ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ - - TIỂU LUẬN CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HĨA ĐO CO2 HỊA TAN SỬ DỤNG ENZYME ANHYDRASE CARBONIC MÔN HỌC: CẢM BIẾN SINH HỌC HỌ VÀ TÊN: PHẠM ĐỨC HẬU GIẢNG VIÊN: TS LÊ THỊ HIÊN Ngành: Vật lý kỹ thuật công nghệ nano HÀ NỘI, 11/2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TIỂU LUẬN CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HĨA ĐO CO2 HỊA TAN SỬ DỤNG ENZYME ANHYDRASE CARBONIC MÔN HỌC: CẢM BIẾN SINH HỌC HỌ VÀ TÊN: PHẠM ĐỨC HẬU GIẢNG VIÊN: TS LÊ THỊ HIÊN Ngành: Vật lý kỹ thuật công nghệ nano HÀ NỘI, 11/2016 MỞ ĐẦU Carbonic (carbon dioxide) loại khí quan trọng mơi trường, hình thành từ phản ứng sinh hóa thể sinh vật, trình đốt cháy chất có chứa liên kết carbon Carbonic góp phần trình quang hợp thực vật, tạo nguồn hữu cho phát triển cho sinh giới CO2 hòa tan nước ứng dụng quan trọng ngành công nghiệp giải khát, bảo quản thực phẩm Vấn đề đặt để xác định nồng độ CO2 Các kỹ thuật phân tích định tính chất khí Một số phương pháp phổ biến thiết xác định nồng độ CO2 tia hồng ngoại, cách đo phổ phát xạ Cảm biến sử dụng hiệu với CO2 chất khí, hồng ngoại sử dụng với bước sóng 4,2 nm Tuy nhiên để xác định nồng độ CO2 hịa tan nước cảm biến khơng thể hoạt động Nó bị cản trở nước vấn đề liên quan đến độ hòa tan nước CO2 Nhiều cảm biến quang học phát triển cải tiến để phát đo CO2 hòa tan nước Ưu điểm loại cảm biến có độ bền học cao, dễ sản xuất Tuy nhiên nhược điểm lớn lại độ nhạy độ xác không cao Hơn thế, cảm biến CO2 quang học đáp ứng chậm đo CO2 hòa tan, ảnh hưởng mơi trường nước Vì hạn chế cảm biến quang Trong tiểu luận tìm hiểu loại cảm biến điện hóa, sử dụng đầu dò enzyme carbonic anhydrase (CA) I Giới thiệu CO2 enzyme Carbonic anhydrase (CA) Giới thiệu CO2 Điơxít cacbon hay cacbon điơxít (các tên gọi khác thán khí, anhiđrít cacbonic, khí cacbonic) hợp chất điều kiện bình thường có dạng khí khí Trái Đất, bao gồm nguyên tử cacbon hai ngun tử ơxy Là hợp chất hóa học biết đến rộng rãi, thường xuyên gọi theo cơng thức hóa học CO2 Trong dạng rắn, gọi băng khơ Hình 1: Hình ảnh phân tử CO2 Điơxít cacbon thu từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm khí từ núi lửa, sản phẩm cháy hợp chất hữu hoạt động hô hấp sinh vật sống hiếu khí Nó số vi sinh vật sản xuất từ lên men hơ hấp tế bào Các lồi thực vật hấp thụ điơxít cacbon q trình quang hợp, sử dụng cacbon ôxy để tạo cacbohyđrat Ngồi ra, thực vật giải phóng ơxy trở lại khí quyển, ơxy sinh vật dị dưỡng sử dụng q trình hơ hấp, tạo thành chu trình Nó có mặt khí Trái Đất với nồng độ thấp tác động khí gây hiệu ứng nhà kính Nó thành phần chu trình cacbon Điơxít cacbon khí khơng màu mà hít thở phải nồng độ cao (nguy hiểm gắn