Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Phần I: Mở Đầu Cuộc sống ngày phát triển, nhu cầu tạo gốc vườn nhỏ mang màu xanh thiên nhiên vào nhà người dân ngày cao.Vốn nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc phong phú lại tốn diện tích nên việc chọn trồng tạo vườn lan nhỏ khn viên nhà lựa chọn nhiều cá nhân, nhiều hộ gia đình.Trong số loại phong lan ni trồng nước ta nay, bên cạnh lồi tương đối dễ trồng Mokaro, Dendro, lan Vũ Nữ…thì có lồi lan thích hợp với số khu vực địa lý định, cụ thể Địa Lan – lồi hoa ni trồng điều kiện lí tưởng Đà Lạt [4] Khơng q kén chọn hạn chế nơi trồng Địa Lan song Hồ Điệp giống lan q lại khó trồng Do đó, đòi hỏi người trồng phải có đơi chút am hiểu lồi hoa này.Thích hợp với điều kiện nhà lại giống lan u thích khơng màu sắc, kiểu dáng mà mang nét đẹp sang trọng, trang nhã Chính vậy, Hồ Điệp nhanh chống trở thành sản phẩm trồng trọt nhiều người ưa chuộng mang lại hiệu kinh tế cao khơng Việt Nam mà nhiều nước giới như:Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ…Bên cạnh đó, hoa Hồ Điệp lâu tàn, độ bền bơng cao, giàu sức quyến rũ nên lựa chọn làm vật trang trí, tạo cảnh quan ngày lễ, tết.Vốn lồi khó nhân giống Hồ Điệp thường cho hệ số nhân thấp điều kiện vườn ươm Để có số lượng lớn giống đồng bệnh đáp ứng nhu cầu thị trường vấn đề thật nan giãi Do đó, việc nhân giống kỷ thuật ni cấy mơ đời tạo hàng loạt ổn định mặt di truyền, bệnh, giá lại phải hữu ích Xuất phát từ thực tiễn cộng với đam mê thân mình, tơi tiến hành tìm kiếm sưu tập từ đưa đề tài: “Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp” SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Phần II: Nội Dung II.1 Tổng quan tài liệu 1.1 Lịch sử thành tựu ni cấy mơ [5] 1.1.1 Trên giới  Năm 1902, nhà thơng thái Haberlant lần đưa ý tưởng cấy mơ sinh vật ngồi thể ơng dùng tế bào q chun biệt nên khơng thành cơng Mơ động vật cấy trước tiên A.Carrel(1919), đến năm 1934 mơ thực vật ni cấy  Năm 1934 White thành cơng việc phát sống vơ hạn việc ni cấy tế bào rễ cà chua  Năm 1964 Ball người tìm mầm rễ từ ni cấy chồi Ơng thành cơng trơng việc chuyển sen cạn White Lupin từ mơi trường ni cấy tối thiểu, nhiên việc nhân giống chưa hồn chỉnh Sau đó, nhiều nhà nghiên cứu khám phá thành phần dinh dưỡng qua trọng cần thiết cho phát triển tế bào ni cấy (White (1951),Gauthere (1939),Van Overbeck (1941), Steward Caplin (1951))  Năm 1951, Skoog Miller phát hợp chất điều khiển nảy chồi  Năm 1962, Murashige Skoog cải tiến mơi trường ni cấy đánh dấu bước tiến kỷ thuật ni cấy mơ Mơi trường họ dùng làm sở cho việc ni cấy nhiều loại sử dụng rộng rải ngày  Năm 1960-1964, Morel cho nhân giống vơ tính lan ni cấy đỉnh sinh trưởng.Từ kết đó, lan xem ni cấy mơ thương mại hố Từ đến nay, cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật phát triển với tốc độ nhanh nhiều khác (Haramaki(1971), Murashige(1972), Miller Murashige (1976)) ứng dụng thương mại hóa 1.1.2 Ở Việt Nam Ni cấy mơ tế bào thực vật phát triển Việt Nam sau chiến tranh giới kết thúc (1975) Phòng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào xây dựng viện sinh học, viện khoa học Việt Nam(KHVN) tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Bước đầu tập trung nghiên cứu vấn đề ni cấy bao phấn, ni cấy mơ sẹo protoplast Các kết ni cấy thành cơng bao phấn lúa thuốc cơng bố năm 1978 (Lê Thò Muội cs,, 1978; Lê Thò Xuân cs,, 1978) Tiếp thành cơng protoplast thuốc khoai tây (Lê Thị Muội Nguyễn Đức Thành(1978),Nguyễn Đức Thành Lê Thị Muội 1980,1981).Trong thời gian phân viện KHVN Tp.HCM, muội nửa Đại học Nơng SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Nghiệp I (ĐHNNI) Hà Nội Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nơng Nghiệp Việt Nam (KHKTNNVN) phòng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thành lập chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Hiện nay, có nhiều phòng thí nghiệm ni cấy mơ khơng trường đại học viện nghiên cứu (viện Di Truyền Nơng Nghiệp(DTNN), viện Rau Quả Trung ương(RQTƯ)) mà số tỉnh sở sản xuất(n Bái ,Hưng n, Thanh Hóa….) Giữa năm 1980 trở lại đây, hướng nghiên cứu ứng dụng ni cấy mơ tế bào thực vật phát triển mạnh Những kết khích lệ đạt lĩnh vực vi nhân giống khoai tây(viện Cơng Nghệ Sinh Học (CNSH), ĐHNNI, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện CNSH, ĐHNNI, viện KHKTNNVN, viện RQTƯ) số hoa phong lan (phân viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm Chướng(viện CNSH, viện DTNN) cơng nghiệp bạch đàn (viện DTNN, viện Lâm Nghiệp) Một số kết bước đầu ghi nhận lỉnh vực chọn dòng tế bào chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy cs,, 1994), chọn dòng chịu muối ,chịu nước (Nghuyễn Tường Vân cs ,,1994; Đinh Thị Phòng cs,, 1994) Các kết dung hợp lai tế bào chất chuyển gen lục lạp củng thu kết lý thú (Nguyễn Đức Thành cs,, 1988; Nguyễn Đức