ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  NGUYỄN HỮU THUẦN ANH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY SOLASODINE Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO (Solanum hainanense Hance) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT HUẾ - 2016 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  NGUYỄN HỮU THUẦN ANH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY SOLASODINE Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO (Solanum hainanense Hance) Chuyên ngành: Sinh lý thực vật Mã số: 62 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc PGS.TS Cao Đăng Nguyên HUẾ - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu chúng tôi, số liệu kết nghiên cứu nêu luận án trung thực, khách quan, nghiêm túc chưa công bố công trình khác Những tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng Nếu có sai sót, xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Thừa Thiên Huế, tháng năm 2016 Tác giả Nguyễn Hữu Thuần Anh LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến Thầy giáo GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc, người tận tâm giúp đỡ, hướng dẫn, bảo động viên suốt trình thực luận án sống hàng ngày Xin trân trọng cám ơn thầy giáo PGS.TS Cao Đăng Nguyên giúp đỡ động viên trình thực luận án Tôi xin chân thành cám ơn Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế tạo điều kiện cho thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn 2011-2014) tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô giáo, anh chị em đồng nghiệp, anh chị em học viên, sinh viên động viên, quan tâm giúp đỡ suốt trình làm luận án Đặc biệt cảm ơn tác giả có tên báo khoa học công bố hỗ trợ giúp đỡ trình tiến hành thí nghiệm luận án Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình luôn giúp đỡ, động viên khích lệ vật chất lẫn tinh thần Xin trân trọng cảm ơn! Nguyễn Hữu Thuần Anh MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ MỞ ĐẦU Chư ng TỔNG QUAN T I LIỆU 1.1 SẢ XUẤT P ẤT T Ứ ẤP TỪ U ẤY T B T Ự V T 1.1 ác phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật 1.1 Sản xuất hợp chất thứ cấp 113 ác nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp b ng nuôi cấy tế bào thực vật 10 12 Ứ T RĐ ẤT T Ứ ẤP TR U Ả T ẤY T B Ả T Y P T Ự V T 13 1.2.1 Elicitor 13 1.2.2 Nghiên cứu ứng dụng elicitor nuôi cấy tế bào thực vật 18 13 Y 22 Đặc điểm sinh học 22 1.3 ác nghiên cứu solasodine 25 133 ác nghiên cứu khác đối tượng cà gai leo 33 Chư ng ĐỐI TƯ NG NỘI DUNG V PHƯƠNG PH P NGHI N CỨU 35 21 Đ 22 T ỨU 35 U ỨU 35 2 Xác định khả sinh trưởng tích lũy solasodine tế bào cà gai leo 35 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến khả sinh trưởng tích lũy solasodine tế bào cà gai leo: 35 2.2.3 Khảo sát sơ hoạt tính sinh học dịch chiết solasodine lên khả ức chế collagenase .36 2.2.4 Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro cà gai leo 36 23 P P P ỨU 36 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 36 Phương pháp h a sinh 38 3 X l số liệu .39 Chư ng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 31 S TR Ở V T YS S ỦA T BÀO CÀ GAI LEO 40 1 Sinh trưởng tế bào 40 Tích lũy solasodine tế bào 41 3.2 Ả ỞNG CỦA ELICITOR S TR Ở V T Y SOLASODINE CỦA T BÀO CÀ GAI LEO 42 3.2.1 Ảnh hưởng methyl jasmonate 42 3.2.1.1 Nồng độ methyl jasmonate 42 3.2.1.2 Thời gian nuôi cấy .44 3.2.1.3 Thời điểm cảm ứng 46 3.2.3 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men 47 3.2.3.1 Nồng độ dịch chiết nấm men .47 3.2.3.2 Thời gian nuôi cấy .49 3.2.3.3 Thời điểm cảm ứng 50 3.2.4 Ảnh hưởng salicylic acid 52 3.2.4.1 Nồng độ salicylic acid 52 3.2.4.2 Thời gian nuôi cấy .53 3.2.4.3 Thời điểm cảm ứng 55 3.2.5 Ảnh hưởng kết hợp elicitor 56 3.2.5.1 Nồng độ elicitor 56 3.2.5.2 Thời gian nuôi cấy .58 3.2.5.3 Thời điểm cảm ứng 59 3.3 KHẢ S TS B HOẠT TÍNH CỦA SOLASODINE TỪ DỊCH CHI