ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - HOÀNG THỊ THÚY QUỲNH Tên đề tài: TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TÌNH TỰ GENE MÃ HÓA ENZYME FERULOYL-COA SYNTHASE TỪ CHỦNG Amycolatopsis sp HR104 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2015 Thái Nguyên, 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - HOÀNG THỊ THÚY QUỲNH Tên đề tài: TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TÌNH TỰ GENE MÃ HÓA ENZYME FERULOYL-COA SYNTHASE TỪ CHỦNG Amycolatopsis sp HR104 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2015 Giảng viên hƣớng dẫn TS DƢƠNG VĂN CƢỜNG PGS.TS NGÔ XUÂN BÌNH Thái Nguyên, 2015 i LỜI CÁM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành đề tài với nỗ lực thân, nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp hoàn thành khóa luận : Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS.TS Ngô Xuân Bình T.s Dương Văn Cường, người tận tình giúp đỡ hướng dẫn bảo, giải đáp thắc mắc củng cố kiến thức cho Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Chị Ma Thị Trang, cán phòng thí nghiệm công nghệ gene - Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên trực tiếp bảo kĩ làm việc, tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm đào tạo dạy dỗ suốt thời gian qua Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày tháng 06 năm 2015 Sinh viên Hoàng Thị Thúy Quỳnh ii BẢNG DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Đặc điểm cấu trúc thành phần vanillin Bảng 2.2: Hàm lượng vanillin mặt hàng thực phẩm Bảng 2.3: Các chủng vi sinh vật có khả sản xuất vanillin từ acid ferulic 19 Bảng 3.1: Các thành phần vector pTZ57R/T 29 Bảng 3.2 : Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 30 Bảng 3.3:Bảng danh mục thiết bị thí nghiệm .31 Bảng 3.4: Bảng thành phần phản ứng PCR: .33 Bảng 3.5: Bảng thành phần phản ứng gắn nối 34 Bảng 3.6: Bảng thành phần phản ứng cắt enzyme .38 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Con đường loại bỏ nhóm acetyl trình β-oxidative ( phụ thuộc CoA) 10 Hình 2.2: Con đường loại bỏ nhóm acetyl trình β-oxidative (phụ thuộc CoA)11 Hình 2.3: Con đường loại bỏ nhóm cacboxyl 12 Hình 2.4: Con đường loại bỏ nhóm acetyl nhóm cacboxyl từ CoA 13 Hình 2.5: Con đường Con đường loại bỏ chuỗi bên 14 Hình 2.6 : Quá trình tổng hợp vanillin từ guaiacol 17 Hình 2.7: Vi sinh vật tổng hợp vanillin từ acid ferulic 21 Hình 2.8: Con đường phân hủy vanillin chủng vi sinh vật 21 Hình 2.9: Sơ đồ đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA 23 Hình 3.2: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene fcs 33 Hình 4.2: Kết gắn sản phẩm PCR vào vector đích pTZ57R/T 42 Hình 4.3: Kết sàng lọc dòng mang vector pTZ-fcs 43 Hình 4.4: Kết cắt kiểm tra đồng thời hai enzyme EcoRI BamHI 44 Hình 4.5: Kết PCR khuếch đại gene fcs từ plasmid 45 Hình 4.6: Kết giải trình tự hai đầu sản phẩm DNA plasmid pTZ-fcs 47 Hình 4.7 : Kết so sánh tương đồng giải trình tự kết hợp mồi xuôi mồi ngược 48 Hình 4.8: Kết phân tích so sánh trình tự gene từ hai chiều 50 Hình 4.9: Kết trình tự đoạn gene fcs sau giải trình tự 51 Hình 4.10 Kết phân tích sai khác nucleotide 53 iv DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT Amp : Ampicillin BLAST : Basic Local Alignment Search Tool ( Công cụ tìm kiếm so sánh chuỗi cấu trúc sở) Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ CoA : Coenzyme Acetoacetyl DNA : Deoxyribonucleic Acid DMSO : Dimethylsulfoxide dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate E coli : Escherichia coli EDTA : Etilendiamin tetraaxetic acid Et al : Cộng fcs : Feruloyl-coA synthetase ech :Enoyl-CoA hydratase IPTG : Isopropyl Thiogalactoside Kb : Kilo base – Kilo bazơ nitơ LB : Laria Broth NCBI : National Cetrer for Biotechnology Information ( Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học) PCR : Polymerase Chain Recation (Phản ứng chuỗi trùng hợp) SDS : Natri lauryl sulfat TA : TA-Cloning TAE : Tris-acetate-EDTA UV : Ultraviolet X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside v MỤC LỤC PHẦN :MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu vanillin 2.1.1 Lịch sử nguồn gốc vanillin 2.1.2 Đặc điểm hình thái Vanillin planifolia 2.1.3 Cấu trúc đặc điểm lý hóa vanillin 2.1.4 Hoạt tính sinh học vanillin 2.1.5 Vai trò vanillin công nghiệp đời sống 2.2 Các đường sinh tổng hợp vanillin 2.2.1 Con đường sinh tổng hợp vanillin thực vật 2.2.2 Con đường sinh tổng hợp vanillin từ vi sinh vật 2.3 Các phương pháp sản xuất vanillin 15 2.3.1 Sản xuất vanillin từ thực vật 15 2.3.2 Sản xuất vanillin tổng hợp hóa học 16 2.3.3 Sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ sinh học 17 2.4 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp sản xuất vanillin 20 2.4.1 Các gene mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic 20 2.5 Tình hình nghiên cứu nước nước 24 2.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 24 2.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 26 PHẦN :VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Vật liệu nghiên cứu 28 3.1.1 Vật liệu 28 vi 3.1.2 Enzyme, hóa chất 30 3.1.3 Dụng cụ 31 3.1.4 Thiết bị 31 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 32 3.3 Nội dung nghiên cứu 32 3.4 Phương pháp nghiên cứu 32 3.4.1 Khuếch đại đoạn DNA phương pháp PCR 33 3.4.2 Điện di DNA gel agarose 33 3.4.3 Gắn DNA vào vector pTZ57R/T enzyme T4 Ligase 34 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả biến 34 3.4.5 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến 35 3.4.6 Tách chiết DNA plasmid phương pháp sử dụng SDS - kiềm 36 3.4.7 Phương pháp lập đồ giới hạn 37 3.4.8 Xác định trình tự nucleotit phương pháp sanger 38 3.4.9 So sánh trình tự DNA ngân hàng gene NCBI 39 PHẦN : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 4.1 Kết nhân gene fcs phương pháp PCR 40 4.2 Kết gắn sản phẩm PCR vào vector đích pTZ57R/T 42 4.3 Sàng lọc dòng mang vector pTZ-fcs điện di so sánh kích thước gel agarose 43 4.4 Kết chọn lọc dòng mang vector pTZ-fcs lập đồ giới hạn 44 4.5 Kết chọn lọc dòng phương pháp PCR 45 4.6 Kết phân tích giải trình tự gene fcs 46 PHẦN :KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vanillin (3-methoxy-4 hydroxybenzaldehyde) chất thơm quan trọng sử dụng phổ biến giới công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước hoa, dược phẩm, dinh dưỡng (Hua, Ma et al 2007) [27] Sản lượng vanillin tiêu thụ giới hàng năm ước tính khoảng 12000 (Krings 1998, Lomascolo 1999) [33,38] Vanillin tự nhiên sản xuất chủ yếu phương pháp tách chiết từ nguồn vỏ loài lan Vanilla phanifolia Lượng vanillin tạo phương pháp đáp ứng khoảng 1% nhu cầu từ thị trường (Prince, 1994) [44], lượng vanillin lại chủ yếu tổng hợp nhân tạo theo phương pháp hóa học (Li and Rosazza, 2000) [36] Tuy nhiên, theo quy định Mỹ châu Âu vanillin tổng hợp hóa học không coi tương đương với vanillin tự nhiên (Muheim A, 1999) [41] Trên thực tế, giá thành kg vanillin tự nhiên dao động khoảng 1,200 tới 4,000 USD, giá kg vanillin nhân tạo vào khoảng 15 USD (Yoon, Li et al 2005) [55] Ngoài trình tổng hợp vanillin theo phương pháp tổng hợp hóa học tác động gây ảnh hưởng xấu tới môi trường Có số nghiên cứu vanillin tổng hợp từ vi sinh vật khác thông qua chuyển hóa sinh học từ nguồn chất khác acid ferulic, eugenol, isogenol, lignin Trong số acid ferulic đối tượng nghiên cứu đường sinh tổng hợp để tạo vanillin sử dụng vanillin tự nhiên Ở vi sinh vật acid ferulic biến đổi thành feruloyl-CoA xúc tác enzyme feruloyl-coA synthetase mã hóa gene fcs sau feruloyl-CoA tiếp tục chuyển hóa thành vanillin tác động enzyme enoyl-CoA hydratase/aldolase hóa gene ech (Yoon, Li et al 2005) [55] Những chủng vi sinh vật xác định có mang gene fcs ech mã hóa cho trình chuyển hóa acid ferulic để tạo vanillin như: Amycolatopsis sp HR104 (Yoon, Li et al 2005) [55] Amycolatopsis sp HR167 (Achterholt, Priefert et al 2000) [5], Pseudomonas putida (Plaggenborg, Overhage et al 2003) [42], Bacillus subtili (Plaggenborg, Overhage et al 2003) [42], Pseudomonas fluorescens (Di Gioia, Luziatelli et al 2010) [15] Mặc dù vanillin tổng hợp từ sinh vật lượng vanillin tạo cho suất thấp sản phẩm nhanh chóng bị chuyển đổi thành sản phẩm phụ khác bị vi sinh vật sử dụng nguồn cacbon cung cấp lượng cho sinh vật phát triển (Yoon, Li et al 2005) [55 ] Ngoài trình lên men số xạ khuẩn gặp khó khăn dịch nuôi cấy có độ nhớt cao sinh trưởng hệ sợi xạ khuẩn bào tử (Bushell ME, 1999) [10] Trong năm gần với kết hợp thành tựu công nghệ DNA tái tổ hợp thành tựu kỹ thuật di truyền, nhà khoa học giới nghiên cứu đưa phương pháp sản xuất sản xuất vanillin công nghệ DNA tái tổ hợp Chủng tái tổ hợp tạo thành mang gene tách dòng từ sinh vật có khả sinh tổng hợp sản xuất vanillin Với đặc tính khả sinh trưởng phát triển tốt, có khả tiếp nhận gene ngoại lai vào hệ gene nội hệ gene đường phân hủy vanillin đặc điểm di truyền với quy trình lên men nghiên cứu kĩ (Priefert, Rabenhorst et al 2001) [43] E coli coi số đối tượng thích hợp để nghiên cứu ứng dụng tạo chủng tái tổ hợp cho sản xuất vanillin Việc sử dụng phương pháp DNA tái tổ hợp sản xuất vanillin khắc phục khó khăn tồn việc sản xuất vanillin Ở Việt Nam sản xuất vanillin dừng lại phương pháp tổng hợp hóa học việc sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp hướng Xuất phát từ thực tiễn tiến hành thực đề tài: "Tách dòng giải trình tự gene mã hóa enzyme feruloyl-coa synthase từ chủng Amycolatopsis sp HR104" Nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả sản xuất vanillin, trước mắt tạo chủng E coli tái tổ hợp 55 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã tách dòng thành công gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp HR104 Gene fcs tách dòng có tương đồng 99% với gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp HR167 công bố ngân hàng gene 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục gắn gene fcs vào vector pET22-GE tạo tổ hợp pET22-GEF hoàn chỉnh - Biến nạp vector tái tổ hợp pET22-GEF vào chủng vi khuẩn có hệ thống enzyme T7 RNA polymerase, cho phép T7 promorter hoạt động hiệu mạnh chủng vi khuẩn E.coli BL21 để kiểm chứng hoạt động gene tách dòng 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Bích Thủy, Đào Văn Trường ( 1991),"Tổng hợp vanillin từ eugenol ", Tạp chí hóa học 29(4): 21-27 Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Bích Thủy, Đào Văn Trường (1992)," Nghiên cứu oxy hóa ligin thành Vanillin", Tạp chí hóa học Đinh Thị Ngọ (1996),"Tổng hợp vanillin từ tinh dầu quế", Tạp chí hóa học công nghệ II Tiếng anh Abraham DJ, M A., Wireko FC, Whitney J, Thomas RP, Orringer EP (1991), "Vanillin, a potential agent for the treatment of sickle cell anemia", Blood 77: 1334 - 1341 Achterholt, S., H Priefert and A Steinbuchel (2000), "Identification of Amycolatopsis sp strain HR167 genes, involved in the bioconversion of ferulic acid to vanillin", Appl Microbiol Biotechnol 54(6): 799-807 Akagi K, H M., Hoshiya T, Mizoguchi Y, Ito N, Shirai T (1995), " Modulating effects of elagic acid, vanillin and quercetin in a rat medium term multi-organ carcinogenesis model", Cancer Lett 94: 113 -121 Barghini, P., D Di Gioia, F Fava and M Ruzzi (2007), "Vanillin production using metabolically engineered Escherichia coli under non-growing conditions", Microb Cell Fact 6: 13 Belanger, D H F A F C (2007), "Application of metabolic engineering to vanillin biosynthetic patthways in vanilla planifolia." The Biotechnology Center for Agriculture and the Environment NJ, 08903, USA: 175-196 Boonchird , F T (1982), "In vitro antifungal activity of eugenol and vanillin against Candida albicans and Cryptococcus neoformans", Can J Microbiol 28: 1235 -1241 10 Bushell ME, B A (1999), "Sporulation at minimum specific growth rate in 57 Aspergillus nidulans chemostat culture predicted using protein synthesis efficiency estimations",J Basic Microbio 39(5–6): 293–298 11 Chakrabarti, R.,& Schutt, C E (2001), "The enhancement of PCR amplification by low molecular-weight sulfones." Gene 274: 293–298 12 Chakrabarti, R and C E Schutt (2002), "Novel sulfoxides facilitate GC-rich template amplification", Biotechniques 32(4): 866, 868, 870-862, 874 13 Chen, S Gao, T Pang, X.Luo, K.Li, Y.Li, X.Jia, X.Lin, Y Leon, C, (2010), " Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species" PLoS One 14 Daphna Havkin-Frenkel, F C B ( 2010), "Handbook of Vanilla Science and Technology", (Biotechnology Center for Agriculture and the Environment School of Environmental and Biological Sciences Rutgers, The State University of New Jersey New Brunswic New Jersey, USA) 15 Di Gioia, D., F Luziatelli, A Negroni, A G Ficca, F Fava and M Ruzzi (2010), "Metabolic engineering of Pseudomonas fluorescens for the production of vanillin from ferulic acid", J Biotechnol 156(4):309-316 16 Durant S, K P and 5512 (2003), "Vanillins a novel family of DNA-PK inhibitors", Nucleic Acids Res, 31-5501 17 Esposito, L J K F G K F M V M G R F T (1997), "Vanillin", Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th edition 24 New York: John Wiley & Sons pp: 812–825 18 Farell, E M., & Alexandre, G (2012), "Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates," BMC Research Notes 5: 257 19 Fitzgerald DJ, S M., Gasson MJ, Narbad A (2004), "The potential application of vanillin in preventing yeast spoilage of ready-to-drink beverages", J Food Prot 67: 391 -395 20 Fitzgerald, D J., M Stratford, M J Gasson and A Narbad (2005), "Structure-function analysis of the vanillin molecule and its antifungal 58 properties", J Agric Food Chem 53(5): 1769-1775 21 Funk, C., Brodelius, P.E (1990), "Phenylpropanoid metabolism in suspension cultures of Vanilla planifolia And III Conversion of 4-methoxycinnamic acids into 4-hydroxybenzoic acids", Plant Physiol 22 Gupta, J K., Hamp, S.G., Buswell, J.A and Eriksson, K.E (1981),"Metabolism of trans-ferulic acid by the white-rot fungus Sporotrichum pulverulentum", Archives of Microbiology 128: 349–354 23 Gustafson DL, F H., Ueno AM, Smith CJ, Doolittle DJ, Waldren CA ( 2000), "Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) inhibits mutation induced by hydrogen peroxide,N-methyl-N-nitrosoguanidine and mitomycin C but not 137C-radiation at the CD59 locus in human hamster hybrid AL cells", Mutagenesis 15: 207 - 213 24 Hansen, E H., Moller, B L., & Kock, G R (2009), Applied and Environmental Microbiology, 75, 2765-2774 25 Hocking, M B (1997), "Vanillin Synthetic Flavoring from Spent Sulfite Liquor." Journal of Chemical Education 74(9): 1055–1059 26 Hopp, R., & Rabenhorst, J (2000), "Process for the preparation of vanillin and microorgainisms suitable therefor", Google pantents 27 Hua, D., C Ma, L Song, S Lin, Z Zhang, Z Deng and P Xu (2007), "Enhanced vanillin production from ferulic acid using adsorbent resin", Appl Microbiol Biotechnol 74(4): 783-790 28 Lesage-Meessen, L., Lomascolo, A., Bonnin, E., Thibault, J F., Buleon, A., Roller,M,Asther, M., Record, E., & Ceccaldi, B C.(2002), Applied Biochemistry and Biotechnolog 102–103(1–6): 141–153 29 Imanishi H, S Y., Matsumoto K, Watanabe M, Ohta T, Shirasu Y, Tutikawa K (1990), "Suppression of 6-TG-resistant mutations in V79 cells and recessive spot formations in mice by vanillin", Mutat Res 243: 151 -158 30 Juliane Strien, J S., Gita Mall (2013), "Enhancement of PCR Amplification of Moderate GC-Containing and Highly GC-Rich DNA", Sequences Mol Biotechno 31 Knorr, D., Caster, C., Do¨ rneburg, H., Dorn, R., Gra¨ f, S., Havin- and D 59 Frenkel, Podstolski, A., Werrman, U (1993) "Biosynthesis and yield improvement of food ingredients from plant cell and tissue cultures", Food Technol: 47, 57–63 32 Kramer, M F., & Coen, D M.(2001), "Enzymatic amplification of DNA by PCR: Standard procedures and optimization", Current Protocols in Immunology 24 33 Krings, U a R G B (1998), "Biotechnological production of flavours and fragrances", Appl Microbiol Biotechnol 49: 1-8 34 Kumar SS, P K., Sainis KB (2002), "Free radical scavenging activity of vanillin and o-vanillin using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical", Redox Rep : 35 -40 35 Lee, E G., S H Yoon, A Das, S H Lee, C Li, J Y Kim, M S Choi, D K Oh and S W Kim (2009), "Directing vanillin production from ferulic acid by increased acetyl-CoA consumption in recombinant Escherichia coli", Biotechnol Bioeng 102(1): 2000-2008 36 Li, T and J P Rosazza (2000), "Biocatalytic synthesis of vanillin", Appl Environ Microbiol 66(2): 684-687 37 Lo´ pez-Malo A, A S., Angriz A (1998), "Vanillin and pH synergistic effects on mould growth." Food Sci 63: 143 -146 38 Lomascolo,A.,C.Stentelaire,M.Asther,andL.Lesage-Meessen(1999)."Basidiomy cetes as new biotechnological tools to generate natural aromatic flavours for the food industry", Trends Biotechnol 17: 282-289 39 LR, F (1994.), " Antimutagens as cancer chemopreventive agents in the diet", Mutat Res 307: 395 - 410 40 Mokshagundam LRV, M S.( 2003),"Triglyceride reducing agent", US Patent 6: 599,522 41 Muheim A, L K C (1999),"Towards a high-yield bioconversion of ferulic acid to vanillin", Appl Microbiol Biotechnol 51(4): 456–461 42 Plaggenborg, R., J Overhage, A.Steinbuchel and H Priefert (2003), "Functional analyses of genes involved in the metabolism of ferulic acid in Pseudomonas 60 putida KT2440", Appl Microbiol Biotechnol 61(5-6): 528-535 43 Priefert, H., J Rabenhorst and A Steinbuchel (2001), "Biotechnological production of vanillin", Appl Microbiol Biotechnol 56(3-4): 296-314 44 Prince, R C a D E G (1994), "Just plain vanilla?" , Trends Biochem Sci 19: 521 45 Ravishankar, S R R a G (2000), "Vanilla flavour production by conventional and biotechnological routes", Journal of the Science of Food and Agriculture: 289-304 46 Sambrook J,Fritsch E F, Maniatis.T, (1989),"Molecular Cloning", Alaboratory manual second edition 47 Sang-Hwal Yoon, C L., Young-Mi Lee, Sook-Hee Lee, Sung-Hee Kim, Myung-Suk Choi, Weon-Taek Seo, Jae-Kyung Yang, Jae-Yeon Kim, Seon-Won Kim (2005), "Production of vanillin from ferulic acid using recombinant strains of Escherichia coli", Biotechnology and Bioprocess Engineering 10(4): 378-384 48 Sarangi, P K., & Sahoo, H P (, 2010) Journal of American Science 6(5): 1–5 49 Sinha, A K., U K Sharma and N Sharma (2008), "A comprehensive review on vanilla flavor: extraction, isolation and quantification of vanillin and others constituents", Int J Food Sci Nutr 59(4): 299-326 50 Susan Frackman Chakrabarti, R., & Schutt, C E (2001), "The enhancement of PCR amplification by low molecular-weight sulfones", Gene 274: 293–298 51 Vaghasiya YK, N R., Soni M, Baluja S, Chanda S (2004) "Synthesis, structural determination and antibacterial activity of compounds derived from vanillin and 4-aminoantipyrine", J Serb Chem Soc 69: 991 -998 52 Yamada, M., Y Okada, T Yoshida and T Nagasawa, (2007), "Applied Microbiology and Biotechnolog", 73: 1025–1030 53 Yamada, M., Okada, Y., Yoshida, T., & Nagasawa, T (2008), "Vanillin production using Escherichia coli cells over-expressing isoeugenol monooxygenase of Pseudomonas putida", Biotechnol Lett 30(4): 665-670 54 Yoon, S H., E G Lee, A Das, S H Lee, C Li, H K Ryu, M S Choi, W T 61 Seo and S W Kim (2007),"Enhanced vanillin production from recombinant E coli using NTG mutagenesis and adsorbent resin", Biotechnol Prog 23(5): 1143-1148 55 Yoon, S H., C Li, J E Kim, S H Lee, J Y Yoon, M S Choi, W T Seo, J K Yang, J Y Kim and S W Kim (2005),"Production of vanillin by metabolically engineered Escherichia coli," Biotechnol Lett 27(22): 1829-1832 56 Zheng, L Z., P.; Sun, Z.; Bai, Y.; Wang, J.; Guo, X (2007), "Production of vanillin from waste residue of rice bran oil by Aspergillus niger and Pycnoporus cinnabarinus", Bioresour Technol 98: 1115-1119 57 Zhang, Y., Xu, P., Han, S., Yan, H., & Ma, C (2006) Applied Microbiology and Biotechnology, 73(4), 771-779 PHỤ LỤC Hình 1: Ảnh sắc ký đồ thể kết giải trình tự gene fcs Hình 2: Kết dịch mã đoạn gene fcs sử dụng phần mềm vector NTI Hình 3: Kết so sánh trình tự gene fcs so sánh với ngân hàng genbank NCBI Query trình tự gene fcs chủng Amycolatopsis sp HR104 Sbjct trình tự gene fcs chủng Amycolatopsis sp HR167 Query TGCGCAACCAGGGTCTGGGCTCCTGGCCGGTGCGCCGCGCCAGGATGAGCCCGCACGCGA 61 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct TGCGCAACCAGGGTCTGGGCTCCTGGCCGGTGCGCCGCGCCAGGATGAGCCCGCACGCGA 61 Query 62 Sbjct 62 Query 122 Sbjct 122 Query 182 Sbjct 182 Query 242 Sbjct 242 Query 302 Sbjct 302 Query 362 Sbjct 362 Query 422 Sbjct 422 Query 482 Sbjct 482 Query 542 Sbjct 542 Query 602 Sbjct 602 Query 662 Sbjct 662 Query 722 Sbjct 722 Query 782 Sbjct 782 Query 842 Sbjct 842 Query 902 Sbjct 902 Query 962 Sbjct 962 CAGCCGTCCGGCACGGCGGGACGGCGCTGACCTACGCCGAGCTGTCCCGCCGCGTCGCGC 121 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCCGTCCGGCACGGCGGGACGGCGCTGACCTACGCCGAGCTGTCCCGCCGCGTCGCGC 121 GGCTCGCCAACGGGCTGCGGGCCGCCGGGGTCCGCCCCGGCGACCGGGTGGCCTACCTCG 181 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCTCGCCAACGGGCTGCGGGCCGCCGGGGTCCGCCCCGGCGACCGGGTGGCCTACCTCG 181 GGCCGAACCACCCGGCCTACCTGGAGACCCTGTTCGCGTGCGGGCAGGCCGGCGCGGTGT 241 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCCGAACCACCCGGCCTACCTGGAGACCCTGTTCGCGTGCGGGCAGGCCGGCGCGGTGT 241 TCGTGCCGCTGAACTTCCGGCTGGGCGTCCCGGAACTGGACCACGCGCTGGCCGACTCCG 301 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCGTGCCGCTGAACTTCCGGCTGGGCGTCCCGGAACTGGACCACGCGCTGGCCGACTCCG 301 GCGCGTCGGTCCTTATCCACACCCCGGAGCACGCGGAGACGGTCGCGGCGCTCGCCGCCG 361 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGCGTCGGTCCTTATCCACACCCCGGAGCACGCGGAGACGGTCGCGGCGCTCGCCGCCG 361 GCCGGCTGCTGCGCGTGCCCGCGGGCGAGCTGGACGCCGCGGACGACGAGCCGCCCGACC 421 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCGGCTGCTGCGCGTGCCCGCGGGCGAGCTGGACGCCGCGGACGACGAGCCGCCCGACC 421 TGCCCGTCGGCCTCGACGACGTGTGCCTGCTGATGTACACCTCGGGCAGCACCGGACGCC 481 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCCCGTCGGCCTCGACGACGTGTGCCTGCTGATGTACACCTCGGGCAGCACCGGACGCC 481 CCAAGGGCGCGATGCTCACCCACGGCAACCTCACCTGGAACTGCGTCAACGTCCTGGTGG 541 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCAAGGGCGCGATGCTCACCCACGGCAACCTCACCTGGAACTGCGTCAACGTCCTGGTGG 541 AGACCGACCTGGCGAGCGACGAGCGGGCACTGGTCGCCGCGCCGCTGTTCCACGCCGCCG 601 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGACCGACCTGGCGAGCGACGAGCGGGCACTGGTCGCCGCGCCGCTGTTCCACGCCGCCG 601 CGCTCGGCATGGTGTGCCTGCCCACCCTGCTCAAGGGCGGCACGGTGATCCTGCACTCCG 661 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCTCGGCATGGTGTGCCTGCCCACCCTGCTCAAGGGCGGCACGGTGATCCTGCACTCCG 661 CGTTCGACCCCGGCGCCGTGCTGTCCGCGGTGGAACAGGAGCGGGTCACGCTCGTGTTCG 721 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGTTCGACCCCGGCGCCGTGCTGTCCGCGGTGGAACAGGAGCGGGTCACGCTCGTGTTCG 721 GCGTGCCCACGATGTACCAGGCGATCGCCGCGCACCCGCGGTGGCGCAGCGCCGACCTGT 781 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGTGCCCACGATGTACCAGGCGATCGCCGCGCACCCGCGGTGGCGCAGCGCCGACCTGT 781 CCAGCCTGCGGACCCTGCTGTGCGGCGGCGCGCCGGTGCCCGCCGACCTCGCCAGCCGCT 841 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCAGCCTGCGGACCCTGCTGTGCGGCGGCGCGCCGGTGCCCGCCGACCTCGCCAGCCGCT 841 ACCTCGACCGCGGGCTCGCGTTCGTGCAGGGCTACGGCATGACCGAGGCCGCGCCGGGCG 901 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCTCGACCGCGGGCTCGCGTTCGTGCAGGGCTACGGCATGACCGAGGCCGCGCCGGGCG 901 TGCTGGTCCTCGACCGCGCGCACGTCGCGGAGAAGATCGGCTCCGCCGGGGTGCCCTCGT 961 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTGGTCCTCGACCGCGCGCACGTCGCGGAGAAGATCGGCTCCGCCGGGGTGCCCTCGT 961 TCTTCACCGACGTGCGGCTGGCCGGCCCGTCCGGCGAGCCGGTGCCGCCGGGGGAGAAGG 1021 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTTCACCGACGTGCGGCTGGCCGGCCCGTCCGGCGAGCCGGTGCCGCCGGGGGAGAAGG 1021 Query 1022 GCGAGATCGTGGTCAGCGGGCCCAACGTGATGAAGGGCTACTGGGGCAGGCCGGAGGCGA 1081 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1022 GCGAGATCGTGGTCAGCGGGCCCAACGTGATGAAGGGCTACTGGGGCAGGCCGGAGGCGA 1081 Query 1082 CCGCCGAGGTGCTGCGCGACGGGTGGTTCCACTCCGGCGACGTGGCCACCGTGGGCGGCG 1141 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| Sbjct 1082 CCGCCGAGGTGCTGCGCGACGGGTGGTTCCACTCCGGCGACGTGGCCACCGTGGACGGCG 1141 Vị trí 1136 Query 1142 ACGGGTACTTCCACGTCGTCGACCGGCTCAAGGACATGATCATCTCCGGCGGCGAGAACA 1201 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1142 ACGGGTACTTCCACGTCGTCGACCGGCTCAAGGACATGATCATCTCCGGCGGCGAGAACA 1201 Query 1202 TCTACCCGGCCGAGGTGGAGAACGAGCTGTACGGCTACCCGGGTGTGGAGGCGTGCGCCG 1261 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1202 TCTACCCGGCCGAGGTGGAGAACGAGCTGTACGGCTACCCGGGTGTGGAGGCGTGCGCCG 1261 Query 1262 TGATCGGCGTGCCGGACCCGCGCTGGGGCGAGGTGGGCAAGGCGGTCGTCGTGCCCGCCG 1321 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1262 TGATCGGCGTGCCGGACCCGCGCTGGGGCGAGGTGGGCAAGGCGGTCGTCGTGCCCGCCG 1321 Query 1322 ACGGGAGCCGCATCGACGGCGACGAGCTGCTGGCCTGGCTGCGCACCCGGCTGGCCGGGT 1381 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1322 ACGGGAGCCGCATCGACGGCGACGAGCTGCTGGCCTGGCTGCGCACCCGGCTGGCCGGGT 1381 Query 1382 ACAAGGTGCCCAAGTCGGTCGAGTTCACCGACCGGCTGCCCACGACCGGCTCCGGCAAGA 1441 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1382 ACAAGGTGCCCAAGTCGGTCGAGTTCACCGACCGGCTGCCCACGACCGGCTCCGGCAAGA 1441 Query 1442 TCCTCAAGGGCGAGGTCCGCCGCCGCTTCGGCTGA 1476 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1442 TCCTCAAGGGCGAGGTCCGCCGCCGCTTCGGCTGA 1476 Hình 4: Kết so sánh trình tự gene fcs chủng Amycolatopsis sp HR104 với trình tự gene fcs chủng Amycolatopsis sp HR167 đƣợc công bố ngân hàng gene NCBI Sbjct: Trình tự amino acid gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp HR104 Query: Trình tự amino acid gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp HR167 công bố ngân hàng gene NCBI Sai khác Hình 5: Kết so sánh trình tự amino acid gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp HR104 với trình tự amino acid gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp HR167 đƣợc công bố ngân hàng gene NCBI [...]...3 1.2 Mục tiêu của đề tài - Tách dòng và giải trình tự gene fcs mã hóa enzyme feruloyl- coa - synthase từ chủng Amycolatopsis sp HR104 1.3 Yêu cầu của đề tài - Tách dòng và giải trình tự gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp HR104 1.4 Ý nghĩa của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Tách dòng và giải trình tự gene fcs tạo tiền đề cho nghiên cứu tổng hợp vanillin trong E coli... cần tách dòng các gene mã hóa cho enzyme có khả năng phân giải cơ chất thành vanillin từ vi sinh vật đã biết, sau đó đưa gene đó vào vector biểu hiện, biến nạp vào tế bào vật chủ thích hợp cho phép sự biểu hiện 2.4.1 Các gene mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic Các gene mã hóa cho cho enzyme sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic được xác định là gene fcs mã hóa cho enzyme feruloyl- coA. .. vanillin Acid ferulic bị chuyển hóa 23 thành Feruloyl- coA dưới sự xúc tác của enzyme feruloyl- coA synthetase (mã hóa bởi gene fcs) sử dụng ATP và CoA Sau đó Feruloyl- coA cộng nước tạo thành 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-hydroxypropionyl -CoA và phân tách nước tạo ra vanillin và acety -coA dưới sự xúc tác của enzymenoyl -CoA hydratase/aldolase mã hóa bởi gene ech Sự tích lũy acety -CoA trong tế bào gây ra hai vấn... phân feruloyl- ScoA thành một hợp chất trung gian tạm thời 4-hydroxy-3-methoxyphenul-b-hydroxypropionyl-ScoA và tách chuỗi bên tạo thành vanillin và acetyl-ScoA Gene thứ ba liên kết với gene fcs và gene ech mã hóa enzyme vanillin-xidroreductase được cảm ứng bởi acid ferulic Các gene và enzyme tham gia vào các phản ứng tương ứng đã được xác định ở các chủng vi sinh vật khác nhau như Amycolatopsis sp HR167... gene mã hóa enzyme trong quá trình sinh tổng hợp vanillin Con đường tổng hợp vanillin từ acid ferulic trong vi sinh vật được biểu diễn ở hình 2.7 : Hình 2.7: Vi sinh vật tổng hợp vanillin từ acid ferulic (Yoon, Li et al 2005) [55] Trong vi sinh vật acid ferulic được hoạt hóa feruloyl- CoA dưới sự xúc tác của enzyme feruloyl- coA synthetase mã hóa bởi gene fcs, sau đó feruloyl- CoA tiếp tục ngậm nước và. .. Zhang, 2006 [57] 3.2 Hua, 2007 [27] 16.1 Yamada, 2007 [52] Achterholt, Priefert et Amycolatopsis sp HR167 19,9 Chủng Amycolatopsis sp HR104 0.58 Amycolatopsis sp niger I-1472 3.6 Staphylococcus aureus 0.045 Chủng tái tổ hợp Escherichia coli mang gene tách dòng từ chủng 5,14 Amycolatopsis sp. HR104 Chủng tái tổ hợp Các chủng tái tổ hợp Schizosaccharomyces pombe Nguồn tham khảo 0.065 al 2000 [5] Yoon et... bào từ chủng tái tổ hợp E coli JM109 tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và các thông số chuyển hóa cùng với sự tái sử dụng sinh khối có thể sản xuất lượng sản phẩm 2,52 g vanillin trên mỗi lít môi trường (Barghini, Di Gioia et al 2007) [7] Năm 2007 Sang-hwal-Yood và cộng sự nghiên cứu việc sử dụng plamid pDAHEF được tách dòng từ chủng Amycolatopsis HR104 gồm các gene mã hóa enzyme: gene fcs (feruloyl- coAsynthetase)... phụ thuộc CoA) (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14] Con đường này có ba bước xúc tác với sự tham gia của hai enzyme: 4hydroxycinnamate -CoA ligase (4-CL) hay feruloyl- CoA syntheatase, được mã hóa bởi gene fcs và 4-hydroxycinnamate- CoA- hydratase/lyase (HCHL) hay 11 enoyl -CoA hydratase/lyase được mã hóa bởi gene ech Trên con đường này enzyme 4-CL chuyển acid ferulic thành feruloyl- ScoA, sau đó enzyme HCHL... [55] Năm 2007, Paolo Barghiniv và cộng sự đã nghiên cứu và tổng hợp vanillin từ chủng E.coli tái tổ hợp chứa plasmid mang số bản sao thấp Sử dụng gene mã hóa enzyme feruloyl- CoA synthetase và feruloyl hydratase/aldolase từ chủng Pseudomonas fluorescens BF13 Một lượng lớn vanillin được sản xuất sử chủng Ecoli JM109 Chủng tái tổ hợp sử dụng vector có số lượng bản sao thấp và sử dụng promoter có khả năng... hiện, gene fcs là gene đầu tiên trong quá trình chuyển hóa vanillin từ ferulic acid 24 2.5 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc 2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về quá trình sản xuất vaillin từ các chủng tái tổ hợp đã được công bố Năm 2005 Sang-hwal-Yood và cộng sự sản suất vanillin từ chủng E coli tái tổ hợp, tách dòng gene fcs (feruloyl- coAsynthetase)