liền với rủi ro ngạt thở) tạo vị chua miệng cảm giác nhói mũi cổ họng Các hiệu ứng khí hịa tan màng nhầy nước bọt, tạo dung dịch yếu axít cacbonic Tỷ trọng riêng 25 °C 1,98 kg m−3, khoảng 1,5 lần nặng khơng khí Phân tử điơxít cacbon (O=C=O) chứa hai liên kết đơi có hình dạng tuyến tính Nó khơng có lưỡng cực điện Do hợp chất bị ơxi hóa hồn tồn nên mặt hóa học khơng hoạt động cụ thể không cháy Ở nhiệt độ -78 °C, điơxít cacbon ngưng tụ lại thành tinh thể màu trắng gọi băng khơ Điơxít cacbon lỏng tạo áp suất 5,1 barơ; diều kiện áp suất khí quyển, chuyển trực tiếp từ pha khí sang rắn hay ngược lại theo trình gọi thăng hoa Nước hấp thụ lượng định điơxít cacbon, nhiều lượng khí bị nén Khoảng 1% điơxít cacbon hịa tan chuyển hóa thành axít cacbonic Axít cacbonic phân ly phần thành ion bicacbonat (HCO3-) cacbonat (CO3−2) Hình 2: Phản ứng phân tử CO2 với nước Thử nghiệm tìm điơxít cacbon Khi nguồn lửa đưa vào ống thử có chứa điơxít cacbon lửa tắt điơxít cacbon khơng trì cháy (Một số loại bình cứu hỏa chứa điơxít cacbon hay chất phản ứng với tạo dùng để dập lửa) Để xác nhận khí điơxít cacbon khí dẫn qua dung dịch hiđrơxít canxi(Ca(OH)2) Dung dịch hiđrơxít canxi chuyển thành màu sữa tạo thành cacbonat canxi enzyme Carbonic anhydrase (CA) CA metalloprotein có ion điều hành ion kẽm, ion hóa trị 2, điều hành hoạt động thơng qua việc làm âm hóa vị trí histidine phân tử (vị trí làm cấu trúc H-O-H nước trở thành H-O(-)—H(+), thuận lợi để tạo HCO3và H+ trực tiếp từ CO2 H2O mà không trải qua trung gian H2CO3 Chính vậy, phản ứng xảy với số vào khoảng 106 (một số nhanh hệ thống sống) Hình 3: Hoạt động enzyme andydrase carbonic Từ hình ta thấy phản ứng thuận chiều gia tốc thêm triệu lần, làm số tổng hợp lúc vào khoảng 0.1 Khi ion H+ HCO3- hình thành Có nhiều dạng CA tự nhiên Đơn cử dạng α-CA nghiên cứu rõ ràng diện động vật Ion Zn2+ kết hợp với vòng nhẫn imidazole (imidazole rings) phân tử Histidine: His94, His96, His119 Hình 4: Hình ảnh cấu tạo andydrase carbonic Hình 5: Hình ảnh protein andydrase carbonic Chức enzyme động vật xúc tác chuyển đổi qua lại CO2 HCO3- để trì cân acid-base máu mô khác, giúp vận chuyển CO2 khỏi mơ Có 14 đồng dạng α-CA khác động vật hữu nhũ Thực vật có dạng khác gọi β-CA, mà theo quan điểm tiến hóa loại enzyme khác biệt với αCA, tham gia vào phản ứng hóa học sử dụng ion Zn2+ vị trí hoạt động Ở thực vật, CA giúp tăng nồng độ CO2 lục lạp (chloroplast) để tăng tốc độ carboxyl hóa enzyme RuBisCO Đó phản ứng hợp CO2 vào phân tử đường carbon hữu q trình quang hợp, sử dụng dạng CO2 từ carbon từ carbonic acid hay bicarbonate CA chứa cadmium (cadmium-containing carbonic anhydrase) tìm thấy lồi tảo cát (diatoms) biển điều kiện nồng độ kẽm bị giới hạn Trên đại