T T BÀO CÀ GAI LEO 60 3.4 QUY TRÌNH SẢN XUẤT SOLASODINE HI U SUẤT CAO TỪ T BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHI M 61 3.4.1 Nuôi cấy tạo nguyên liệu 61 3.4.1.1 Nuôi cấy in vitro 61 3.4.1.2 Nuôi cấy tạo callus .62 3.4.1.3 Nuôi cấy tạo tế bào huyền phù 62 3.4.2 Nuôi cấy sản xuất solasodine 63 3.4.3 Thu sinh khối tế bào tách chiết solasodine 63 Chư ng B N LUẬN 66 41 S 4.2 Ả TR Ở V T YS S 66 ỞNG CỦA METHYL JASMONATE 66 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ methyl jasmonate 67 4.2.2 Ảnh hưởng thời gian x lý methyl jasmonate 68 4.3 Ả ỞNG CỦA DỊCH CHI T NẤM MEN 70 4.3.1 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm men 70 4.3.2 Ảnh hưởng thời gian x lý dịch chiết nấm men 72 4.4 Ả ỞNG CỦA SALICYLIC ACID 73 4.4.1 Ảnh hưởng nồng độ salicylic acid .74 4.4.2 Ảnh hưởng thời gian x lý salicylic acid 76 4.5 Ả ỞNG PH I H P CÁC ELICITOR 76 4.6 SO SÁNH HI U QUẢ GIỮA CÁC ELICITOR 78 KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ .81 DANH MỤC C C CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid BA : benzyladenine BAP : benzylamino purine cs : cộng HCTC : hợp chất thứ cấp HPLC : high performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu cao) IAA : indole-3-acetic acid KIN : kinetin KTST : kích thích sinh trưởng MeJA : methyl jasmonate MS : Murashige and Skoog (1962) NAA : naphthaleneacetic acid SA : salicylic acid YE : yeast extract (dịch chiết nấm men) DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng 1.1 Trang Sản phẩm thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật so sánh với tự nhiên 10 1.2 Phân loại elicitor sản xuất hợp chất thứ cấp 14 1.3 Tổng hợp số loài Solanum sinh solasodine 28 3.1 Ảnh hưởng MeJ lên sinh trưởng tế bào cà gai leo 43 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 Ảnh hưởng MeJA lên khả tích lũy solasodine tế bào cà gai leo Ảnh hưởng thời điểm x l MeJ 50 µM lên sinh trưởng tế bào cà gai leo Ảnh hưởng thời điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả tích lũy solasodine tế bào cà gai leo Ảnh hưởng Y lên sinh trưởng tế bào cà gai leo Ảnh hưởng YE lên khả tích lũy solasodine tế bào cà gai leo Ảnh hưởng thời điểm bổ sung g/L YE lên khả sinh trưởng tế bào cà gai leo Ảnh hưởng thời điểm bổ sung g/L YE lên khả tích lũy solasodine tế bào cà gai leo Ảnh hưởng S lên sinh trưởng tế bào cà gai leo Ảnh hưởng SA lên khả tích lũy solasodine tế bào cà gai leo Ảnh hưởng thời điểm bổ sung 150 µM S lên sinh trưởng tế bào cà gai leo Ảnh hưởng thời điểm bổ sung 150 µM SA lên khả tích lũy solasodine tế bào cà gai leo 43 46 47 48 48 51 51 52 52 55 55 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Ảnh hưởng kết hợp cặp elicitor lên sinh trưởng tích lũy solasodine tế bào cà gai leo Ảnh hưởng kết hợp elicitor lên sinh trưởng tích lũy solasodine tế bào cà gai leo Ảnh hưởng thời điểm bổ sung 150 µM S g/ Y đến khả sinh trưởng tế bào cà gai leo Ảnh hưởng thời điểm bổ sung 150 µM S g/ Y đến khả tích lũy solasodine tế bào cà gai leo Hoạt tính dịch chiết solasodine tế bào cà gai leo collagenase 56 57 60 60 61 Hình 3.5.Phổ HPLC dịch chiết solasodine từ tế bào cà gai leo sau tuần nuôi môi trường bổ sung g/L YE vào thời điểm bắt đầu nuôi cấy Hình 3.6.Phổ HPLC dịch chiết solasodine từ tế bào cà gai leo sau tuần nuôi môi trường bổ sung 150 µM SA vào thời điểm bắt đầu nuôi cấy Hình 3.7.Phổ HPLC dịch chiết solasodine từ tế bào cà gai leo sau tuần nuôi môi trường bổ sung 150 µM SA g/L YE vào thời điểm bắt đầu nuôi cấy Hình 3.8.Phổ HPLC dịch chiết solasodine từ tế bào cà gai leo sau tuần nuôi môi trường bổ sung 100 µM SA, 50 µM MeJA g/L YE vào thời điểm bắt đầu nuôi cấy K t phân tích Duncan's test (p[...]