, thường đẻ lần sau 18 tháng tuổi đẻ đến năm Cho bú đến 3-4 tháng Có tuổi thọ đến 27 năm Sống thành đàn có đến 100 thường 20 con.Chúng có điểm đa hình đặc trưng, phân biệt với heo rừng nước có mối quan hệ di truyền gần gũi với heo rừng châu Á, nhiên hoàn toàn khác biệt với heo rừng lai Thái Lan mặt di truyền Các đặc điểm khả sinh sản: - Tuổi động dục lần đầu: - tháng tuổi - Trọng lượng động dục lần đầu: 18 - 20 kg - Tuổi phối giống: - tháng tuổi - Trọng lượng lúc phối: 30 - 35 kg - Thời gian mang thai: 110 - 130 ngày - Thời gian động dục: - ngày (đối với nái tơ) - ngày (đối với nái rạ) - Chu kỳ động dục: 20 - 22 ngày - Hệ số đẻ: 1,2 - 1,3 lứa/năm - Số lứa: - 2.2 Chất lượng thịt giống heo rừng Tây Nguyên Thịt heo rừng vốn xem đặc sản, nhiều người ưa chuộng thịt heo rừng săn nhờ vận động liên tục, heo rừng hấp thụ chất bổ dưỡng từ nguồn thức ăn cỏ tự nhiên nên thịt heo rừng nhiều nạc, mỡ, da giòn Thịt heo rừng chắc, thịt, thơm, hàm lượng cholesteron thấp, ưa chuộng Hiện thịt heo rừng thuộc loại đặc sản, thị trường có nhu cầu tiêu thụ nhiều, giá bán cao Thịt heo rừng chứa 17% protein, 0,5% lipid, có vị ngọt, tính bình, không độc, có tác dụng tư bổ, nhuận da, trị hư nhược, trừ kinh giản, cầm máu, chữa sốt rét, động kinh, băng huyết, kiết lỵ máu Thịt heo rừng giúp ta bù đắp loại vitamin mà rau củ trái có ít.Chẳng hạn vitamin B1, B2, B6, B12, A D Vitamin B1 có vai trò chất xúc tác trình chuyển hóa chất thành lượng, tăng cường hoạt động não bộ, giúp thể chống lại mệt mỏi, suy nhược.Lượng vitamin B1 thịt lợn rừng cao gấp đến 10 lần so với loại thịt khác.Vitamin B2 có tác dụng đào thải độc tố tốt cho da.Nếu thiếu loại vitamin có nguy cao mắc phải bệnh viêm da, phụ nữ.Trong thịt nạc heo rừng có chứa nhiều vitamin nhóm B tương đối cao Nhóm Vitamin B giúp thúc đẩy chuyển hóa Carb, Fat, Protein thành Glucose dành cho hoạt động bắp Vitamin A lại có vai trò giúp cho đôi mắt sáng khỏe, tăng cường sức đề kháng cho thể Còn vitamin D giữ vai trò quan trong việc hấp thu canxi cho xương khỏe 2.3 Năng suất phẩm chất thịt heo 2.3.1 Các tiêu đánh giá suất thịt Tỷ lệ thịt xẻ heo cao khoảng 70% so với bò 55% dê cừu 50% Tỷ lệ phần thịt có giá trị cao (thăn, đùi sau) chiếm gần 50% so với thịt xẻ Hàm lượng protein có thịt heo khoảng 20% Và phẩm chất thịt heo tốt có màu hồng, mịn, đàn hồi, thịt không bị tái màu, rỉ dịch có vị chua Đánh giá suất quày thịt để xác định đặc điểm giống heo giai đoạn nuôi thịt, vỗ béo.Ngoài ra, đánh giá tiêu phần ăn, chế độ kích thích sinh trưởng khác (Lê Thị Mến, 2010) Năng suất chăn nuôi heo thịt tiêu quan trọng, ảnh hưởng đến hiệu kinh tế chăn nuôi heo Đặc biệt kinh tế thị trường yếu tố suất liên quan trực tiếp đến thành công hay thất bại sở chăn nuôi Một số tiêu thường dùng đánh giá suất chăn nuôi heo sau: khối lượng (khối lượng heo trước giết mổ sau cho nhịn ăn 24 giờ), khối lượng móc hàm (khối lượng sau chọc tiết, cạo lông, lấy hết quan nội tạng), tỷ lệ móc hàm, khối lượng thịt xẻ (từ khối lượng móc hàm, cắt đầu, chân bóc mỡ bụng), tỷ lệ thịt xẻ, độ dày mỡ lưng, độ dài thăn thịt, diện tích thăn (Nguyễn Thiện Võ Trọng Hốt, 2007) 2.3.2 Các tiêu đánh giá phẩm chất thịt Đánh giá chất lượng thịt phần quan trọng để xác định thành công chăn nuôi heo Thông qua