Thành cs,, 1993, 1997) ni cấy bao phấn để tạo dòng ứng dụng nhiều viện CNSH DTNN Ni cấy dược liệu q để bảo tồn nguồn gen tạo tế bào có hàm lượng chất sinh học quan trọng cao phát triển 1.2 Các giai đoạn nhân giống invitro [5] Cho tới việc nhân giống invitro áp dụng cho nhiều loại (350 lồi, Murashige (1974) chia quy trình nhân giống làm giai đoạn :  Ni cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi  Nhân nhanh chồi, cụm chồi điều kiện invitro  Tạo hồn chỉnh, huấn luyện  Phục hồi, chuyển trồng điều kiện tự nhiên 1.3 Các phương pháp nhân giống invitro [5] 1.3.1 Ni cấy đỉnh sinh trưởng Một phương thức dễ dàng đạt mục tiêu ni cấy mơ tế bào thực vật ni cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm ni cấy chồi đỉnh ni cấy chồi bên) Sau vơ trùng, mẫu ni cấy mơi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khống vơ hữu mơi trường khống có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ đỉnh sinh trưởng, sau thời gian ni cấy định mẫu phát triển thành chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển thân, rể để thành hồn chỉnh Cây chuyển dần đất thích nghi bình thường SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 1.3.2 Ni cấy mơ sẹo Mơ sẹo khối tế bào phát triển vơ tổ chức, hình thành phân hóa tế bào phân hóa Mơ sẹo phát triển nhanh mơi trường có diện auxin Khối mơ sẹo có khả phát triển thành hồn chỉnh điều kiện mơi trường khơng có chất kích thích tạo mơ sẹo Ni cấy mơ sẹo thực loại thực vật khơng có khả nhân giống thơng qua ni cấy đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mơ sẹo có đặc tính giống mẹ Từ cụm tế bào mơ sẹo tái sinh lúc nhiều chồi ni cấy đỉnh sinh trưởng, nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao 1.3.3 Ni cấy tế bào đơn Khối mơ sẹo ni cấy mơi trường lỏng đạt máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp tách thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi tế bào đơn.Tế bào đơn lọc ni cấy mơi trường đặc biệt để tăng sinh khối Với chất thích hợp bổ sung vào mơi trường, tế bào có khả sản xuất chất có hoạt tính sinh học Sau thời gian ni cấy kéo dài mơi trường lỏng tế bào đơn tách trải mơi trường thạch + Khi mơi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm có mơ sẹo + Khi mơi trường thạch có tỷ lệ cytokinine/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả tái sinh thành hồn chỉnh 1.3.4 Ni cấy protoplast-chuyển gen Protoplast (tế bào trần) tế bào đơn tách vỏ cellullose, có sức sống trì đầy đủ chức sẵn có Trong điều kiện ni cấy thích hợp, protoplast có khả tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia tái sinh hồn chỉnh (tính tồn thể thực vật) Khi tế bào chất vách tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả dung hợp với tạo tế bào lai, đặc tính cho phép cải thiện giống trồng Q trình dung hợp protoplast thực hai đối tượng lồi hay khác lồi 1.3.5 Ni cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn thực vật ni cấy mơi trường thích hợp tạo mơ sẹo Mơ sẹo tái sinh thành hồn chỉnh đơn bội II.2 Tìm hiểu nhân giống lan Hồ Điệp 2.1 Nguồn gốc đặc điểm lan Hồ Điệp [4] 2.1.1 Nguồn gốc SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Lan Hồ Điệp giống lan có tên gọi Phalaenopsis, thuộc họ phụ Vandeae Tên gọi Phalaenopsis bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp Phalaina có nghĩa “con bướm” Opsis có nghĩa “giống như” Lan Hồ Điệp khám phá năm 1750, ơng Rumphius đặt tên Angraecum album, năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum, 1825 nhà thực vật Hà Lan định danh lại Phalaenopsis Lồi hoa có xuất xứ miền Bắc Australia, Ấn Độ nước Đơng Nam Á Philippine, Inđơnêsia, bán đảo Đơng Dương Q hương lan Hồ Điệp nước vùng Đơng Nam Á, rừng Việt Nam khơng có lồi Phalaenopsis amabilis, có lồi tương tự biết Phaenopsis mannii, Phalaeopsis gibbosa, Phalaenopsis lobbi, Phalaenopsis fuscata Phalaenopsis cornu-cervi Lan Hồ Điệp trồng nơi giới, hầu hết Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan Mỹ Cây ni cấy mơ nhiều nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan…Hiện giống Hồ Điệp có 70 lồi ngày lai tạo nhiều 2.1.2 Đặc điểm  Lan Hồ Điệp đơn thân, ngắn, to, dày, mọc sát vào Hoa nở ln phiên hết đến khác, thời kì nở hoa thay đổi theo lồi thường nở vài tháng Phát hoa mọc từ nách lá, dài, chùm hoa nở cái, đài to tròn, hai cánh x rộng kín, sắc đẹp Mơi hoa cong dẹp có hai râu dài nên đóa hoa giống bươm bướm Hai hàng hoa xếp đặn bên cành, khẽ đong đưa đàn bướm xinh xắn bay lượn chập chờn Trụ có hình bán nguyệt với hai phân khối u lên, chứa đầy phấn hoa Số hoa cành biểu thị sức sống Số lượng nhiều sung sức Riêng đặc tính phân nhành hoa lại tùy thuộc nhiều vào loại giống  Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, khơng thua giống lan khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến loại Hồ Điệp có sọc nằm ngang thẳng đứng, có đốm to hay nhỏ…Lan Hồ Điệp sinh trưởng chậm, khoảng 40 ngày với điều kiện chăm sóc tốt mọc thêm hồn chỉnh Khi có phân hố mầm hoa Lồi lan có độ bền bơng cao điều kiện thích hợp, thích hợp để trồng nhà, dễ hoa Nhưng vốn lồi hoa khó tính 2.2 Điều kiện sinh thái [5] 2.1 Nhiệt độ [3] Lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ miền nhiệt đới, nhiệt độ thích hợp để trồng Lan Hồ Điệp tương đối cao, nhiệt độ thích hợp để trồng ban ngày từ 25-280C, ban đêm 18-200Cgiai đoạn ươm non cần nhiệt độ ban đêm khoảng 230C Nếu nhiệt độ nhà trơng nhỏ 150C rễ ngừng hút chất dinh dưỡng, q trình sinh trưởng ngừng lại, chí bị lạnh hại làm rụng hoa làm cho cánh hoa xuất đốm nhỏ ảnh hưởng đến vẽ đẹp hoa, giai đoạn phấn hoa đòi hỏi phải có SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp cách biệt cao độ lêch nhiệt độ ngày /đêm, nhiệt độ ban ngày thích hợp 25 0C, ban đêm 10-200C, kéo dài 3-6 tuần có lợi cho phân hóa hoa 2.2 Nước tưới Hồ Điệp lồi đơn thân, khơng có giả hành nên khơng dự trữ nước, diện tích bốc lớn chúng khơng có mùa nghỉ phải cung cấp cho khơng lượng nước đầy đủ thường xun suốt năm Trong mùa mưa ngày phải tưới cho chúng lần, trừ ngày có mưa, lần vào sáng, lần vào chiều Tưới đảm bảo khơ trời tối đọng nước nách suốt đêm gây thối rữa Vào mùa nắng, nên tưới cho chúng ngày lần Điều kiện nước tương đối quan trọng, Hồ Điệp khơng thể chịu độ ẩm lắng đọng (nhất ban đêm), đễ tạo điều kiện cho bệnh thối rữa phát triển Tốt ba ngày ta nên pha Dithane M45, Maneb, Captan vào nước tưới với nồng độ 1/400 để ngừa chứng bệnh nói Nên nhớ, Hồ Điệp lồi lan thích hợp với giá thể nước tưới có pH thấp (pH=5,2) phải dùng axít phơtphoric để giảm pH nước Ở nước ta, vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh hơn, giọt mưa nặng hạt khơng phần nguy hiểm đa số loại Hồ Điệp bị chết mưa đầu mùa Đây hình thức tưới thiên nhiên mà ta khơng kiểm sốt Do để ngừa tình trạng trên, mái giàn che Hồ Điệp nên dùng tơn nhựa xanh, loại trừ trận mưa khơng cần thiết tạo tia sáng khuếch tán lý tưởng Vào mùa khơ, ta trì mức độ tưới đặn mùa mưa, lúc ẩm độ khơng khí giảm xuống rõ rệt Do đó, tăng số lần tưới nhằm mục đích tạo cho tăng trưởng liên tục Nếu có trạng thái thiếu nước, ủ rũ bạn nên chuyển sang vị trí khác tăng số lần tưới lên Một lần tưới bổ sung vào trưa mùa khơ thích hợp cho phát triển Hồ Điệp 2.3 Ánh sáng [3] Lan Hồ Điệp kỵ ánh sáng chiếu thẳng trực tiếp, phải có biện pháp che sáng đồng thời tùy thuộc vào lớn nhỏ mà có biện pháp điều chỉnh ánh sáng cho thích hợp Thời kỳ ươm non nhu cầu ánh sáng có cường độ 10.000-12.000 lux, giai đoạn bánh tẻ 12.000-20.000 lux, giai đoạn thúc hoa 20.000-30.000 lux Trong điều kiện trồng nhà lưới, mùa hè mùa thu phải che 75-85% ánh sáng, cần phải có hai lớp che sáng đặt chồng lên nhau, mùa đơng xn ánh sáng yếu cần che 40-50% đủ SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 2.4 Độ thơng thống Rất cần thiết Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn (phõng lá), thơng thống giúp mau khơ sau tưới rễ khơng bị úng nước nên hạn chế bệnh nhiều Ở nước ta vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh giọt mưa nặng hạt làm thối đọt Do để ngăn ngừa tình trạng nên dùng tơn nhựa xanh để che Có số trường hợp trồng Hồ Điệp cao (sân thượng) có hiệu Tuy nhiên gió nhiều mạnh dễ làm nước nhanh ta khơng cung cấp đủ héo rũ, nhăn 2.5 Dinh dưỡng Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xun, quanh năm khơng có mùa nghỉ Khi tưới phân khơng nên tưới với nồng độ cao đừng tưới lên đọt, lúc non nhú từ đỉnh sinh trưởng Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ lỗng tưới nhiều lần tuần Có thể tưới thêm phân hữu như: bánh dầu 15 ngày/lần, vitamin B1, kích thích rễ… Cách tưới phân + Thời kỳ 12 tháng tuổi cần dùng N, P, K với tỷ lệ cao 30-10-10, sau dùng phân N, P, K với tỉ lệ 20-20-20 18-18-18 lúc hoa Tuy nhiên vào mùa mưa tưới phân 30-10-10 thấy yếu mềm q tăng cường lượng lân kali cách xen kẽ phân 20-20-20 18-18-18 (dù con), để cứng cáp, tăng cường sức đề kháng sâu bệnh + Lúc trưởng thành (18-24 tháng tuổi) vào thời điểm cuối năm, thời tiết lạnh kích thích hoa cách tưới phân 10-30-30, đến bắt đầu nhú cành hoa ta trở lại tưới phân 20-20-20 lúc hoa nở tàn Khơng nên để cành hoa lâu q cây, nụ hoa cuối nở có 1, hoa bắt đầu héo, ta nên cắt cành hoa bỏ để dưỡng sức cho Khi cắt cành hoa sớm mau sinh trưởng tốt để lần hoa sau mạnh 2.2.6 Sâu bệnh Đối với phong lan, việc phòng bệnh quan trọng, bị bệnh khó trị làm chết Ngồi việc chăm sóc lan kỹ lưỡng đặn, tưới nưới dinh dưỡng cần phải tưới thêm thuốc trừ nấm bệnh nhằm tăng sức đề đề kháng cho Lan Hồ Điệp hay bị bọ trĩ chích tạo vết thương từ vi khuẩn xâm nhập gây bệnh thối nhũn Có thể dùng số loại thuốc để phòng trị Malathion, lannat… để phòng trị 2.2.7 Chậu, giá thể, cách trồng Cách trồng chung cho loại Hồ Điệp chậu thật thống, có nhiều lỗ sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa Chậu phải thật khơng có rêu bám thành chậu Thơng thường nhà vườn trồng lan với số lượng SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớ, xơ dừa, mút… làm giá thể để trồng lan Hồ Điệp Có nhiều cách trồng lan Hồ Điệp tuỳ theo vùng Nhưng có điểm chung than, mút nằm đáy chậu, xơ dừa hay dớn nằm miệng chậu cách trồng giúp nước tốt vào mùa mưa, khơng bị thối rễ phát triển tốt Trong thời gian khoảng năm ta thay chậu lần, lớn q mau thay chậu sớm 2.3 Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp Việt Nam [5] Hiện nay, TP.HCM lan Hồ Điệp xem trồng chiến lượt việc chuyển đổi cấu trồng vật ni Đây trồng đem lại hiệu cao gấp 2-3 lần so với việc trồng lúa, hoa màu v.v Trong xu đất trồng ngày hẹp lan khơng chiếm diện tích đất nhiều nên giải pháp hiệu Khơng đẹp màu sắc, hình dáng, hoa lâu tàn… giá thành rẻ nên ngày ưa chuộng ni trồng Tại TP.HCM tỉnh lân cận có nhiều vườn trồng Hồ Điệp với qui mơ từ vài trăm đến vài nghìn Điển hình cơng ty Lâm Thăng Đài Loan đầu tư cơng ty Kim Ngân chun trồng lan Hồ Điệp, hàng năm cung ứng cho thị trường từ vài ngàn đếm vài chục ngàn cây, vào dịp Tết Ngun Đán Tuy nhiên khơng có liên kết nhà vườn nên sản phẩm làm khơng tìm thị trường tiêu thụ, cung cầu khơng hợp lý Về nguồn giống nước ta khơng đầu tư nên giống khơng đạt chất lượng tốt, giống khơng nhiều nên nhà vườn thường nhập giống từ nước Thái Lan, Đài Loan…Ngồi hàng năm việc nhập hoa từ nước ước tính tiêu tốn hàng triệu USD So với nước có ngành trồng lan phát triển Đài Loan hay Thái Lan ngành trồng nước ta cần phải học hỏi nhiều cần phải có sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu kinh tế cao 2.4 Nhân giống invitro lan Hồ Điệp 2.4.1 Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [14] 2.4.1.1 Vật liệu phương pháp ni cấy Trục phát hoa Hồ Điệp lai cắt hoa gần tàn Các mắt làm tẩy trùng phương thức Scuully, có loại chồi khác khúc mắt dùng thí nghiệm  Chồi ngun vẹn dùng để kiểm chứng  Chồi bị làm chấn thương cách cắt bỏ 2/3 chồi theo mặt cắt song song với trục phát hoa mặt cắt nghiêng với hướng mọc gốc α  Chồi bị làm chấn thương cách cắt chồi làm hai mặt cắt theo trục  Đâm dọc chồi kim nhọn từ đỉnh xuống gốc 2.4.1.2 Điều kiện ni cấy SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp  Mơi trường Murashige Skoog( M+S)  Mơi trường Knudson C  pH:5.8  Ánh sáng: 5000 1m/m2  Quang kỳ : 14  Nhiệt độ: 2100C  Dụng cụ chứa đựng mơi trường lọ thuốc nhỏ chứa 10ml 2.4.2 Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm điều kiện invitrro [3] Trong tự nhiên hạt lan nảy mầm (chỉ nảy mầm 1-2%) hạt lan khơng có chứa anbunin phơi chưa phân hóa, có kích thước nhỏ nên khó chứa chất dự trữ Vì vậy, tự nhiên hạt lan Hồ Điệp nảy mầm phải cộng sinh với nấm Rhizoctonia mucoroides Nấm cung cấp đường để ni cây, phân giải chất hữu khó hấp thu Bù lại cung cấp nước cho nấm, chỗ khống chất mà thu từ sương Dựa ngun tắc này, phòng thí nghiệm ni cấy mơ tạo mơi trường gieo hạt lan Hồ Điệp mơi trường dinh dưỡng nhân tạo với tỉ lệ cao 2.4.2.1.Tiến hành  Chọn lan: Chọn tháng tuổi, căng đều, khơng bị nứt vở, khơng bị sâu bệnh làm ngun liệu để gieo hạt  Khử trùng : Dùng cồn 750 rửa quả, khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% 10 phút Rửa lại nước vơ trùng lần, thấm khơ giấy thấm vơ trùng Dùng dao tách vỏ để lấy hạt nhỏ li ti bên gieo mơi trường chuẩn bị sẵn  Để gieo hạy lan sử dụng loại mơi trường nền: Knudson, VacineWent (VW), Murashige –Skoog ( MS) có bổ sung thêm đường chất hữu như: Dịch nghiền khoai tây, chuối , cà rốt, nước dừa, pepton… 2.4.3 Ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm nhân giống Hồ Điệp lai [2] 2.4.3.1 Hệ thống ni cấy Hệ thống ngập chìm tạm thời sử dụng nghiên cứu hệ thống bình ni cấy Plantima cơng ty A-tech Bioscientific Đài Loan sản xuất Hệ thống gồm phận chủ yếu sau: Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy mơi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy ngược lại, timer dùng để điều khiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn van điều khiển, màng lọc thống khí vơ trùng, bình Platima nhựa polycarbonate gồm có ngăn, ngăn chứa mơi trường lỏng ngăn chứa mẫu thực vật SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Bằng cách điều chỉnh tự động áp lực khơng khí thơng qua máy bơm, mơi trường lỏng từ ngăn bơm lên ngăn chứa mẫu cấy đạt đến thời gian ngập chìm tạm thời dung dịch quay trở lại ngăn Trong giai đoạn dung dịch ngập mẫu có trao đổi khơng khí, mẫu xoay chuyển nhẹ làm khơng khí bên bình ni cấy, dòng khí vào khử trùng nhờ cách lọc vơ trùng 0,45µm Thời gian ngập chìm tần suất ngập chìm điều khiển timer Hình 1: Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập[11] 2.4.3.2 Mẫu cấy lan Hồ Điệp Đối tượng thí nghiệm lồi lan Hồ Điệp lai có tên gọi Doritaenopsis Taida Salu Mẫu cấy gồm có :  Protocorm – like bodies –PLBs giống Dtps Taida Salu  Mẫu cấy chồi lấy thí nghiệm tái sinh chồi từ PLBs hệ thống khác mơi trường tái sinh chồi 2.4.3.3 Phương pháp thí nghiệm A Khảo sát nhân nhanh PLBs hệ thống ni cấy khác Thí nghiệm khảo sát nhân nhanh PLBs hệ thống ni cấy khác tiến hành nhằm so sánh hiệu việc nâng cao hệ nhân chất lượng PLBs hệ thống TIS so với hệ thống nhân giống mơi trường thạch hệ thống ni cấy lỏng lắc Đồng thời khảo sát thơng số tối ưu cho việc nhân PLBs hệ thống TIS Mật độ mẫu cấy tần xuất ngập chìm SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 10 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Kết cho thấy nghiệm thức sử dụng 6g PLBs cho kết tạo 986,35 PLBs tính 1g PLBs ban đầu sau tuần ni cấy lượng PLBs tạo thành vừa đủ lấp kín khơng gian bình TIS, PLBs có màu xanh tốt, dạng tròn Mật độ thích hợp cho việc nhân PLBs bình TIS Khi sử dụng 6g PLBs để ni cấy bình Plantimia có chứa mơi trường để nhân PLBs tích 200ml, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng:  Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ cho hệ số nhân PLBs tăng nhiều (8545 PLBs) so với chu kỳ ngập lần, PLBs chủ yếu dạng trong, mọng nước khó chuyển sang dạng chồi để phát triển thành hồn chỉnh Như tần số ngập chìm cao gây thủy tinh thể cho mẫu cấy  Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ giờ, PLBs bị trương to bình thường  Thời gian ngập chìm phút với chu kỳ cho chất lượng PLBs tốt nhất, chồi xanh tốt phát triển bình thường Bảng 7: Khảo sát ảnh hưởng tần xuất ngập chìm hệ thống lên việc nhân PLBs Nghiệm thức Trọng tươi (g) phút /10 phút /5 phút /10 lượng Số PLBs thành hình Số chồi Nhận xét 50,85 ± 5,31 6276,98 ± 413,26b 125,28 ± 11,65 PLBs xanh tốt 42,27 ± 6,27 6112,30 ± 326,41b 82,96 ± 6,57 PLBs xanh tốt 8545,68 ± 612,45a 187,89 ± 9,60 PLBs to, số có dạng mọng nước 68,18 ± 6,96 Tóm lại việc nhân PLBs hệ thống TIS cho kết tối ưu thời gian ngập từ 5-10 phút với chu kỳ giờ, thể tích ni cấy 200ml mật độ 6g PLBs Sau tuần ni cấy bình Plantima cho khoảng 6100 PLBs từ 600PLBs ban đầu, tức từ PLBs ban đầu tạo 10-11 PLBs mới, so sánh mơi trường thạch, thơi gian ni cấy, thể tích mật độ, sau tuần thu 2200 PLBs tức PLBs ban đầu tạo 3-4 PLBs so sánh với ni cấy lỏng lắc bình tam giác 250ml với thể tích mơi trường 40ml từ PLBs ban đầu tạo 7-8 PLBs Vậy, ni SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 19 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp cấy hệ thống TIS cho tỉ lệ nhân PLBs gấp lần mơi trường thạch gấp 1,3 lần mơi trường lỏng Bảng 8: Ảnh hưởng hệ thống ni cấy khác lên nhân nhanh PLBs sau tháng ni cấy Hệ thống ni cấy Số PLBs tạo / 1PLBs ban đầu Lỏng lắc 8,3 ± 0,58 TiS 10,2 ± 1,55 Thạch 3,6 ± 0,31 2.5.3.2.Khảo sát tái sinh chồi từ PLBs hệ thống TIS Trên hệ thống TIS, từ PLBs ban đầu nhiều tái sinh cho lượng tái sinh vượt trội so với ni cấy mơi trường thạch Khảo sát mật độ PLBs sử dụng cho giai đoạn tái sinh chồi bình TIS ghi nhận kết bảng sau: Bảng 9: Ảnh hưởng mật độ PLBs lên tái sinh chồi nhân chồi hệ thống TIS Nghiệm thức 20 PLBs 30 PLBs 50 PLBs Đối chứng thạch (30 PLBs) Tỉ lệ PLBs tái Trọng lượng tươi Số chồi sinh chồi (%) (g) /PLBs ban đầu 100 100 100 100 SVTH: Bùi Thị Thu Nhi 11,54 ± 2,19 18,41 ± 2,67 31,25 ± 5,10 7,24 ± 1,04 Lớp 07S1 Nhận xét 4,35 ± 0,38ab Cụm chồi xanh tốt, tròn mượt, có rễ 4,66 ± 0,71ab Cụm chồi xanh tốt, tròn mượt, có rễ 6,30 ± 0,64a Cụm chồi xanh tốt nhỏ nghiệm thức 20, 30 PLBs 1,73 ± 0,26c Lá bị dún lại, thân chồi kéo dài 20 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Trong bình Plantima mật độ 50 PLBs cho trung bình số tái sinh từ PLBs ban đầu 6,3 so với 1,73 PLBs mơi trường thạch (gấp 3,6 lần) Thêm vào đó, sinh trưởng phát triển chồi tái sinh hệ thống TIS vượt trội bình tam giác tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng Bảng 10:Ảnh hưởng tần xuất ngập chìm lên tái sinh chồi từ PLBs Nghiệm thức Trọng lượng tươi(g) Số chồi/ PLBs Nhận xét Chồi xanh tốt, có PLBs dạng cụm / phút 25,48 ± 4,84 3,17 ± 0,66c / phút 34,39 ± 6,79 6,46 ± 0,64 a Chồi xanh tốt /3 phút 28,17 ± 4,05 4,46 ± 0,60 b Chồi xanh tốt Kết cho thấy: Tần xuất ngập phút chu kỳ cho kết số chồi tạo thành PLBs cao nhất.Chu kỳ ngắn (4 giờ) hay dài (8 giờ) cho kết tạo chồi thấp hẳn Điều cho thấy với chu kỳ cho ngập lần mẫu cung cấp chất dinh dưỡng thường xun số chồi tạo PLBs 3,17 từ gốc lại tiếp tục tạo thêm PLBs mới, chu kỳ cho ngập lần cho số chồi tạo thành 4,46 so với chu kỳ (6,46 chồi) có lẽ thời gian q dài lần bơm (8 giờ) làm mẫu khơng cung cấp dinh dưỡng thống khí cần thiết cho phát triển mẫu, PLBs tái sinh tiếp tục tạo thêm chồi nách chồi phát triển đồng dẫn đến trọng lượng tươi mẫu gia tăng đáng kể (34,39) Trong hệ thống TIS, mơi trường khơng khí ln ln có trao đổi bên bên ngồi bình thơng qua hệ thống bơm màng lọc, chồi Hồ Điệp tái sinh hệ thống TIS phát triển tốt so với bình tam giác kín thơng thường thể qua têu bảng 11 Hình 6: PLBs nhân nhanh hệ thống ni cấy TIS.[7] SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 21 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Bảng11: Ảnh hưởng hệ thống ni cấy khác lên tái sinh chồi từ PLBs sau tháng ni cấy Hệ thống ni Số chồi /mẫu Chiều cao thân cấy cấy (mm) Chiều cao (mm) Bình tam giác (mơi trường thạch ) 1,73 ± 0,36 ± 0,14 TIS (mơi trường lỏng) 6,30 ± 0,23 ± 0,24 Chiều rộng (mm) ± 0,5 ± 0,22 Hình 7: Chồi tái sinh từ PLBs hệ thống TIS bình tam giác.[7] a1, a2, a3 :Chồi tái sinh từ PLBs hệ thống TIS b: Chồi tái sinh từ PLBs bình tam giác 2.5.3.3 Khảo sát rễ chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs hệ thống TIS Kết thí nghiệm từ hệ thống ni cấy khác lên sinh trưởng phát triển chồi Hồ Điệp cho thấy hệ thống có nhiều thơng thống chồi Hồ Điệp sinh trưởng phát triển tốt Ở hệ thống TIS nhờ hệ thống bơm đẩy mơi trường lên để tạo ngập chìm cho mẫu cấy, q trình bơm mơi trường khí bình trao đổi nên bình có thơng thống nhiều so với bình tam giác Những Hồ Điệp hệ thống TIS có độ thơng thống tốt phát triển mạnh so với bình tam giác khơng thống khí thể tiêu chiều cao, chiều dài chiều rộng lá, số rễ chiều dài rễ Bảng 12: Ảnh hưởng tần suất ngập chìm lên rễ phát triển chồi Hồ Điệp SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 22 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Nghiệm thức Trọng lượng Số chồi / số Chiều rộng Chiều dài rễ Tình tươi (g) chồi ban đầu (cm) (cm) trạng /3 47,39 ± 6,27 phút 3,79 ± 0,65a 0,68 ± 0,06b 0,92 ± 0,16c Xanh mướt /3 60,19 ± 7,78 phút 3,39 ± 0,59a 0,97 ± 0,09a 2,62 ± 0,29a Xanh mướt /3 43,23 ± 5,39 phút 2,59 ,26b 0,77± 0,05b 1,67 ± 0,14b Xanh mướt ± Bảng 13: Ảnh hưởng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời lên sinh trưởng phát triển chồi Hồ Điệp sau tháng ni cấy Hệ thống Chiều cao Chiều rộng Chiều dài ni cấy thân (mm) (mm) (mm) Bình tam giác 15 ± 0,4 500ml TIS 20 ± 0,6 Số rễ Chiều dài rễ (mm) ± 0,2 11 ± 0,3 10 ± 0,1 9,8 ± 0,4 15 ± 0,7 26 ± 0,2 Hình 8: Sự sinh trưởng phát triển chồi Hồ Điệp hệ thống TIS bình tam giác 500 ml [7] a : Cây Hồ Điệp hệ thống TIS b : Cây Hồ Điệp bình tam giác 500 ml SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 23 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Hệ thống ngập chìm tạm thời hội tụ đủ điều kiện cần thiết ngập khơng q lâu, thống khí tốt giúp khơng bị thủy tinh thể, tăng cường khả quang hợp nên phát triển đặn, thích hợp cho q trình tạo rễ khỏe mạnh trước đưa vườn ươm Tóm lại, ni cấy hệ thống TIS giúp phát triển nhanh mạnh ni cấy hệ thống kín thơng thường giúp rút ngắn thời gian để đạt kích thước để đưa vườn ươm 2.5.4 Nhân nhanh phơi Protocorm – like body lan Hồ Điệp hệ thống Bioreactor [1] 2.5.4.1 Xác định mơi trường tối ưu tăng sinh phơi PLB Sau tuần ni cấy, tiêu trọng lượng tươi, đường kính phơi PLB P.amabilis trình bày bảng sau Bảng 14: Ảnh hưởng BA lên tăng sinh phơi PLB mơi trường ni cấy bổ sung 0,5 mg /l NAA 20 % nước dừa sau tuần ni cấy Mơi trường Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét 3874a Phơi PLB tạo thành có màu vàng nhạt xanh thẫm, khơng có cụm lơng xum quanh Đường kính từ 1-1,5 mm 3812b Phơi PLB tạo thành có màu vàng nhạt xanh thẫm, vài PLB có cụm lơng xum quanh Đường kính từ 1-2 mm V3 3420c Một số PLB lớn có màu xanh thẫm xuất PLB có độ đồng lớn, đường kính mm V4 2597d PLB tạo thành chưa hồn thiện, khơng có cấu trúc rõ ràng V1 V2 Ghi chú: Những mẫu tự khác nêu cột biễu diễn khác có ý nghĩa với α =0,05 Duncan, s test Bảng 15: Ảnh hưởng NAA lên tăng sinh phơi PLB mơi trường ni cấy bổ sung 2,0 mg / l BA 20 % nước dừa sau tuần ni cấy SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 24 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Mơi trường Trọng lượng tươi (mg) V5 V6 V7 Nhận xét 4312a PLB tạo thành có màu xanh thẫm, có cụm lơng xum quanh, đường kính 1-1,5 mm 3812b Phơi PLB tạo thành có màu vàng nhạt xanh thẫm, vài PLB có cụm lơng xum quanh Đường kính 1-2 mm 4289a PLB tạo thành có màu xanh thẫm, có cụm lơng xung quanh, đường kính từ 11,5 mm Hình 9: Sự phát sinh phơi PLB mơi trường khác nhau.[8] Kết thu nhận cho thấy, nghiệm thức V1 V2 PLB tạo thành có màu xanh đậm, khơng có cụm lơng xung quanh, đường kính PLB từ 1-1,5 mm Ở nghiệm thức, khối lượng PLB tạo lớn PLB phát triển Ở nghiệm thức V3, PLB tạo thành lớn hơn, phát triển hơn, có độ đồng cao có hình dạng rõ ràng Ở nghiệm thức V5 V7, khối lượng PLB tạo lớn nhất, có SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 25 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp phát triển đồng PLB, đường kính trung bình 1,5 mm Còn nghiệm thức V4 V6 phơi PLB chưa có phân hóa rõ ràng, cụm phơi PLB dính vào gây khó khăn cho q trình cấy chuyền mẫu q trình hình thành Ở nghiệm thức V8, PLB tạo thành có màu xanh thẫm, đường kính trung bình 1,5 mm, PLB đồng nhau, số PLB phát triển thành Điều giải thích tác động kích thích hình thành chồi cytokinin có nước dừa, nước dừa nồng độ cao ta thấy rõ điều so với nghiệm thức lại V9, V10và V11 Ở nghiệm thức này, phơi PLB nhỏ, cụm phơi PLB dính vào gây khó khăn cho q trình cấy chuyền q trình hình thành sau Còn nghiệm thức V12, có phân hóa phơi rõ ràng sinh khối tạo ít, khơng có hiệu Tóm lại, mơi trường MS bổ sung 2,0 mg /l BA, 1,0 mg/l NAA 20 % nước dừa mơi trường tối ưu cho tăng sinh phơi PLB lan Hồ Điệp P amabilis Bảng 16: Ảnh hưởng nước dừa lên tăng sinh phơi PLB mơi trường ni cấy bổ sung 2,0 mg /l BA 0,5 mg /l NAA sau tuần ni cấy Mơi trường Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét 4137a PLB tạo thành có màu xanh đậm Đường kính từ 1-1,5 mm Có hình thành từ PLB 3812b Phơi PLB tạo thành có màu vàng nhạt xanh thẫm PLB, số PLB có cụm lơng xum quanh Đường kính từ 1-2 mm 2480c Phơi va PLB tạo thành có màu vàng nhạt xanh thẫm PLB cụm lơng xum quanh Đường kính từ 1- 1,5 mm V11 1197d Phơi tạo thành có màu vàng nhạt khơng có tạo thành PLB Đường kính phơi từ 1- mm V12 850e PLB có màu xanh thẫm Có hình thành từ PLB V8 V9 V10 2.5.4.2 Ảnh hưởng hệ thống ni cấy bioreactor lên tăng sinh phơi PLB SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 26 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Một số ưu điểm hệ thống bioreactor là: Các thành phần mơi trường ni cấy sử dụng tối đa nhờ có đảo trộn q trình sục khí, mẫu cấy ngập mơi trường cấy lỏng khơng bị úng khơng xãy tượng thủy tinh thể Kết thu sau tuần ni cấy hệ thống bioreactor hệ thống đối chứng trình bày bảng Bảng 17: Những kết thu hai hệ thống ni cấy khác sau tuần ni cấy Khối lượng mẫu Hệ thống ni cấy Trước ni cấy Thu hoạch Đường kính phơi PLB (mm) Tỷ lệ sống Tỷ lệ tăng sót (%) sinh (%) Trước Thu ni cấy hoạch Bioreactor 36,00 172,19a – 1,5a 5,5a 58,32a 4,78a Đối chứng 36,00 67,19b – 1,5a -1,5b 26,55b 1,86b PLB lan Hồ Điệp thích hợp với hệ thống ni cấy bioreactor có sục khí liên tục ni cấy mơi trường thạch Với hệ thống bioreactor, khơng khí bên mơi trường ni cấy thay liên tục có thành phần CO2/ O2 gần giống với mơi trường bên ngồi, điều làm cho mơi trường thơng thống nên mẫu cấy có khả trao đổi khí nhiều hơn, mẫu cấy sinh trưởng phát triển tốt so với mơi trường thạch Các tiêu so sánh hai hệ thống ni cấy : tỷ lệ sống sót, tỷ lệ tăng sinh, kích thước phơi PLB Tỷ lệ sống sót (58,32), tỷ lệ tăng sinh (4,78 lần) đường kính (5,5 mm) phơi PLB hệ thống bioreactor cao tỷ lệ sống sót (26,55), tỷ lệ tăng sinh (1,86 lần), đường kính (1,5 mm) phơi PLB hệ thống đối chứng SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 27 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp [9] Hình 10: a) Sự tăng nhanh Phalaenopsis PLB hệ thống bioreactor (1lít kiểu cột) sau tuần b) Sự tái sinh tăng trưởng từ PLB hệ thống bioreactor; c) Sự thích nghi nhú 2.6 Hiệu kinh tế lan Hồ Điệp [4] Hồ Điệp khơng phổ biến Nam Mĩ, năm gần đây, Hồ Điệp trở thành loại hoa trồng chậu có giá trị ngành cơng nghiệp trồng hoa Hà Lan Chúng q xa xỉ nước Châu Á đặc biệt Nhật Bản Ngồi lồi hoa đẹp nhập vào Mỹ để trang trí chậu dạng q tặng cao cấp Ngày nay, hoa lan cắm chậu trở nên phổ biến hầu giới Người ta thấy Hồ Điệp nơi, truyền hình, nhà, vườn, tạp chí chí nơi bạn làm việc Chứng tỏ, ngày người nhận thức tầm quan trọng chậu hoa sống thường nhật Lan Hồ Điệp, lồi lan có độ bền bơng cao điều kiện thích hợp, lồi thích hợp để trồng nhà, dễ hoa Hơn nữa, vài thập kỉ gần cơng nghệ trồng lan phát tiển giúp người trồng giảm giá thành đáng kể loại lan nên giá phù hợp với người mê hoa hay người tập trồng, Hồ Điệp ưa chuộng trồng nhiều nơi Trước đây, Hồ Điệp có giá SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 28 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp cao, nên xem loại hàng hố cao cấp thị trường Trong 20 năm trở lại đây, cơng nghệ đại nghiên cứu giúp cho loại sản phẩm trở nên phổ biến với người tiêu dùng, đặc biệt ngày lễ Thêm vào đó, cơng nghệ lai giống gieo hạt ngày tạo nên nhiều chủng loại giống mới, bật màu hoa, kích thước hoa… Điều làm cho người tiêu dùng thích thú với thú chơi lan tạo nên sốt hoa lan thị trường giới Hồ Điệp trồng nơi giới, hầu hết Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan Mỹ Cây ni cấy mơ nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan sau lại xuất khầu cho nước khác với Mỹ để trồng hoa Hàng ngàn giống lai tạo dòng có giá trị thị trường Các nhà nhân giống gieo hạt nhiều giống Hồ Điệp có chất lượng hoa giống có giá trị tính trạng qui định màu sắc hoa, cấu trúc hoa, nhiều nhánh, nhiều vòi hoa, gần giống có hương thơm Cuộc chạy đua diễn hầu hết Đài Loan, điều dẫn đến hệ giống có giá trị khơng giá trị vài năm Màu sắc hoa tập trung màu chủ đạo : trắng, vàng, xanh, màu mơ chín, hồng, đỏ tươi hay nâu sẫm Hoa có màu hay pha trộn màu với nhau, chủ yếu khác vùng giữa, hay mép cánh hoa với nhiều cấu trúc khác chấm hay sọc cánh bơng Loại hoa lai tạo gần Harlequin, có màu trắng hay vàng với mép cánh bơng điểm xuyết chấm tròn ngẫu nhiên có giá cao thị trường Hình11: Mơ hình sản xuất lan Hồ Điệp.