BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC- ĐIỀU DƯỠNG BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP ALKALOID TRONG TÂM SEN (NELUMBO NUCIFERA GAERTN NELUMBONACEAE) Sinh viên: Phù Hạnh Nguyên Lê Hữu Bảo Trân Lớp : Đại Học Dược 7B Người hướng dẫn : Lưu Thảo Phúc Trường Cần Thơ, 2015 Mục lục: Trang Danh mục chữ viết tắt Phần 1: Tổng quan tài liệu Bài tiểu luận hóa phân tích 1.1 Tóm tắt giới thiệu 1.2 Đặt vấn đề Phần 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Hóa chất, dung môi 2.3 Phương pháp nghiên cứu .5 Phần 3: Kết bàn luận 3.1 Định tính sắc ký lớp mỏng 3.2 Chiết xuất alkaloid toàn phần từ tâm sen 3.3 Phân lập alkaloid từ tâm sen Phần 4: Kết luận 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO .10 Danh mục chữ viết tắt PDA : Photodiode array ( Màng Diod quang) TCL : sắc ký lớp mỏng Đại Học Dược 7B Trang Bài tiểu luận hóa phân tích UV-VIS : tử ngoại- khả kiến UV: tử ngoại DCM : : Diclometan MeOH : Methanol Phần 1: Tổng quan tài liệu 1/ Tóm tắt giới thiệu: Đại Học Dược 7B Trang Bài tiểu luận hóa phân tích Từ khóa: Nelumbo nucifera, Nelumbonaceae, Alkaloid, Neferin Mở đầu: Sen (Nelumbo nucifera Gaertn ) họ Nelumbonaceae biết đến với nhiều ứng dụng quan trọng sống, giá trị thực phẩm mang ý nghĩa tâm linh Với vẻ đẹp khiết, Sen trở thành biểu tượng thiếu số văn hóa, gắn liền với tâm hồn người Việt Nam Ngoài ra, từ lâu Sen biết đến dược liệu quý Sen nghiên cứu áp dụng để chữa nhiều bệnh, bệnh đường tiêu hóa, tim mạch, tâm thần kinh, sưng viêm, thành công Hiện nay, có nhiều nghiên cứu thành phần quan trọng Sen alkaloid Chúng tồn toàn sen: thân, lá, hoa có nhiều tâm sen Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu kỹ toàn diện tâm Sen Vì đề tài thực nhằm mục tiêu nghiên cứu thành phần alkaloid tâm Sen phân lập alkaloid Sen để dùng làm chất chuẩn cho tiêu chuẩn hoá dược liệu góp phần bổ sung sở liệu thành phần hóa học cho Sen Việt Nam Mục tiêu: Chiết xuất, phân lập alkaloid tâm Sen Phương pháp: Chiết cao chiết toàn phần tách thành phân đoạn đơn giản phân bố nước với dung môi có độ phân cực khác theo pH Phân lập chất tinh khiết sắc ký cột chân không sắc ký cột cổ điển Kết quả: Tách phân đoạn đơn giản (P, NP8, NP5) từ cao alkaloid toàn phần theo biến thiên pH Đồng thời phân lập alcaloid EN-1, EN-2 xác định neferin nuciferin Kết luận: Đề tài xác định chất tinh khiết neferin nuciferin tạo sở cho việc định tính điểm định lượng neferin tâm Sen vùng miền mùa thu hái khác 2/ Đặt vấn đề: Đại Học Dược 7B Trang Bài tiểu luận hóa phân tích Trong kho tàng thực vật thuốc Việt Nam, Sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae) mọc ao, hồ có khắp miền đất nước, số dược thảo mà tất phận vị thuốc quí, có giá trị sinh học cao Tuy nhiên, việc sử dụng chế phẩm bào chế từ tâm, Sen thuốc viên uống, cao thuốc, loại trà dạng cao toàn phần, dịch chiết toàn phần Do nghiên cứu chiết xuất, phân lập tiêu chuẩn hóa thành phần alkaloid có tác dụng sinh học tâm Sen Việt Nam góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu chế phẩm từ Sen thăm dò tác dụng sinh học chúng việc làm cần thiết Phần 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (được sấy khô 400C bảo quản nhiệt độ thấp) thu hái Đồng tháp mua nhà thuốc đông dược 2.2 Hóa chất, dung môi Tất dung môi, hóa chất loại tinh khiết đạt tiêu chuẩn phân tích 2.3 Phương pháp nghiên cứu Chiết cao