trình đánh giá chất lượng thịt, nhà chăn nuôi đánh giá hiệu chọn lọc giống quản lý (Hội Đồng Hạt Cốc Chăn Nuôi Mỹ, 1996) Chất lượng thịt thường số yếu tố cấu thành như: màu sắc, độ chắc, độ đóng vân mỡ, tính giữ dịch chất hình thái bên Đối với người tiêu dùng để lựa chọn thịt tốt họ thường hay dựa vào màu sắc, độ mềm, tính chất giữ dịch mùi sản phẩm sau nấu (Nguyễn Ngọc Tuân Trần Thị Dân, 2000) Màu sắc Theo hệ thống phân loại thịt thông thường có ba nhóm: PSE (pale, solf exudative): thịt có màu tái, mềm rỉ dịch (pH < 5,3) RFN (normal): thịt có màu đỏ hồng, đàn hồi dịch dính tay (pH 5,4-5,7) DFD (dark, firm and dry): thịt sậm màu, cứng khô (pH > 6) Thịt tươi có màu đỏ tươi màu hồng đỏ thẩm Màu đỏ hàm lượng sắc tố (myoglobin), loại protein hòa tan nhục chất Sắc tố nơi dự trữ oxy dành cho hoạt động tế bào Hàm lượng sắc tố thay đổi tùy theo giống heo, tuổi, vận động bắp vị trí thể học Những bắp hoạt động nhiều máu cung cấp lớn đòi hỏi oxy nhiều nên bắp sậm màu Các bắp chạy dọc theo sống lưng (thịt thăn), vùng đùi có bán màng, bán gân, nhị đầu đùi thường nhạt màu bắp khác Phân loại thịt dựa vào cách cho điểm màu sắc, thể chất mô lúc 24 sau hạ thịt bảo quản lạnh đề nghị sau: tái nhạt (P), đỏ (R) sẫm (D) Màu sẫm tăng số lượng chất tạo màu thức ăn, va chạm trước giết mổ, thiếu diện tích tiếp xúc với oxy diện tích thoát nước, sản sinh tối thiểu acid lactic trình làm lạnh Màu hồng xám nhạt gây chuyển hóa nhanh glycogen thành acid lactic sau giết mổ Thịt màu sẫm có thời gian tươi ngắn thiếu acid tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển (Hội Đồng Hạt Cốc Chăn Nuôi Mỹ, 1996) Độ vân mỡ Vân mỡ có quan hệ mật thiết với giá trị dinh dưỡng phẩm chất thịt heo, miếng thịt có mỡ nạc xen lẫn vào hấp dẫn hơn, thơm ngon hơn, có giá trị dinh dưỡng cao Độ vân mỡ tích mỡ bó sợi thịt nạc mà ta nhìn thấy Sự đóng vân mỡ cho thịt ngon sau nấu chín Nếu vân mỡ thiếu vân mỡ thịt không ngon mong muốn Trái lại, nhiều vân mỡ không làm cho thịt ngon dễ bị ngán ăn, người tiêu thụ không ưa thích Thường tổng số acid béo không no thịt nạc cao mỡ da Cơ thể người không tổng hợp acid béo thiết yếu không no (acid linoleic acid linolenic) Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipid từ 2,5-3,5% cần thiết cho bữa ăn có chất lượng cho người.(Nguyễn Thiện Võ Trọng Hốt, 2007) Độ mềm tính giữ dịch chất Độ rỉ dịch quan trọng ảnh hưởng đến trình chế biến, tồn trữ phân phối cho người buôn bán lẻ Độ mềm tính giữ dịch chất có liên quan đến kết cấu mô học sinh hóa thịt Đặc tính protein thịt dễ bị biến tính nhiệt độ cao, độ acid (pH thấp) nồng độ muối Khi độ pH giảm dẫn đến làm siết chặt chuỗi polypeptide từ làm cho độ rỉ dịch thịt giảm Thịt tái màu độ rỉ dịch cao , ngược lại thịt sậm màu độ rỉ dịch thấp (pH >6) Như vậy, độ rỉ dịch thịt liên quan chặt chẽ với độ pH (Nguyễn Thiện Võ Trọng Hốt, 2007) Acid lactic sản phẩm thủy phân glycogen điều kiện kỵ khí, làm cho pH thịt giảm dần sau hạ thịt phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng dự trữ glycogen bắp Thú khỏe mạnh, nuôi dưỡng tốt, nghỉ ngơi đầy đủ, không bị stress trước giết mổ pH bắp giảm dần từ khoảng 7,2-7,0 xuống 5,6-5,4 Tốc độ sản sinh acid tăng nhanh heo bị stress, sốt trước hạ thịt bị kích động trước hạ thịt, dẫn đến