... tài: Nghiên cứu ảnh hưởng c a một số elicitor lên khả năng t h lũy solasodine ở t bào in vitro c a cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) p dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù tạo nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự 2 nhiên cho các nghiên cứu trong lĩnh vực y học Các kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh... sinh khối tế bào để ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm sau này M tiêu ađ t i Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in vitro tế bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) Ý ngh a hoa họ v thự tiễn Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về khả năng tích lũy solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung các elicitor. .. (2006) đã nghiên cứu khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng lên quá trình tạo sinh khối tế bào và tích lũy alkaloid toàn phần có trong dịch nuôi cấy [5] Solasodine là một hợp chất chính trong cây cà gai leo (S hainanense) có nhiều tác dụng dược l đã được nghiên cứu và công bố Solasodine được tách chiết từ cây tự nhiên nhưng hàm lượng chưa cao và nguồn nguyên liệu ngày càng khan... Nam nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong nuôi cấy tế bào cà gai leo Kết quả của luận án là đáng tin cậy và có thể s dụng để tiếp tục nghiên cứu phát triển sản xuất solasodine ở quy mô lớn hơn Ph vi nghiên ứu Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học,... ĐỒ Số hiệu hình 1.1 1.2 2.1 3.1 Tên hình, biểu đồ s đồ Trang Cấu trúc hóa học của solasodine 25 on đường khả thi tổng hợp steroid trong thực vật cải tiến từ của Kaneko và cs (1976) Cây cà gai leo in vitro Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo không x 26 35 lý elicitor sau 7 tuần nuôi cấy 40 (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo 3.2 trong môi trường không x lý elicitor. .. cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy 58 59 3.16 Cây cà gai leo in vitro trong môi trường S0 sau 4 tuần nuôi cấy 61 3.17 Callus cà gai leo in vitro trong môi trường S2 sau 4 tuần nuôi cấy 62 3.18 3.19 3.20 Tế bào cà gai leo nuôi cấy trong môi trường S3 tốc độ lắc 150 vòng/phút Dịch chiết solasodine Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất solasodine. .. và cs (2010) đã nghiên cứu sản xuất solasodine từ callus cây cà gai leo in vitro và thu được kết quả cho thấy, hàm lượng solasodine tích lũy trong callus cao hơn khoảng 8,5 lần so với tách chiết từ rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi [56] Nhóm tác giả này (2011) cũng tiếp tục nghiên cứu nuôi cấy tế bào cà gai leo trong chai tam giác để thu solasodine và nhận thấy, solasodine tích lũy trong tế bào cao hơn trong... 1.3 C Y C GAI LEO 1.3 Đ điể sinh họ ố 1.3.1.1 N p ố Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà (Solanaceae), còn có tên khoa học khác là Solanum procumbens Ngoài ra, cà gai leo còn có nhiều tên gọi địa phương khác như: cà quánh, cà quạnh, cà quýnh, cà bò, cà cạnh, cà hải nam, cà gai dây [2] Cà gai leo mọc rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đường, ở độ cao dưới 300 m Phân bố ở Bắc Giang... vòng/phút 3.3 Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo không x lý elicitor sau 7 tuần nuôi cấy 42 (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo 3.4 trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D bổ sung 50 µM MeJA (lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc 44 độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy 3.5 3.6 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50... 3.9 Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 3g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy 50 (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo 3.10 trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D bổ sung 150 µM SA (lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc 53 độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy 3.11 3.12 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung