ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - NGHIÊM THỊ SUỐT Tên đề tài: PHÂN LOẠI GIẢO CỔ LAM (GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM) BẰNG PHƢƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH&CNTP Khóa học : 2011-2015 Thái Nguyên – năm 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - NGHIÊM THỊ SUỐT Tên đề tài: PHÂN LOẠI GIẢO CỔ LAM (GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM) BẰNG PHƢƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K43 - CNSH Khoa : CNSH&CNTP Khóa học : 2011-2015 Giảng viên hƣớng dẫn 1:TS Dƣơng Văn Cƣờng 2: ThS Ma Thị Trang Thái Nguyên – năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, trình học tập, nghiên cứu, bên cạnh nỗ lực, phấn đấu thân, em nhận giúp đỡ quý báu thầy giáo, cô giáo Nhân dịp này, cho phép em bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Dƣơng Văn Cƣờng người trực tiếp giúp đỡ hướng dẫn em suốt thời gian thực đề tài trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình Thầy giáo, Cô giáo khoa CNCH - CNTP dậy dỗ giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Ma Thị Trang cán bộ, anh chị làm việc Viên Khọc học Sự sống _ Đại Học Thái Nguyên tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em học tập nghiên cứu suốt trình thực hoàn chỉnh khóa luận Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp em suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận Thái nguyên, ngày 2tháng năm 2015 Sinh viên Nghiêm Thị Suốt ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BP: Base pair – Cặp bazơ nitơ Cs: Cộng DNA: Deoxirybonucleic Acid DMSO: Dimethylsulfoxide dNTP: Deoxyribonucleotide Triphosphate dATP: DeoxyAdenine Triphosphate dGTP: DeoxyGuanineTriphosphate dTTP: DeoxyThymine Triphosphate dCTP: DeoxyCytisine Triphosphate Kb: Kilo Base – Kilôbazơ nitơ QV: Quality value PCR: Polymerase Chain Reaction iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Giảo cổ lam Hình 2.2: Giảo cổ lam Hình 2.3: Giả cổ lam Hình 2.4: Giảo cổ lam Hình 2.5: Cấu trúc chung dammarane -Type Gypenosides 10 Hình 3.1: Bản đồ vị trí lấy mẫu Giảo cổ lam cho nghiên cứu 22 Hình 4.1: Giảo cổ lam có hình thái giống với Giảo cổ lam 31 Hình 4.2: DNA tổng số điện di gel agarose 1% 35 Hình 4.3: Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen rbcLa mẫu nghiên cứu gel agarose 1% 38 Hình 4.4: Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen ITS2 mẫu nghiên cứu gel agarose 1% 39 Hình 4.5: Ảnh Chromas kết giải trình tự gen rbcLa mẫu MS4 40 Hình 4.6: Ảnh Chromas kết giải trình tự đoạn gen ITS2 mẫu MS4 40 Hình 4.7: Kết giải trình tự đoạn gen rbcLa mẫu MS4 41 Hình 4.8: Kết giải trình tự đoạn gen ITS2 mẫu MS4 41 Hình 4.9 Các vị trí kiểm tra hiệu chỉnh: 43 Hình 4.10: Kết so sánh trình tự đoạn gen rbcla sau hiệu chỉnh 45 Hình 4.11: Kết so sánh trình tự (consensus) gen rbcLa với trình tự gene rbcL Giảo cổ lam công bố ngân hàng gene NCBI 46 Hình 4.12: Kết so sánh Blast trình tự (consensus) gen rbcLa với trình tự gene rbcL dễ nhầm Giảo cổ lam thùy 48 Hình 4.13: Kết so sánh Blast trình tự gen ITS2 mẫu MS2 với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy công bố ngân hàng GenBank 49 Hình 4.14: Kết so sánh Blast trình tự gen ITS2 mẫu MS6 với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy công bố ngân hàng GenBank 50 Hình 4.15: Kết so sánh Blast trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy 50 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Địa điểm, ký hiệu mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu 22 Bảng 3.2: Trình tự mồi sử dụng cho PCR 23 Bảng 3.3: Thành phần dung dịch CTAB buffer 23 Bảng 3.4: Thành phần dung dịch TE ( 10:0,1) 23 Bảng 3.5: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 25 Bảng 3.6: Bảng thành phần tính chất lý hóa DMSO 29 Bảng 3.7: Chu trình nhiệt phản ứng PCR gen rbcLa 30 Bảng 3.8: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR gen ITS2 30 Bảng 4.1: Những thông số thay đổi qua quy trình 34 Bảng 4.2 Kết đo OD đại diện mẫu nghiên cứu 37 Bảng 4.3: Bảng tổng hợp kết giải trình tự nghiên cứu 42 v MỤC LỤC Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phân bố phân loại Giảo cổ lam 2.1.1 Phân bố Giảo cổ lam 2.1.2 Phân loại 2.2 Đặc điểm thực vật chi Gynostemma Blume 2.2.1 Gynostemma laxum (Wall.) 2.2.2 Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) 2.2.3 Gynostemma longipes 2.2.4 Gynostemma sp 2.3 Thành phần hóa học giá trị sử dụng Giảo cổ lam y học cổ truyền 2.3.1 Thành phần hóa học Giảo cổ lam 2.3.2 Tác dụng giá trị làm thuốc Giảo cổ lam 10 2.3.3 Bộ phận sử dụng làm thuốc Giảo cổ lam 14 2.4.Tổng quan mã vạch DNA (DNA barcode) 14 2.4.1 Một số mã vạch DNA sử dụng rộng rãi tiǹ h hiǹ h nghiên cứu 15 2.4.2 Ứng dụng mã vạch DNA thực vật 16 2.4.3 Trình tự DNA lựa chọn làm mã vạch thực vật 17 2.4.4 Lựa chọn sử dụng vùng gen DNA mã vạch cho nghiên cứu 17 2.5 Tình hình nghiên cứu mã vạch DNA nước nước 18 2.5.1 Tình hình nghiên cứu nước 18 2.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 20 Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tượng, hóa chất thiết bị nghiên cứu 22 vi 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 25 3.2 Địa điển thời gian nghiên cứu 25 3.3 Nội dung nghiên cứu 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.1 Quy trình tách chiết DNA từ mẫu 26 3.4.2 Điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số gel Agarose 27 3.4.3 Phương pháp PCRkhuếch đại đoạn gentrong nghiêm cứu 28 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Phân tích đánh giá hình thái mẫu nghi ngờ với Giảo cổ lam 31 4.2 Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA từ mẫu 32 4.3 Kết tối ưu hoá phản ứng PCR 38 4.3.1 Kết khuếch đại gen rbcLa 38 4.3.2 Kết PCR gen ITS2 38 4.4 Kết giải trình tự gen nghiên cứu 39 4.4.1 Phân tích chất lượng kết giải trình tự 39 4.4.2 Kết hiệu chỉnh điểm nghi ngờ 43 4.5 Phân tích kết giải trình tự 46 4.5.1 Phân tích đa hin ̀ h trình tự ADN vùng gen rbcLa 46 4.5.2 Phân loại Giảo cổ lam với dễ bị nhầm lẫn Giảo cổ lam thùy 47 4.5.3 Phân tích kết giải trình tự vùng gen ITS2 48 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 I Tài liệu tiếng việt 52 II, Tài liệu tiếng nước 53 III Tài liệu từ Internet 56 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á có phong phú đa dạng sinh học Theo thống kê “Tiếp cận nguồn gen chia sẻ lợi ích” (Tổ chức Bảo tồn thiên nhiên Thế giới – IUCN), Việt Nam có gần 12.000 loài thực vật bậc cao, có mạch thuộc 2.256 chi, 305 họ (chiếm 4% tổng số loài, 15% tổng số chi, 57% tổng số họ thực vật giới) Mặt khác theo kết điều tra Viện Dược Liệu [7] nước ta có khoảng 3.948 loài thực vật nấm lớn ghi nhận có công dụng làm thuốc Trong tổng số 3.948 loài thuốc có tới 90% mọc tự nhiên, tập trung quần xã rừng, có gần 10% thuốc trồng Những số liệu cho thấy nguồn dược liệu nước ta đa dạng có tiềm lớn, việc sử dụng dược liệu làm thuốc có từ lâu đời phổ biến đến ngày nay, bên cạnh đó, góp phần thúc đẩy phát triển kinh tế - xã hội Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) loại thảo dược có thân mảnh, leo nhờ tua quấn nách lá, thuộc họ nhà Bầu bí, đực riêng biệt, loài ghi nhận với kép chân vịt, có năm chét [11] Nó coi loại dược liệu quý ghi sách cổ “Nông toàn thư hạch chú” hạ năm 1639 Từ xa xưa, Giảo cổ lam sử dụng cho vua chúa để tăng sức khoẻ, kéo dài tuổi thọ làm đẹp Năm 1997 Giáo sư Phạm Thanh Kỳ (Đại học Dược Hà Nội) phát Giảo cổ lam núi Phan – xi - păng (Lào Cai) Giảo cổ lam biết đến loại thảo dược loại thực phẩm, sử dụng cho điều trị viêm, ho viêm phế quản mãn tính [20, 25].Giảo cổ lam có chứa hợp chất Gypenosides saponin [24, 28], có vai trò làm giảm cholesterol máu, ức chế tăng trưởng tế bào khối u, chữa bệnh loét dày tá tràng, làm giảm viêm giảm đau [25] Ngoài ra, Giảo cổ lam coi loại thuốc bổ để cải thiện hệ thống miễn dịch Cho đến nay, mẫu sinh vật thường nhận diện đặc điểm hình thái bên đặc tính sinh lý, sinh hóa bên dựa vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn [8] Tuy nhiên nhiều trường hợp, mẫu vật chưa phát triển đầy đủ đặc tính hình thái, chúng bị hư hỏng phận mẫu sinh vật bị chết khiến trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn Vấn đề đặt xác định xác loài thực vật dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với loài khác, đặc biệt loài có đặc điểm hình thái tương tự Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu Đại học Guelph Ontario lần đưa khái niệm mã vạch DNA (DNA Barcode), nhằm giúp nhận diện mẫu vật [17] Mã vạch DNA sử dụng trình tự DNA ngắn nằm hệ gen sinh vật chuỗi ký tự giúp phân biệt hai loài sinh vật với [13] Việc ứng dụng phương pháp mã vạch DNA giúp giải toán trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ lượng mẫu nhỏ [21] Hơn nữa, mã vạch DNA giúp phân tích trình tiến hóa sinh học loài tự nhiên Như mã vạch DNA phương pháp định danh mà sử dụng đoạn DNA chuẩn, ngắn nằm hệ gen sinh vật nghiên cứu nhằm xác định sinh vật thuộc loài Một mã vạch DNA điển hình phải đáp ứng yêu cầu sau: (i) Có tính phổ biến cao để thực nhiều loài thực vật (ii) Trình tự có tính ðặc hiệu cao có hiệu suất nhân cao (iii) Có khả phân biệt đồng thời nhiều loài Việc ứng dụng phương pháp mã vạch DNA định danh loài ứng dụng rộng rãi toàn giới song Việt Nam 45 MS6 MS5 MS2 MS3 MS4 MS1 Consensus (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) MS6 MS5 MS2 MS3 MS4 MS1 Consensus (81) (81) (81) (81) (81) (81) (81) MS6 MS5 MS2 MS3 MS4 MS1 Consensus (161) (161) (161) (161) (161) (161) (161) MS6 MS5 MS2 MS3 MS4 MS1 Consensus (241) (241) (241) (241) (241) (241) (241) MS6 MS5 MS2 MS3 MS4 MS1 Consensus (321) (321) (321) (321) (321) (321) (321) MS6 MS5 MS2 MS3 MS4 MS1 Consensus (401) (401) (401) (401) (401) (401) (401) MS6 MS5 MS2 MS3 MS4 MS1 Consensus (481) (481) (481) (481) (481) (481) (481) GTGTTAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAA GTGTTAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAA GTGTTAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAA GTGTTAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAA GTGTTAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAA GTGTTAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAA GTGTTAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAA 81 160 CTCCTCAACCCGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCCGCTGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG CTCCTCAACCCGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCCGCTGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG CTCCTCAACCCGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCCGCTGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG CTCCTCAACCCGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCCGCTGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG CTCCTCAACCCGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCCGCTGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG CTCCTCAACCCGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCCGCTGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG CTCCTCAACCCGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCCGCTGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG 161 240 TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAGTCA TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAGTCA TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAGTCA TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAATCA TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAGTCA TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAGTCA TGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAGTCA 241 320 ATTTATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTA ATTTATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTA ATTTATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTA ATTTATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTA ATTTATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTA ATTTATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTA ATTTATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTA 321 400 ATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTACTGCTTATACTAAAACTTTCCAA ATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATACTAAAACTTTCCAA ATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATACTAAAACTTTCCAA ATGTTTTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAACTTTCCAA ATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAACTTTCCAA ATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAACTTTCCAA ATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTGCTTATTCTAAAACTTTCCAA 401 480 GGCCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACC GGCCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACC GGCCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACC GGCCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACC GGCCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACC GGCCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACC GGCCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACC 481 535 AAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTATGGTAGAGCAGTTTATGAATGTTTACGC AAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTATGGTAGAGCAGTTTATGAATGTTTACGC AAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTATGGTAGAGCAGTTTATGAATGTTTACGC AAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTATGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTACGC AAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTATGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTACGC AAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTATGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTACGC AAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTATGGTAGAGCAGTTTATGAATGTTTACGC 80 Hình 4.10: Kết so sánh trình tự đoạn gen rbcla sau hiệu chỉnh Khái niệm Consensus: Là trình tự đồng xác định nucletide biểu diễn chung vi trí Để tăng thêm độ tin cậy kết giải trình tự sau hiệu chỉnh trình tự rbcLa xác định Chúng tiến hành so sánh Blast trình tự đoạn gen rbcLa (trình tự consensus) mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu với trình tự gen rbcL Giảo cổ lam công bố trên ngân hàng Genbank (NCBI) 46 Hình 4.11: Kết so sánh trình tự (consensus) gen rbcLa với trình tự gene rbcL Giảo cổ lam công bố ngân hàng gene NCBI Kết so sánh Blast cho thấy trình tự đoạn gen rbcLa mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu có tương đồng đến 99% (Identities = 535/536 (99%)) có vị trí sai khác nhât (hình 4.11) so với trình tự gen rbcL Giảo cổ lam công bố ngân hàng GenBank 4.5 Phân tích kết giải trình tự 4.5.1 Phân tích đa hình trình tự ADN vùng gen rbcLa Từ (hình 4.10) cho thấy có đương đồng tất mẫu Giảo cổ lam Các vi trí nucleotit có dải màu thể tương đồng trình tự mẫu Chiều dài đoạn gen rbcLa mẫu dao động từ 549 bp đến 665 bp, tỷ 47 lệ GC vùng khoảng từ 43,6% đến 43,9% Kết so sánh tương đồng mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu cao, có điểm khác biệt trình tự rbcLa chiếm 0.75% khác biệt loài Sự sai khác tập chung chủ yếu mẫu MS3 Từ ta kết luận thị gen rbcLa khả phân loại loài Giảo cổ lam tronh chi Giảo cổ lam Mặt khác theo số nghiên cứu DNA mã vạch thực vật dùng cho nhận dạnh xác định loài thuốc thảo dược, nghiên cứu sai khác trình tự DNA mã vạch loài nhỏ 1% sử dụng chúng việc nhận dạnh, định danh thành phần dược liệu có thuốc thảo dược [37] Do ứng dụng DNA mã vạch việc sử dụng trình tự rbcLa Giảo cổ lam vào việc kiểm nghiện chất lượng định danh thành phần loại thuốc thảo dược có nguồn gốc từ Giảo cổ lam để đưa nhìn khách quan thành phần, chất lượng thảo dược thương mại hóa thị trường 4.5.2 Phân loại Giảo cổ lam với dễ bị nhầm lẫn Giảo cổ lam thùy Từ kết so sánh Blast (hình 4.12) cho ta thấy dễ bị nhầm Giảo cổ lam thùy có độ tương đồng trình tự 97% so với trình tự rbcla Giảo cổ lam thùy Tuy nhiên theo kết công bố số nghiên cứu DNA mã vạch cho phân loại học thực vật cho biết tương đồng trình tự DNA hai loài nhỏ 98% có khả phân loại mức loài [37] Từ kết cho thấy dễ bị nhầm Giảo cổ lam thùy Giảo cổ lam hai loài hoàn toàn khác 48 Hình 4.12: Kết so sánh Blast trình tự (consensus) gen rbcLa với trình tự gene rbcL dễ nhầm Giảo cổ lam thùy Để tăng thêm độ tin cậy tiến hành so sánh trình tự rbcLa dễ bị nhầm là Giảo cổ lam với trình tự rbcLa Giảo cổ lam phần mềm vector NTI kết hiển thị qua hình (phụ lục) 4.5.3 Phân tích kết giải trình tự vùng gen ITS2 Trình tự ADN vùng gen ITS2 mẫu nghiên cứu so sánh phần mềm Vector NTI (phụ lục) cho thấy chiều dài vùng ITS2 mẫu dao động từ 478 bp đến 539 bp, tỷ lệ GC vùng khoảng từ 58,1% đến 61,9% 49 4.5.3.1 So sánh trình tự gen ITS2 mẫuMS2 với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy công bố ngân hàng GenBank Hình 4.13: Kết so sánh Blast trình tự gen ITS2 mẫu MS2 với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy đƣợc công bố ngân hàng GenBank Từ hình ta thấy trình tự gen ITS2 mẫu MS2 hoàn toàn tương đồng với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy công bố, tương đồng đến 99%, có hai vị trí sai khác.Vậy kết luận mẫu MS2 nghiên cứu Giảo cổ lam thùy 4.5.3.2 So sánh trình tự gen ITS2 mẫu MS6 với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy ðã công bố ngân hàng GenBank Khi so sánh trình tự gen ITS2 mẫu MS6với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy công bố NCBI ta thấy trình tự có tương đồng đạt 99% Vậy kết luận mẫu MS6 nghiên cứu Giảo cổ lam thùy 50 Hình 4.14: Kết so sánh Blast trình tự gen ITS2 mẫu MS6 với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy đƣợc công bố ngân hàng GenBank 4.5.3.3 So sánh trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy Kết so sánh Blast trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy Giảo cổ lam thùy cho thấy hai mẫu có tương đồng đạt 82% Vậy khẳng định Giảo cổ lam thùy Giảo cổ lam thùy hai loài khác Chỉ thị gen ITS2 có khăng phân loại loài thuộc chi Giảo cổ lam Hình 4.15: Kết so sánh Blast trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy với trình tự gen ITS2 Giảo cổ lam thùy 51 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu Giảo cổ lam - Tối ưu hóa phản ứng PCR mã vạch DNA thực vật - Giải trình tự thành công sản phẩm PCR mẫu nghiên cứu - Đã ứng dụng thành công phương pháp DNA mã vạch vào phân loại mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu phương pháp mã vạch 5.2 Đề nghị - Tiếp tục tiến hành thu thập mẫu Giảo cổ lam thùy thùy dễ bị nhầm là Giảo cổ lam để phân loại - Ứng dụng DNA mã vạch cặp mồi rbcLa vào kiểm tra xác định sản phẩm thảo dược có nguồn gốc từ Giảo cổ lam thương mại hóa thị trường - Ứng dụng DNA mã vach thực vật vào phân loại thực vật học 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Phùng văn Chung (2012) “Bước dầu nghiên cứu đặc điểm thực vật học số mẫu loài Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) thu thập Sa Pa - Lào Cai” Võ Văn Chi (2004 ) Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Vũ Đình Duy, et al (2013) "Mối quan hệ di truyền số loài Thông (Coniferales) Việt Nam sở xác định trình tự Nucleotide vùng gene RBCL (Rubilose-1,5Bisphophate Carboxylase) " bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Trường đại học Phương Đông Trần Thu Hoa DNA Trần Hoàng Dũng (2013) "khảo sát đặc tính dược liệu bước đầu định danh trình tự ITS matK cho mẫu ngải tìm thấy vùng núi Cấm - An Giang." Tạp chí Dược họcT 53, S Phạm Hoàng Hộ (2006) Cây có vị thuốc Việt Nam, NXB Trẻ Hà Nội Nguyễn Thị Thanh Nga (2012) "Đánh giá tính đa dạng di truyền số loài Codonopsis Việt Nam kỹ thuật mã vạch DNA." Đại học quốc gia Hà Nội Viện Dược liệu (2010) “Phương pháp nghiên cứu thuốc từ thảo dược”, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội Hoàng Thị Sản (2003) Giáo trình phân loại thực vật., NXB giáo duc Dương Thúy Yên (2014) "So sánh trình tự số gene mã vạch cá rô đầu vuông cá rô đồng tự nhiên (Anabas Testudineus Bloch, 1792)" đại học Cần Thơ 10 Nguyễn Quang Thạch (2007) "Tách chiết ADN." Viện Sinh học Nông Nghiệp 53 11 Ngô Tuấn Vinh (2010) “Nghiên cứu thành phần hóa học Giảo cổ lam ( Gynostemma pentaphyllum Thunb.) họ Curcubitaceae Bắc Kạn” Luận văn Thạc sĩ hóa học, Đại học sư phạm Thái Nguyên II, Tài liệu tiếng nƣớc 12 Chen, S., H Yao, J Han, C Liu, J Song, L Shi, Y Zhu, X Ma, T Gao, X Pang, K Luo, Y Li, X Li, X Jia, Y Lin and C Leon (2010) "Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species." PLoS One 5(1): e8613 13 Daniel H Janzen (2009) "A DNA barcode for land plants." University of Pennsylvania, Philadelphia, PA 14 Doyle and Doyle, D a D and Cullings (1987) "CTAB/ChloroformIsoamyl Alcohol DNA Extraction Protocol." 15 Fazekas, A J., M L Kuzmina, S G Newmaster and P M Hollingsworth (2012) "DNA barcoding methods for land plants." Methods Mol Biol 858: 223-252 16 Gao, D., M Zhao, X Qi, Y Liu, N Li, Z Liu and Y Bian (2014) "Hypoglycemic effect of Gynostemma pentaphyllum saponins by enhancing the Nrf2 signaling pathway in STZ-inducing diabetic rats." Arch Pharm Res 17 Hebert, P D., A Cywinska, S L Ball and J R deWaard (2003) "Biological identifications through DNA barcodes." Proc Biol Sci 270(1512): 313-321 18 Hebert, P D., M Y Stoeckle, T S Zemlak and C M Francis (2004) "Identification of Birds through DNA Barcodes." PLoS Biol2(10): e312 19 Huyen, V T., D V Phan, P Thang, N K Hoa and C G Ostenson (2010) "Antidiabetic effect of Gynostemma pentaphyllum tea in randomly assigned type diabetic patients." Horm Metab Res 42(5): 353-357 54 20 Jiang-Xu (1979) "Jiao-Gu-Lan Zhong-Yao-Da-Zhi-Dian Sci.&Tech." New Medical College: 6-17 21 John-Kress W and Erickson D.L ed (2012) "DNA Barcodes: Methods and Protocols" Springer Publishe, In Methods in Molecular Biology Series 858 22 Kress, W J and D L Erickson (2007) "A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnHpsbA spacer region." PLoS One 2(6): e508 23 Li, L., L Jiao and B H Lau (1993) "Protective effect of gypenosides against oxidative stress in phagocytes, vascular endothelial cells and liver microsomes." Cancer Biother 8(3): 263-272 24 Li, L a J (1989) "The influence of Gynostemma pentaphyllum extract on platelet aggregation and arachidonate metabolism in rabbits." 25 Lin, J M., C C Lin, H F Chiu, J J Yang and S G Lee (1993) "Evaluation of the anti-inflammatory and liver-protective effects of anoectochilus formosanus, ganoderma lucidum and gynostemma pentaphyllum in rats." Am J Chin Med 21(1): 59-69 26 Liu, J., L Zhang, Y Ren, Y Gao, L Kang and Q Qiao (2014) "Anticancer and immunoregulatory activity of Gynostemma pentaphyllum polysaccharides in H22 tumor-bearing mice." Int J Biol Macromol 69: 14 27 N Winer and J R Sowers (2004) "Epidemiology of diabetes." Journal of Clinical Pharmacology vol 44: 397-405 28 Piacente S and C Pizza (1995) "New dammarane-type glycosides from Gynostemma pentaphyllum." 29 S.G Newmaster, A.J Fazekas and S Ragupathy (2006) "DNA barcoding in land plants: evaluation of rbcL in a multigene tiered approach." 55 30 Selvaraj, D., D Shanmughanandhan, R K Sarma, J C Joseph, R V Srinivasan and S Ramalingam (2012) "DNA barcode ITS effectively distinguishes the medicinal plant Boerhavia diffusa from its adulterants." Genomics Proteomics Bioinformatics 10(6): 364-367 31 Susan Frackman, Gary Kobs, Dan Simpson and Doug Storts (1998) "Betaine and DMSO: Enhancing Agents for PCR." 32 Tanner, M A., X Bu, J A Steimle and P R Myers (1999) "The direct release of nitric oxide by gypenosides derived from the herb Gynostemma pentaphyllum." Nitric Oxide 3(5): 359-365 33 Techen, N., I Parveen, Z Pan and I A Khan (2014) "DNA barcoding of medicinal plant material for identification." Curr Opin Biotechnol25: 103-110 34 Wang, M., F Wang, Y Wang, X Ma, M Zhao and C Zhao (2013) "Metabonomics study of the therapeutic mechanism of Gynostemma pentaphyllum and atorvastatin for hyperlipidemia in rats." PLoS One 8(11): e78731 35 Wild, S., G Roglic, A Green, R Sicree and H King (2004) "Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030." Diabetes Care 27(5): 1047-1053 36 Christopher korch (2010) "dna sequencing troubleshooting guide and recommendations for sequencing large dna clones and bacs." university of colorada cancer center 37 Rafael Melo Palhares, Marcela Gonçalves Drummond, Bruno dos Santos Alves Figueiredo Brasil and M d G L B Gustavo Pereira Cosenza (2015) "Medicinal Plants Recommended by the World Health Organization: DNA Barcode Identification Associated with Chemical Analyses Guarantees Their Quality." 56 38 Shneer, V S (2009) "DNA barcoding is a new approach in comparative genomics of plants." Genetika 45(11): 1436-1448 III Tài liệu từ Internet 39 Phát hoạt chất Adenosin quý giá Giảo cổ lam hoang dã Việt Nam (15/04/2014),http://khoe360.tienphong.vn/gia-dinh-suc- khoe/phat-hien-hoat-chat- adenosin-quy-gia-trong-cay-giao-co-lam- hoang-da-tai-viet-nam-695583.tpo Tiền phong 40 Cách nhận biết Giảo cổ lam “Thật – giả” (09/10/2013), http://giaocolam.info/cach-nhan-biet-giao-co-lam-that-gia/Giảo Hòa Bình cổ lam Phụ Lục Hình 1: Kết giải trình tự đoạn gen rbcLa mẫu Giảo cổ lam MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 Hình 2: Kết giải trình tự đoạn gen ITS2 mẫu Giảo cổ lam MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 Hình 3: Kết so sánh trình tự gen rbcLa dễ bị nhầm Giảo cổ lam thùyvới trình tự gene rbcLa Giảo cổ lam 80 (1) GTGTTAAGA-TTA-TAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGT (1) GTGTTAAGACTTACTAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGT 81 160 consensus (79) AACTCCTCAACCCGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCCGCTGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG MS7(81) AACTCCTCAACCCGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCCGCTGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 161 240 consensus (159) TGTGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACGACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAGT MS7- (161) TGTGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAAAAAAT 241 320 consensus (239) CAATTTATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGG MS7- (241) CAATTTATTGCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGG 321 400 consensus (319) TAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTT-GCGAATCCCTACTGCTTATA-CTAAAACTTT MS7- (321) TAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATTTAGCGAATCCCTACTGCTTATATCTAAAACTTT 401 480 consensus (397) CCAAGGCCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGATGTACTATTA MS7- (401) CCAAGGCCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTGGGATGTACTATTA 481 558 consensus (477) AACCAAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTATGGTAGAGCAGTTTATGAATGTTTACGCGGTGGACTGA-ATTTTACA MS7- (481) AACCAAAATTGGGATTATCCGCTAAAAATTATGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTTCGCGGTGGCCTTTGATTTTACA consensus MS7- Hình 4: Kết tách chiết DNA tổng số mẫu MS7 [...]... dân thu hái và bán cùng với tên gọi là Giảo cổ lam [1] Trước nhu cầu thực tiễn đó tôi thực hiện nghiên cứu đề tài Phân loại Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb. ) Makino) bằng phƣơng pháp mã vạch DNA 1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài Phân loại các loài Giảo cổ lam bằng phương pháp mã vạch DNA Giải trình tự và tạo thư viện hệ gen của các loài Giảo cổ lam nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa của đề tài -... một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch DNA Đề tài góp phần xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự DNA của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK Nghiên cứu đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK, và kết quả phân tích sự đa hình trên mỗi vùng... vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen Năm 2003, Paul Hebert đã lần đầu tiên đưa ra khái niệm mã vạch DNA (DNA. .. mở ra triển vọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào việc phân loại, định danh loài -Ý nghĩa trong thực tiễn: Là cơ sở để góp phần xây dựng phương pháp phân biệt nhanh chóng và chính xác các loài sinh vật 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phân bố và phân loại của Giảo cổ lam 2.1.1 Phân bố của Giảo cổ lam Trên thế giới, Giảo cổ lam được phát hiện ở độ cao 200 – 2000 m, trong các khu rừng thưa... độ ẩm, cây Giảo cổ lam phát triển thân và lá mạnh, tiến hành thu hái dược liệu Sau khi thu hái đem băm nhỏ với chiều dài 2 – 3cm rồi phơi khô [7] 2.4.Tổng quan về mã vạch DNA (DNA barcode) Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng 15 tương đối đầy đủ và toàn diện Phương pháp phân loại này chủ yếu... ngờ với Giảo cổ lam - Nội dung 2: Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA từ mẫu lá - Nội dung 3: Tối ưu hóa phản ứng PCR Khuếch đại gen rbcLa từ DNA hệ gen của Giảo cổ lam bằng cặp mồirbcLa Khuếch đại gen ITS từ DNA hệ gen của Giảo cổ lam bằng cặp mồi ITS2 - Nội dung 4: Kết quả giải trình tự - Nội dung 5: Phân tích, so sánh kết quả giải trình tự 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Quy trình tách chiết DNA từ... thể cây Giảo cổ lam mọc hoang dại với trữ lượng lớn tại vùng núi cao thuộc huyện Mèo Vạc – Hà Giang và huyện Bảo Lạc – Cao Bằng 2.1.2 Phân loại Kết quả giám định loài Giảo cổ lam nằm trong hệ thống phân loại thực vật như sau: - Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực) - Giới: Plantae (Thực vật) - Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh) - Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín) - Lớp:... DNA (DNA Barcode), nhằm giúp nhận diện các mẫu vật Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau [17] 2.4.1 Một số mã vạch DNA được sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu 2.4.1.1 Mã vạch DNA ở động vật Ở động vật mã vạch DNA thường được dùng rộng rãi là cytochrome c oxidase gen I (CO 1) do có các tiêu... thước nhỏ và những nhóm đã được phân loại nhưng chưa đầy đủ, thiếu tương xứng với đặc điểm đa dạng của chúng (ví dụ, một số trường hợp không thể dựa trên nguyên tắc phân loại hình thái học để đánh giá, phân loại, hoặc đã được phân loại nhưng chưa thực sự triệt đ ) Một số mã vạch DNA đã được nghiên cứu và ứng dụng trong phân loại thực vật: Vùng gen ITS, Maturase K (Matk), trnH-psbA, Tiểu đơn vị lớn của... nước biển ở các vùng đồng bằng, sườn dốc và dưới tán cây trên vùng núi cao của Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Việt Nam và một số nước Đông Nam Á 2.3 Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Giảo cổ lam trong y học cổ truyền 2.3.1 Thành phần hóa học của cây Giảo cổ lam Nghiên cứu hóa học thực vật tiến hành trên cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb. ) thu được 3 hợp chất phytosterol,