tình trạng PSE thịt Trái lại, thú bị kiệt sức, lượng dự trữ thấp stress nhịn ăn 16 trước hạ thịt pH cuối đạt 6,3, hậu thịt bị DFD Sau ki nấu chín thịt PSE trở nên dai, nhạt nhẽo có vị chua Thịt DFD giữ chất dịch tốt khô cứng Hai loại thịt không hấp dẫn người tiêu dùng Người tiêu dùng không thích chọn quày thịt PSE hay DFD khó chế biến, không ngon dễ bị hư hỏng vi sinh vật Do nên tối đa hạn chế việc gây stress cho heo lúc vận chuyển giết mổ, hạ thịt cách hạ nhanh nhiệt độ thân thịt sau giết mổ (Nguyễn Ngọc Tuân Trần Thị Dân, 2000) Độ pH thịt Độ pH thịt thường đo sau giết mổ khoảng sau giữ lạnh 24 Thông thường pH giảm mạnh từ sau giết mổ đến 45 phút, sau giảm chậm dần, tùy quày thịt mà pH khác sau 24 Nếu thịt có độ pH giảm chậm sau giết mổ đạt mức 6,2 thường loại thịt DFD, tức loại thịt có màu đậm, khô Nếu sau giết mổ pH giảm cực nhanh 45 phút đến mức từ 5,0 đến 5,3 kéo theo nhiệt độ thịt tăng lên đến 42-43°C, độ pH tăng lên đạt 5,4-6,0 vào lúc 24 thịt PSE, tức thịt có màu nhạt, mềm rỉ dịch Nếu sau giết mổ độ pH giảm đạt khoảng 6,2 45 phút, sau đạt mức 5,8-5,9 vào lúc 24 thịt bình thường (Nguyễn Thiện Võ Trọng Hốt, 2007).Ngoài ra, đánh giá chất lượng thịt heo vào thành phần thịt: vật chất khô, protein, lipid số iod Heo đạt tỷ lệ thịt cao phẩm chất thịt tốt 100 g thịt nạc có khảng 18 tới 21 g protein 126,8 kcal lượng Nếu sử dụng thức ăn có nhiều lipid cho mỡ heo có số iod gần giống thức ăn Qua nhiều thí nghiệm người ta kết luận acid béo heo ăn vào thể hình thành nên mỡ thể, mỡ thể có tính chất tương tự tính chất lipid thức ăn (Nguyễn Ngọc Tuân Trần Thị Dân, 2000) 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến suất phẩm chất thịt Dinh dưỡng: yếu tố quan trọng yếu tố ngoại cảnh chi phối đến sinh trưởng khả cho thịt heo Lượng thức ăn cho ăn thành phần dinh dưỡng thức ăn ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ tăng trọng heo Mức cho ăn cao làm tăng tốc độ sinh trưởng chất lượng thịt xẻ heo đạt khối lượng 90 kg (Nguyễn Thiện Võ Trọng Hốt, 2007) Năng lượng protein yếu tố quan trọng giúp cho việc điều khiển tốc độ tăng trọng, tỷ lệ nạc tiêu tốn thức ăn heo thịt Thức ăn có mức độ dinh dưỡng khác ảnh hưởng đến phẩm chất thịt Các phần có mức lượng cao mức protein thấp heo tích lũy mỡ nhiều so với phần có mức lượng thấp, hàm lượng protein cao Bổ sung acid amin cần thiết vào phần lysine tăng trọng cao, tỷ lệ nạc cao, giảm lượng mỡ thân thịt, tăng diện tích dài lưng tiết kiệm lượng protein ăn vào Môi trường xung quanh: nhiệt độ ẩm độ ảnh hưởng chủ yếu đến suất thịt Ở nhiệt độ cao ẩm độ cao thể phải tăng cường trình tỏa nhiệt thông qua hô hấp để cân nhiệt Ngoài nhiệt độ cao làm cho heo thu nhận thức ăn giảm, ảnh hưởng đến khả chuyển hóa thức ăn Nhiệt độ thấp ảnh hưởng đến tăng trọng tăng cường trình trao đổi chất heo Các nhân tố stress ảnh hưởng đến trao đổi chất sức sản xuất heo nhiệt độ chuồng nuôi, tiểu khí hậu, cho ăn không theo phần, cân gia súc…(Nguyễn Thiện Võ Trọng Hốt, 2007) Sức khỏe khối lượng ban đầu: sức khỏe khối lượng cai sữa ảnh hưởng chủ yếu đến suất Khối lượng cai sữa có ảnh hưởng đến khối lượng xuất chuồng Có mối tương quan dương chặt chẽ khối lượng bắt đầu nuôi khối lượng giết thịt làm số chọn lọc (Nguyễn Thiện Võ Trọng Hốt, 2007) Phái tính: theo Nguyễn Thiện (2009), thú thiến có suy giảm trao đổi chất thú đực thú cái, ảnh hưởng biểu rõ thú đực Nguyên nhân kích thích tố sinh dục làm tăng trao đổi chất thú đực thú Các tiêu suất phẩm chất thịt heo đực, heo đực thiến heo khác Heo đực không thiến có mùi đặc trưng đực, mức độ mùi phụ thuộc vào tuổi giết thịt, tốc độ tăng trưởng, mức độ thành thục sinh dục mùi có ảnh hưởng không tốt đến chất lượng thịt Con đực ngoại thường có tốc độ tăng trọng cao, hệ số chuyển hóa phần độ dày mỡ lưng thấp đực thiến Tuy nhiên heo đực nội có thời gian thành thục tính sớm Tuổi: tuổi giết thịt heo có ảnh hưởng đến suất phẩm chất thịt Nếu giết thịt sớm suất thấp giai đoan tăng trọng chưa cao Nhưng nuôi kéo dài mức tiêu tốn thức ăn cho kg tăng trọng cao Khi tuổi tăng, mỡ cơ, nitơ protein tăng lên Tuổi giết thịt từ năm đến tám tháng tùy theo giống, chế độ dinh dưỡng, giá thị trường Di truyền: tính trạng kinh tế suất thịt, phẩm chất thịt, sức kháng bệnh tự nhiên…thường kiểm soát nhiều gen Đến có khoảng vài ngàn gen ảnh hưởng đến suất phẩm chất thịt nghiên cứu đánh giá Di truyền: tính trạng kinh tế suất thịt, phẩm chất thịt, sức kháng bệnh tự nhiên…thường kiểm soát nhiều gen Đến có khoảng vài ngàn gen ảnh hưởng đến suất phẩm chất thịt nghiên cứu đánh giá (Nguyễn Thiện Võ Trọng Hốt, 2007) 2.4 Gen Calpastatin 2.4.1 Sơ lược gen Calpastatin Tên calpastatin (CAST) lần đề xuất cho protein đặc hiệu ức chế calpains vào năm 1979 Takashi Murachi Calpastatin có mặt mô động vật có xương sống, gen Drosophila (ruồi giấm), C elegans, nấm Saccharomyces cerevisiae không chứa chuỗi calpastatin (Goll et al., 2004) CAST chất nội sinh đặc hiệu tác động ức chế cysteine protease kích hoạt canxi calpains tế bào động vật Nó quy định tốc độ mức độ mềm thịt sau chết Các hoạt động calpastatin có liên quan chặt chẽ với tốc độ tăng trưởng tỷ lệ trao đổi chất, phân giải protein độ dai thịt (Goll et al., 2004) Ở heo gen CAST xác định nằm nhiễm sắc thể (2q2.1-2q2.4) (Ernst et al., 1998) Nhân trình tự cho thấy CAST polypeptide ức chế đa đầu (Takano et al, 2004) 2.4.2 Một số nghiên cứu ảnh hưởng đa hình gen CAST suất, chất lượng thịt giới Nghiên cứu Krzecioa et al (2008) ảnh hưởng kiểu gen CAST/RsaI thân thịt chất lượng thịt heo Landrace x Yorkshire, Landrace x Duroc, (Landrace x Yorkshire) x Duroc, (Landrace x Yorkshire) x (Duroc x Pietrain) Kết cho thấy có ba kiểu gen xác định CAST/RsaI AA, AB, BB Kiểu gen BB cho trọng lượng thịt cao vai, lưng Nhưng độ dài than ngắn 2,04 cm so với có kiểu gen AA Kiểu gen BB cho trọng lượng cao thịt thăn đồng thời dài thịt thăn ngắn nhất.Nghiên cứu Rybarczyk et al (2008) đa hình CAST/HinfI CAST/Hpy188I đến chất lượng thịt heo heo lai Germa Landrace x German Lagre White Leicoma x German Lagre White Kết xác định CAST/HinfI có ba kiểu gen AA, AB, BB với tần số alen A 0,04, alen B 0,96 CAST/Hpy188I có ba kiểu gen AA, AB, BB với tần số alen A 0,78, alen B 0,22 Kiểu gen AB có ảnh hưởng đến thịt đùi, bắp thịt, kiểu gen BB AA ảnh hưởng đến thịt thăn Thịt heo kiểu gen AB có pH 24 pH 48 cao hơn, rỉ dịch hơn.Thịt có kiểu BB sắc vàng nhiều hơn, màu đỏ nhiều so với thịt heo có kiểu gen AB Theo Wang et al (2007), nghiên cứu đa hình gen CAST giống heo Meishan năm giống heo khác (Sutai, Yorkshire × Sutai, Landrace × Sutai, Duroc × Landrace x Yorkshire, PIC lai) Trung Quốc Kết có ba kiểu gen xác định Kiểu gen AA thể ba băng 963 bp, 806 bp 222bp; kiểu gen AB bị cắt cho bốn băng 1028 bp, 963 bp, 806 bp 222 bp kiểu gen BB cho hai băng 1028 bp bp 963 Chỉ có kiểu gen DD/CAST/HinfI kiểu gen FF CAST/MspI tìm thấy Meishan Kiểu gen FF CAST/MspI thịt có béo, mỡ lưng mỏng hơn, thịt ngon so với hai kiểu gen khác Ở Meishan FF có chất lượng thịt tốt Các giống Sutai phát triển từ giống Duroc (50%) Mi Sơn (50%) Sutai có tần số FF thấp Nghiên cứu Kłosowska et al (2008) giống heo Pietrain x (Large White Ba Lan x Landrace Ba Lan), Large White Hà Lan x Landrace Kết xác định ba kiểu gen EE, EF, FF Những cá thể có kiểu gen EE CAST nhận thấy diện tích thăn nhỏ khác có kiểu gen EF FF Đồng thời kiểu gen FF sợi bó nhiều so với có kiểu gen EE, EF.Theo nghiên cứu Kocwin et al (2002) ảnh hưởng CAST đến chất lượng thịt heo (Large White Ba Lan x Landrace Ba Lan) x (Hampshire x Pietrain).Kết xác định kiểu gen AA, AB BB CAST/RsaI, kiểu gen BB CAST/RsaI cho giá trị pH45 = 6,39 có giá trị L*= 47,73 Kiểu gen AB CAST cho pH = 6,12 Kiểu gen AA thể giá trị pH45 = 6,40 cao Đa hình CAST/RsaI có ảnh hưởng đến giá trị pH45 thăn 2.5 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) PCR chữ viết tắt cụm từ Polymerase Chain Reaction Đây kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân đoạn ADN mong muốn từ hệ gen AND thể sinh vật thành nhiều sao, kỹ thuật nhà khoa học người Mỹ - Kary Mullis cộng phát minh năm 1985 giới thiệu lần Hội thảo lần thứ 51 Cold Spring Harbor vào năm 1986 ông nhận giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993 Kể từ tạo nên tác động to lớn nghiên cứu sinh học toàn giới Nguyên lý: Kỹ thuật tổng hợp ADN thể tuân thủ nguyên tắc chép ADN thể có khác biệt: Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzym helicase - Kết hợp với enzym ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp ADN môi trường thích hợp - Hệ thống điều nhiệt thích hợp với đoạn mồi thiết kế chuyên biệt, chủ động Điều kiện phản ứng PCR: Theo Nguyễn Hoàng Lộc et al (2007), để thử nghiệm PCR chạy được, cần phải có đầy đủ thành phần sau đây: Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt … Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (Mg2+): nồng độ Mg2+ ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính ADN khuôn mẫu, trình ủ primer, tính đặc hiệu phản ứng PCR, hoạt động Taq polymerase độ xác kết Thành phần dung dịch đệm phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại emzym polymerase sử dụng PCR, thường chứa muối đệm HCl 10mM, KCl 50mM MgCl2 1,5 mM dNTP (deoxy nucleoside triphotphat) đơn vị để tổng hợp ADN đích dNTP có cấu tạo gồm đường deoxyribose có gắn base, pH = 7, nồng độ thường dùng 10 mM (2,5mM loại) bảo quản -20°C Bốn loại dNTP sử dụng cần có nồng độ tương đương gồm: Adenin (dATP),Thyamin (dTAP), Cytosine (dCTP), Guanine (dGTP) Mồi (primer) đoạn ADN sợi đơn ngắn cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp ADN Chúng nhận phần ADN nhân lên, bắt cặp bổ sung với đầu ADN mẫu tạo vị trí bắt đầu tái Các mồi có chiều ngược nhau, bao gồm mồi xuôi (forwark primer) mồi ngược (reverse primer) Enzym ADN polymerase (Taq pol) enzym xúc tác cho trình lắp ráp nucleotit A, T, G, C vào mạch ADN tổng hợp, nồng độ Taq pol thích hợp từ 1-2,5 unit cho 100μl dung dịch phản ứng Thông thường sử dụng 0.5 đơn vị/25μl ADN mẫu (ADN template) mẫu ADN mà sử dụng để khuếch đại Có thể ADN kép, đơn ARN tách từ đối tượng nghiên cứu ADN khuôn có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất Chu kỳ nhiệt: Có giai đoạn phản ứng PCR chúng lặp lặp lại nhiều lần (thường từ 25 đến 75 chu kỳ) + Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi ADN từ sợi đôi tách thành sợi đơn Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi ADN Bước gọi biến tính, nhiệt độ tăng lên phá vỡ cầu nối hydrogen chuỗi ADN + Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung Sau sợi ADN tách ra, nhiệt độ hạ xuống để mồi gắn vào sợi AND đơn + Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi ADN giống chuỗi ADN gốc ADN polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào hoạt động dọc theo sợi DNA 2.6 Điện di agarose Theo Phạm Hồng Sơn (2006), phương pháp điện di gel (keo) thường sử dụng để phân ly (phân đoạn) ADN, ARN, Oligonucleotit, protein Thông thường sử dụng gel agarose phân li acid nucleic lớn kb Nguyên lí việc điện di ADN điện trường, tích điện âm nên phân tử ADN dịch chuyển phía anode với tốc độ dịch chuyển chúng khác phụ thuộc vào khối lượng phân tử Các đoạn ADN lớn dịch chuyển chậm Kết từ điểm chung (giếng tải mẫu) đoạn ADN khác dịch chuyển hướng tạo thành (lane), có đoạn ADN khác phân bố vị trí (các băng-band) khác tương ứng với độ lớn chúng Quy trình thực theo Kirkpatrick (1990): - Chuẩn bị gel agarose, đệm điện di TAE 1X Cân 1g bột agarose hòa tan vào 100ml dung dịch đệm TAE 1X (gel agarose 1%) Đun sôi dung dịch agarose tan hoàn toàn, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 50 - 60°C Cài lược để tạo giếng nhỏ, đổ gel vào khuôn Để gel đông ổn định hoàn toàn 30 phút Tháo lược khỏi khuôn đặt gel vào bể điện di, bổ sung đệm TAE 1X tới ngập gel Đệm có vai trò cung cấp ion đảm bảo điện trường trình điện di - Tra mẫu điện di Tùy thuộc vào mục đích điện di khác mà ta sử dụng nồng độ DNA cao thấp Mẫu DNA trộn với loading dye 6X với tỷ lệ mẫu : loading dye 5:1 (chất vừa có tác dụng tạo màu để quan sát vừa có tác dụng gắn DNA vào để DNA lắng xuống đáy giếng) Tra mẫu vào giếng gel Điện di cường độ dòng điện chiều với hiệu điện 70V khoảng 40 phút đến quan sát thấy băng màu chạy 2/3 gel dừng lại - Nhuộm DNA EtBr.Bản gel gỡ nhuộm với dung dịch ethidium bromide 0,5 µg/ml khoảng 10 phút lấy gel rửa lại nước - Quan sát chụp ảnh Bản gel đặt ánh sáng tia tử ngoại (bước sóng 302 nm), chụp ảnh kiểm tra kết điện di 2.7 Kỹ thuật PCR-RFLP Kỹ thuật RFLP( Restriction Fragment Length Polymorphism) kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài phân đoạn ADN dựa điểm cắt enzym giới hạn (Restriction Enzyme, RE) Sản phẩm PCR cắt enzyme giớn hạn, tạo đoạn ADN có chiều dài khác phân tích kỹ thuật phân đoạn kích thước, thường dùng sử dụng điện di gel agarose (Phạm Hồng Sơn, 2006) Sự sai khác kích thước đoạn cắt thu cắt ADN nhân hay quan tử hay toàn thể enzym giới hạn gọi “sự đa hình chiều dài đoạn giới hạn”.Các đoạn cắt ADN (với loại enzym) với kích thước hay chiều dài khác dùng dấu hiệu di truyền để