[10] SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 29 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Phần III: Kết Luận Từ thí nghiệm tơi thấy nhân giống Hồ Điệp nhờ hệ thống ni cấy ngập chìm hệ thống bioreactor tơt  Đối với nghiên cứu giống Hồ Điệp lai Dtps Taida Salu, ni cấy hệ thống TIS cho tỷ lệ nhân PLBs gấp lần mơi trường thạch gấp 1,3 lần mơi trường lỏng Đối với giai đoạn tái sinh chồi nhân chồi, hệ thống TIS cho tỷ lệ nhân chồi gấp 3,6 lần so với hệ thống ni cấy tên thạch Từ giúp gia tăng tỉ lệ lên 10,8 lần so với phương pháp truyền thống khác  Đối với hệ thống ni cấy bioreactor, mơi trường tối ưu cho nhân nhanh phơi PLB mơi trường MS bổ sung 2mg /l BA, 1mg /l NAA 20% nước dừa Từ kết tơi xin đưa quy trình nhân giống invitro lan Hồ Điệp sau Cây mẫu Quả Cành hoa Khử trùng kép Khử trùng MS +Knudson C (trục phát hoa) VW + 100ml + 10 g đường + 30 g KT + 1g pepton + 6,5 g agar ( gieo hạt ) Protocorm, chồi Nhân nhanh MS + 2,0 mg /l BA + 0,1 mg /l NAA +20% nước dừa (bioreactor ) MS 1/2 + nước dừa + pepton + dịch khoai tây + sucrose ( ngập chìm ) Cây giống in vitro Vườn ươm SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 30 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Tài Liệu Tham Khảo Tài liệu sách giáo khoa [1] Nguyễn Cửu Thành Nhân, Nguyễn Thanh Hải cộng (2007), trích “Cơng nghệ sinh học thực vật cơng tác nhân giống chọn tạo giống hoa”, Nhà xuất Nơng Nghiệp TP.HCM [2] Cung Hồng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu cộng (2007 ), trích “Cơng nghệ sinh học thực vật cơng tác nhân giống chọn tạo giống hoa”, Nhà xuất Nơng Nghiệp TP.HCM [3] Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), “Lan Hồ Điệp kỷ thuật chọn tạo giống trồng”, Nhà xuất Nơng Nghiệp Hà Nội Tài liệu internet [4] www.longdinh.com [5] http://giaoan.violet.vn/present/show/entry_id/240388 [6] http://www.hcmbiotech.com.vn/news_detail.php?cateid=17&id=518 [7] http://www.hcmbiotech.com.vn/research_detail.php?id=4 [8] http://www.ecaa.ntu.edu.tw/weifang/lab551/flower/phal/2002RAPID%20PROPAGATION%20OF%20PHALAENOPSIS%20FROM%20FLORAL %20STALK-DERIVED%20LEAVES.pdf [9] http://ecaaser5.ecaa.ntu.edu.tw/weifang/lab551/flower/phal/2005Application%20of%20bioreactor%20systems%20for%20large%20scale%20productio n%20of%20horticultural%20and%20medicinal%20plants.pdf [10] http://www.hort.purdue.edu/newcrop/ncnu02/pdf/griesbach.pdf [11] www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?c [12] http://www.hoalanvietnam.org/Article.asp?ID=507 [13] http://www.cesti.gov.vn/left/stinfo/sukien/tpkhac/2007/11/TTSK-LV-161107-03 [14] http://www.caycanhvietnam.com/?trungdu=view&id=1067 Các Từ Viết Tắt NAA : α – Naphalen axetic axit BA : – Benzylaminpurin IBA : Indole -3- butyric axit SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 31 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp MỤC LỤC Phần I: Mở Đầu .1 Phần II: Nội Dung II.1 Tổng quan tài liệu 1.1 Lịch sử thành tựu ni cấy mơ 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2 Các giai đoạn nhân giống invitro 1.3 Các phương pháp nhân giống invitro 1.3.1 Ni cấy đỉnh sinh trưởng 1.3.2 Ni cấy mơ sẹo 1.3.3 Ni cấy tế bào đơn 1.3.4 Ni cấy protoplast-chuyển gen 1.3.5 Ni cấy hạt phấn đơn bội II.2 Tìm hiểu nhân giống lan Hồ Điệp 2.1 Nguồn gốc đặc điểm lan Hồ Điệp 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm 2.2 Điều kiện sinh thái 2.1 Nhiệt độ 2.2 Nước tưới 2.3 Ánh sáng .6 2.4 Độ thơng thống 2.5 Dinh dưỡng 2.2.6 Sâu bệnh 2.2.7 Chậu, giá thể, cách trồng 2.3 Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp Việt Nam 2.4 Nhân giống invitro lan Hồ Điệp 2.4.1 Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa 2.4.2 Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm điều kiện invitrro 2.4.3 Ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm nhân giống Hồ Điệp lai SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 32 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 2.4.4 Nhân nhanh phơi Protocorm – like body lan Hồ Điệp hệ thống Bioreactor 11 2.5 Kết thí nghiệm 15 2.5.1 Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa 15 2.5.2 Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm điều kiện invitrro 16 2.5.3 Ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm nhân giống Hồ Điệp lai 18 2.5.4 Nhân nhanh phơi Protocorm – like body lan Hồ Điệp hệ thống Bioreactor 24 2.6 Hiệu kinh tế lan Hồ Điệp 28 Phần III: Kết Luận 30 SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 33