chiết cồn toàn phần tách thành phân đoạn đơn giản phân bố nước với dung môi có độ phân cực khác theo pH Phân tách phân đoạn chiết phân bố lỏng-lỏng, sắc kí cột chân không Phân lập chất tinh khiết sắc ký cột cổ điển, sắc ký rây phân tử kết tinh phân đoạn Phần 3: Kết bàn luận 3.1 Định tính sắc ký lớp mỏng Qua thăm dò số hệ dung môi cho sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi DCM-MeOH-NH4OH (90:10:1) có khả tách tốt alkaloid phân cực mạnh trung bình tâm Sen hệ dung môi DCM-MeOH NH4OH (95:5:1) tách tốt alkaloid phân cực UV365 Đại Học Dược 7B UV254 Trang Dragendorff Bài tiểu luận hóa phân tích Sắc ký đồ alkaloid toàn phần tâm sen 3.2 Chiết xuất alkaloid toàn phần từ tâm sen Chiết xuất alkaloid toàn phần từ tâm sen theo quy trình sau : Bột dược liệu làm ẩm NH4OH 10% sau chiết cồn 700 dịch chiết cồn cất áp suất giảm để thu hồi cồn.Hòa tan cắn vao nước, acid hóa HCL 5% đến PH =2.Lọc loại bỏ cặn.Dịch lọc acid chiết ether dầu hỏa để loại tạp.Dịch chiết acid thêm NH4OH 10% đến PH=10-11 chiết CHCl3 Dịch chiết CHCl3 cất thu hồi dung môi,còn lại cắn alkaloid toàn phần Bột tâm sen Cồn 70%, thu hồi cồn áp suất giảm Dịch chiết đậm Đại Học Dược 7B Trang Phân đoạn Dịch Dịch sau chiết Phân đoạn Điều chỉnh đến pH=7-8, Dịch acid Dịch kiềm Phân đoạnthô P I NP5 loại kết Kết tinh Sơtinh đồ chiết cao toàn phần tâm sen pH=5 Chiếtcồn vớiCHCl NaOH Chiết với NP Bài tiểu luận hóa phân tích Thêm HCl 5% đến pH =2 NH4OH 10% đến pH=10,chiết với CHCl3 Dịch chiết CHCl3 Dịch kiềm pH=7-8 Phân đoạn NP8 3.3 Phân lập alkaloid từ tâm sen Phân lập alkaloid sắc ký cột sử dụng silica gel GF254(Merck):Hoạt hóa silica gel nhiệt độ 1100C giờ.Lắc silica gel với hệ dung môi chọn thành hỗn dịch ,rót từ từ vaò cột, sau cho dung môi chảy qua liên tục với thời gian để ổn định cột.Cắn alkaloid toàn phần hòa vaò lượng nhỏ với Đại Học Dược 7B Trang Bài tiểu luận hóa phân tích hệ dung môi chọn tạo thành dịch alkaloid đậm đặc trộn với lượng silica gel vừa đủ đưa vào cột sắc ký chuẩn bị Rửa giải hệ dung môi chọn theo tỉ lệ độ phân cực tăng dần.Tốc độ chảy khỏang 30 giọt/ phút,hứng phân đoạn khoảng 5ml vào ống nghiệm riêng kiểm tra sắc ký lớp mỏng.Chọn riêng phân đoạn có vết sắc ký đồ ,bốc dung môi thu cắn alkaloid.Kết tinh lại nhiều lần thu alkaloid tinh khiết.Riêng phân đoạn có vết tiến hành phân lập tiếpbằng sắc ký lớp mỏng điều chế Tách phân đoạn P, NP, NP8 Từ phân đoạn NP trên, dịch CHCl3 cô đến cắn, hòa vào HCl 5% điều chỉnh đến pH=2 NH4OH 25%, chiết phân bố với CHCl3 đến không alkaloid qua lớp CHCl3 Dịch chiết gộp lại thu phân đoạn NP5 Tiếp tục kiềm hóa dịch pH=4-5 đến pH=7-8, chiết phân bố với CHCl3 đến không alkaloid qua lớp CHCl3 Dịch chiết gộp lại thu phân đoạn NP8 Kết tách phân đoạn từ cao chiết cồn minh hoạ hình sau: Đại Học Dược 7B Trang Bài tiểu luận hóa phân tích Dragendorff UV254 UV365 TPNP5 P NPNP7 NP5 NP7 TP P NP TP P NP NP5 NP7 Hình :Sắc ký đồ phân đoạn từ cao cồn Phân lập alkaloid sắc ký lớp mỏng điều chế: Chấm dung dịch chứa vết lên mỏng có kích thước 20 x 20 cm tráng chất hấp phụ silica gel G (Merck), hoạt hóa 1100C Hệ dung môi khai triển CHCl3:MeOH:NH4OH ( 50 :9 :1 ) Bản mỏng để khô nhiệt độ phòng, sau phun thuốc thử Dragendorff lên góc để phát đánh dấu vết alkaloid Cạo lấy silica gel chứa chất cần tách, phản hấp phụ CHCl3 lọc Để CHCl3 bốc tự nhiên, sau hoàn tan lại bằn cồn ethanol để tủ lạnh, cho