dương, nồng độ kẽm thường thấp giới hạn phát triển lồi thực vật trơi (phytoplankton) mà điển hình tảo cát Và nghiên cứu ta lấy từ động vật bò II Cảm biến sinh học, cấu tạo cảm biến điện hóa CA Hình 6: Hình ảnh mơ hình cảm biến sinh học Cảm biến sinh học thiết bị tích hợp bao gồm phận: Đầu thu sinh học: enzyme, DNA, miễn dịch có chức nhận biết tác nhân hay gọi chất Bộ phận chuyển đổi tín hiệu: dựa vào thay đổi đầu thu Điện hóa, pH để đưa tín hiệu cho phận xử lý Bộ phận xử lý đọc tín hiệu: đưa tín hiệu cho người dùng dựa vào phận chuyển đổi tín hiệu trước Cảm biến sinh học điện hóa sử dụng enzyme CA có cấu tạo bao gồm: Lớp enzyme Lớp chất hữu quinone Thanh graphite Ống dẫn silicon Sợi dây dẫn đồng Đầu cắm Hình 7: Cấu tạo cảm biến sinh học điện hóa CA Chúng ta có phần đầu thu sinh học lớp enzyme kết nối với cực điện graphite, điện cực chức hóa lớp quinone Phần dây dẫn sử dụng dây đồng dẫn truyền đến đầu cắm sử lý tín hiệu phần mềm PSTAT10 AUTOLAB hệ máy tính Windows Lớp điện sử dụng ống silicone III Phương pháp chế tạo nguyên lý hoạt động Chuẩn bị: CA từ hồng cầu bò (EC 4.2.1.1) Protein albumin huyết bò Glutaraldehyde (GA) (G-5882) p-Benzoquinone Hình ảnh cấu tạo glutaraldehyde p-benzoquinone Hình 10: Điện cực làm graphite (cacbon) Điện cực làm từ cacbon dài 1cm có đường kính 4mm ngâm nước sơi 1h rửa với acetone Hình 11: Phần điện cực lớp cách điện dây dẫn Dây dẫn điện sử dụng đồng Điện cực đưa vào ống silicone để cách điện Điện cực đưa vào ống silicone để cách điện Cuối lớp bề mặt điện cực rửa với acetone bổ sung pbenzoquinone để khơ khơng khí 1h kiểm tra cách điện Cyclic voltammetry Hình 12: Phần điện cực lớp cách điện dây dẫn kết hợp với enzyme có lớp hữu quinone Enzyme CA Protein albumin với nồng độ sau 10 mg/ml 50 mg/ml,và pha với tỷ lệ 1:1 Sau phút, cho glutaraldehyde (25mg/ml nước cất) nửa hỗn hợp BSA.CA đến điện cực để khơng khí để tạo điều kiện cho enzyme liên kết ngang Cuối kết hợp thiết bị cảm biến với đầu cắm Hình 13: Phản ứng p-Benzoquinone Nguyên lý làm việc cảm biến sau lớp enzyme CA xúc tác phản ứng CO2 H2O tạo H+, lớp p-Benzoquinone chuyển hóa thành Hydroquinone nhận H+ điện tích cung cấp Lớp sau Hydroquinone phản ứng ngược lại trở thành p-Benzoquinone tạo điện tích dẫn vào điện cực phận xử lý tín hiệu đưa kết IV Các đánh giá cảm biến Hình 14: Thời gian đáp ứng loại cảm biến điện hóa với đầu dò khác nồng độ CO2 hịa tan khác Dựa vào hình 14 ta thấy với loại cảm biến: hình trịn cảm biến khơng có lớp enzyme CA, hình vng điện cực chức hó với Tris-HCL, cuối hình tam giác cảm biến sinh học có đầu dị enzyme CA Như hình thể hiện, nhận thấy với cảm biến sinh học có đầu dị enzyme CA thời gian đáp ứng cảm biến nhanh, có tính ổn định cao nhiều trường