xem xét tính đa hình kiểu hình kiểu gen (ADN) Kỹ thuật PCR- RFLP tiến hành theo bước: Tách chiết tinh DNA Khuếch đại DNA cần nghiên cứu phương pháp PCR Sản phẩm PCR cắt enzyme giới hạn Điện di gel agarose đọc kết PHẦN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu Hóa chất Một số hóa chất dùng trình tách ADN như: Proteinase K, phenol chloroform đệm 1x SSC, Isopropanol, Ethanol, đệm TE , dung dịch 100% 80% Ethanol, - Một số hóa chất dùng phản ứng PCR như: Bufer, dNTP, MgCl2, Taq polymerase, nước cất hai lần, Agarose, đệm TAE, loading buffer, Ethidium Bromide, Hai primer: CAST mồi xuôi,CAST mồi ngược Enzym giới hạn kỹ thuật PCR- RFLP Dụng cụ thiết bị: Túi nylon, pipet, tube PCR, tube ly tâm, micropipet, đầu côn, giấy thấm, gang tay, số dụng cụ khác: Tủ mát, tủ đông, máy ly tâm, máy lắc, máy PCR, máy khử trùng dụng cụ, điện di, lò vi sóng, cân điện tử, Đối tượng thí nghiệm Thí nghiệm tiến hành 34 mẫu tai heo rừng Tây Nguyên: 18 mẫu lợn đực 16 mẫu lợn 3.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Thu thập mẫu Mỗi mẫu lấy khoảng 200 mg sau mang phòng thí nghiệm trữ -20°C, chuẩn bị cho trình tách chiết DNA 3.2.2 Tách chiết DNA Nguyên tắc: Có nhiều phương pháp sử dụng cho tách chiết DNA.Việc tách chiết DNA/RNA bao gồm bước sau: (1) phá màng tế bào, (2) loại protein, (3) tủa DNA/RNA.Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng protein Sự tách chiết dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha không hòa tan Các bước tiến hành: • • • • • • • - - Cắt nhỏ 20mg mẫu mô tai heo cho vào ống eppendorf 1,5 ml thêm 180 µl Digestion Solution Thêm 20 µl Proteinase K Solution, mix vortex 15 giây Ủ 56°C 3h Thêm 20 µl RNase A Solution, mix vortex để 10 phút nhiệt độ phòng Thêm 200 µl Lysis Solution mix vortex 15 giây Thêm 400 µl Ethanol 50% mix vortex Ly tâm nhẹ sau chuyển dung dịch vào cột GeneJet Genomic DNA Purification Column gắn với ống 2ml.Ly tâm 6000rpm phút Chuyển cột sang ống 2ml thêm 500 µl dung dịchWash buffer I( bổ sung Ethanol) ly tâm 8000 rpm phút Đổ dịch lắng ống 2ml thêm 500 µl Wash buffer II ( bổ sung Ethanol) ly tâm 12000 rpm phút chuyển cột sang ống 1.5ml Thêm 200 µl Elution Buffer vào cột để phút nhiệt độ phòng sau ly tâm 8000rpm phút Loại bỏ cột bảo quản mẫu DNA nhiệt độ -20°C 3.2.3 Kiểm tra ADN điện di gel agarose Pha gel, đổ gel: sử dụng đệm TAE 1X, agarose 1% Load µl DNA khuyếch đại với µl loading dye 6X, mix µl DNA ladder nhỏ vào giếng để làm thang chuẩn so sánh kích thước Dùng pipette hút nhỏ vào giếng gel Điện di gel điện trường 70V 35 phút Nhuộm gel với Ethidium Bromide 15 phút Quan sát chụp ảnh gel với tia UV Điện di dùng để kiểm tra ADN trước sau chạy PCR Nồng độ gel 1% dùng để kiểm tra ADN sau tách chiết Trường hợp kiểm tra sản phẩm PCR hay sản phẩm enzym cắt giới hạn nồng độ agarose cao 3.2.4 Xác định kiểu gen Sử dụng phương pháp PCR-RFLP 34 mẫu heo rừng tách chiết DNA Các tiêu quan sát gồm: đa hình gen tần suất kiểu gen Các bước PCR-RFLP Nhân đoạn gen cần thiết PCR: sau tách chiết DNA tiến hành phản ứng PCR máy PCR với cặp mồi chuyên biệt Trình tự primer để nhân đoạn gen CAST (Ernst et al., 1998) F:GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC R:TGCAGATACACCAGTAACAG Thành phần mix cho phản ứng PCR: Nước khử ion, dream taq ,mồi xuôi,mồi ngược, DNA - Điện di agarose sản phẩm PCR: sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1% điện di chiều,sau nhuộm với Ethidium Bromide - Chụp hình gel sản phẩm PCR: sau điện di gel sản phẩm PCR, chụp hình gel, điều chỉnh ánh sáng quan sát băng AND xuất tren gel Sản phẩm PCR ủ với enzym giới hạn thích hợp để cắt đoạn gen quan sát gel agarose (PCR-RFLP) Kỹ thuật RFLP tiến hành theo bước sau: - Sử dụng sản phẩm PCR đạt chất lượng tốt (thông qua kiểm tra gel agarose %) - Sử dụng enzym cắt hạn chế để cắt ADN thành đoạn có kích thước khác - Tiến hành hút 0,9 μl buffer cho vào effendoft chứa 7,6 μl sản phẩm PCR thêm 0,5μl enzyme cắt ủ nhiệt độ 37 PCR cắt enzyme cắt giới hạn kiểm tra gel agarose 2,5% để đọc kết Kết đọc dựa vào kích thước đoạn DNA cắt từ sản phẩm PCR 3.2.5 Tính tần số kiểu gen tần số alen Tần số kiểu gen: kiểu gen xác định từ kết điện di PCR-RFLP tần số kiểu gen tỷ lệ số cá thể có kiểu gen quần thể khảo sát TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nghiên cứu số đặc điểm sinh học lợn rừng (Sus scrofa) Tây Nguyên Tạp chí Sinh học, 2014, 36: 36SE-TN161 Hội Đồng Hạt Cốc Chăn Nuôi Mỹ (1996) Cẩm nang chăn nuôi lợn công nghiệp NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 913-931 Lê Thị Mến (2010) Kỹ thuật chăn nuôi heo NXB Nông nghiệp, TPHCM Nguyễn Thiện Và Võ Trọng Hốt (2007) Kỹ thuật chăn nuôi chuồng trại nuôi heo NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Ngọc Tuân Và Trần Thị Dân (2000) Kỹ thuật chăn nuôi heo NXB Nông Nghiệp, TPHCM Nguyễn Thiện (2009) Giống lợn suất cao kỹ thuật chăn nuôi hiệu NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng Và Trần Quốc Dũng 2007 Giáo trình công nghệ tái tổ hợpDNA NXB Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh Tr 65 Phạm Hồng Sơn (2006) Giáo trình kỹ thuật sinh học phân tử NXB Đại Học Huế, tr.9 Tài liệu tiếng anh Wang Q S et al (2007) Polymorphisms of the CAST gene in the Meishan and five other pig populations in China South African Journal of Animal Science 2007, 37 (1), 2730 Takano G J et al (2004) The relationship between slow and fast myosin heavy chain content, calpastatin and meat tenderness in different ovine skeletal muscles Meat Science 69 (2005) 17–25 Goll M L A Zybert , E Krzecio , K Antosik et al (2004) New alleles in calpastatin gene are associated with meat quality traits in pigs American Society of Animal Science 82:2829–2839 Krzecioa B et al (2008) The influence of CAST genes polymorphism and their interactions on selected meat quality parametres Animal Science Papers and Reports vol 12 (2008) no 4, 389-398 Ernst C W , Zlender K, A Robic, M Yerle, L Wang, M F Rothschild (1998) Mapping of calpastatin and three microsatellites to porcine chromosome 2q2.1 ± q2.4 Animal Genetics, 1998, 29, 212-215 Rybarczyk A and M Bonneau (2008) The effect of calpastatin polymorphism (CAST/HinfI and CAST/Hpy188I) and its interaction with RYR1 genotypes on carcass and pork quality of crossbred pigs Animal Science Papers and Reports vol 28 (2010), no 3, 253-260 M.Kocwin-Podsiadla, J.Kuryl, E Krzecio, A Zybert, W Przybylski.The interaction between calpastatin and RYR1 genes for some pork quality traits Meat Science 65 (2003) 731–735