kết tinh lại nhiều lần thu alkaloid tinh khiết EN-1 EN-2 Phân lập EN-1 Phần kết tinh thô I hòa tan lượng vừa đủ HCl, lọc để kết tinh tủ lạnh Tinh thể lọc rửa kỹ nước lạnh đến dịch rửa trung tính, thu tinh thể hình kim, màu trắng (EN-1).Tiến hành sắc ký lớp mỏng cho thấy EN-1 alkaloid phân cực trung bình có hàm lượng cao tâm Sen EN-1 cho vết đèn UV thuốc thử Dragendorff cho thấy kết tinh thô I tinh khiết TLC với EN-1 Đại Học Dược 7B Trang Bài tiểu luận hóa phân tích Hình : SKĐ EN-1 ba hệ dung môi khác Phổ UV EN-1 dung môi nước cho λmax 282nm nằm vùng hấp thu alkaloid có khung bibenzylisoquinolein phù hợp với λmax neferin mà tài liệu nước công bố Công thức cấu tạo Neferin Phân lập EN-2 từ NP8 NP8 cô áp suất giảm để dịch CHCl3 đậm đặc phần kết tủa màu vàng.Dịch CHCl3 cô tới cắn Hòa tan cắn với lượng vừa đủ dung dịch HCl 5% Dịch acid loại tạp ether dầu hỏa kiềm hóa amoniac tới pH 8-9 Chiết alkaloid từ dịch kiềm chloroform cô thu hồi dung môi thu cắn Hòa tan vào lượng tối thiểu methanol để kết tinh thu hình lăng trụ (EN-2) Tiến hành SKLM cho EN-2 với ba hệ dung môi khác nhau, EN-2 cho vết đèn UV thuốc thử Dragendorff cho thấy EN-2 alkaloid phân cực tinh khiết TLC Đại Học Dược 7B Trang 10 Bài tiểu luận hóa phân tích Hình : Sắc ký đồ kiểm tra EN-2 EN-2 có dạng tinh thể hình lăng trụ, không màu, không mùi, vị đắng Căn vào nhiệt độ nóng chảy khoảng 163-1640C,phổ UV.Qua liệu thu kết luận EN-2 nuciferin (C19H21NO2) Công thức cấu tạo Nuciferin Phần :Kết luận Thành phần alkaloid tâm Sen khảo sát sắc ký lớp mỏng Alkaloid phân lập xác định cấu trúc neferin nuciferin Các alkaloid sử dụng làm chất đánh dấu nghiên cứu tiêu chuẩn hoá tâm Sen chế phẩm có tâm Sen để khảo sát tác dụng dược lý Đại Học Dược 7B Trang 11 Bài tiểu luận hóa phân tích TÀI LIỆU THAM KHẢO : Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn , Trần Hùng (2011), Nghiên cứu thành phần alkaloid tâm sen, Y Học TP Hồ Chí Minh Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn , Trần Hùng (2011),Xây dựng qui trình định lượng Neferin cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò diod quang, Y Học TP Hồ Chí Minh Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu kiểm nghiệm thuốc, trang 16 Đại Học Dược 7B Trang 12 [...]... xác định cấu trúc là neferin và nuciferin Các alkaloid này có thể sử dụng làm chất đánh dấu trong nghiên cứu tiêu chuẩn hoá tâm Sen và các chế phẩm có tâm Sen cũng như để khảo sát các tác dụng dược lý Đại Học Dược 7B Trang 11 Bài tiểu luận hóa phân tích TÀI LIỆU THAM KHẢO : 1 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn , Trần Hùng (2011), Nghiên cứu thành phần alkaloid trong tâm sen, Y Học TP Hồ Chí Minh 2... hóa phân tích Hình : Sắc ký đồ kiểm tra của EN-2 EN-2 có dạng tinh thể hình lăng trụ, không màu, không mùi, vị đắng Căn cứ vào nhiệt độ nóng chảy khoảng 163-1640C,phổ UV.Qua các dữ liệu thu được có thể kết luận EN-2 là nuciferin (C19H21NO2) Công thức cấu tạo của Nuciferin Phần 4 :Kết luận Thành phần alkaloid của tâm Sen đã được khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng Alkaloid chính trong đó đã được phân lập và. .. Nguyễn Đức Tuấn , Trần Hùng (2011),Xây dựng qui trình định lượng Neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò diod quang, Y Học TP Hồ Chí Minh 3 Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc, trang 16 Đại Học Dược 7B Trang 12