hợp, giá trị thời gian dần tăng lên tính ổn định giảm cảm biến cịn lại Hình 15: Các giá trị điện nồng độ CO2 hòa tan khác Ở nhóm nghiên cứu sử dụng hai loại cảm biến để so sánh cảm biến điện hóa với đầu dị khơng gắn enzyme trường hợp cảm biến sinh học có đầu dị lớp enzyme CA Dựa vào hình 15 ta thấy với nồng độ tăng giần nguồn điện cung cấp cho hai loại cảm biến tăng dần, nhiên cảm biến sinh học với đầu dò CA điện cung cấp lớn hơn, điều chứng tỏ trình chuyển hóa lớp pBenquinone nhiều Và chứng tỏ độ nhạy tính xác cảm biến sinh học CA vượt trội nhiều Hình 16: Ảnh hưởng nồng độ p-Benquinone đến cảm biến Tiếp theo ta xét nồng độ p-Benquinone khác từ 5µl - 20µl, với điều kiện điện làm việc -100 mV, nhiệt độ 00C, với lượng tạo đầu dò CA/BSA ban đầu 20 µl Ta nhận thấy với µl dịng điện cảm biến nhận vào khoảng 0,5 µA, nhiên với nồng độ từ 10 µl đến 20 µl, giá trị giao động khoảng 1,4 µA – 1,8 µA, với sai số 0,4 µA, ta kết luận khoảng 10 µl đến 20 µl nồng độ PBQ cảm biến hoạt động với hiệu suất cao Hình 17: Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến cảm biến Trong điều kiện giới hạn lượng enzyme nên khảo sát ta thay đổi lượng CA/BSA khoảng - 20 µl Với điều kiện 10 µl PBQ điện hoạt động -100mV nhiệt độ 00C Dựa vào hình 17 ta thấy khoảng enzyme ta xét hiệu suất hoạt động cảm biến sinh học CA tương đối ổn định Hình 18: Ảnh hưởng điện đến cảm biến Tiếp theo nhóm nghiên cứu thay đổi điện hoạt động với giá trị điện thay đổi từ -300mV đến 300mV Với điều kiện có 10 µl PQB, 15 µl CA/BSA nhiệt độ 00C Nhận thấy giá trị-100mV hiệu suất cảm biến sinh học CA cao Vậy nên trường hợp khảo sát ta để giá trị điện cực làm việc -100mV Hình 18: Ảnh hưởng nhiệt độ đến cảm biến Một vấn đề ta muốn khảo sát nhiệt độ thi đo nồng độ CO Với điều kiện hoạt động cảm biến sinh học CA làm việc tốt đề cập Dựa vào hình 18 nhận thấy với giá trị từ 0C đến 200C cảm biến hoạt động tốt Nhưng với nhiệt độ cao 20 0C ta thấy hoạt động cảm biến bắt đầu khơng tốt Một lý do nhiệt độ cao nồng độ CO2 nước bắt đầu có xu hướng giảm KẾT LUẬN Qua nghiên cứu ta góp phần cải tiến, nâng cấp thiết bị đo đạc nồng độ CO2 hòa tan nước Chúng ta biết ứng dụng quan trọng CO2 tự nhiên đến ngành công nghiệp giải khát, làm lạnh bảo qua thực phẩm Vì việc cải tiến cảm biến phần cốt lõi lịch sử Việc phát sử dụng enzyme CA bước tiến quan trọng Enzyme CA có hầu hết sinh vật, với thể người quan trọng vấn đề đào thải thận nên việc nghiên cứu sử dụng enzyme CA góp phần nhiều y học chữa trị bệnh người TÀI LIỆU THAM KHẢO https://www.researchgate.net/publication/223566106_Use_of carbonic_anhydase_in_electrochemical_biosensors_for_dissolved_CO2 http://www.docsachysinh.com/tai-lieu-tham-khao/khai-luan-ve-carbonic-anhydrase/