ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o HOÀNG HẢI YẾN Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG DẠ CỎ ĐỘNG VẬT NHAI LẠI VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG BẢO VỆ MƠI TRƢỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chun ngành Khoa Khóa học : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2011 - 2015 Thái Nguyên, năm 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o HOÀNG HẢI YẾN Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG DẠ CỎ ĐỘNG VẬT NHAI LẠI VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƢỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Lớp : K43 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : TS Trần Văn Chí Thái Nguyên, năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp em nhận nhiều giúp đỡ từ ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, thầy cô hướng dẫn, bạn bè gia đình Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Văn Chí, giảng viên khoa Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tạo điều kiện, hướng dẫn tận tình giúp đỡ em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời tri ân tới thầy cô giáo ngồi khoa Cơng nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên ân cần dạy dỗ, truyền đạt kiến thức chuyên môn kinh nghiệm sống Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Thái Ngun, ngày tháng Sinh viên HOÀNG HẢI YẾN năm 2015 ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các vi sinh vật có khả phân hủy cellulose 13 Bảng 3.1: Môi trường CMC 21 Bảng 3.2: Môi trường thử hoạt tính cellulose 22 Bảng 4.1: Thử sơ hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn 36 Bảng 4.2: Giá trị OD (mật độ quang) canh trường 38 Bảng 4.3: Hoạt tính enzyme cellulase phương pháp đục lỗ thạch 40 Bảng 4.4: Hàm lượng glucose thay thành phần CMC môi trường ban đầu 42 Bảng 4.5: Hàm lượng saccharose thay thành phần CMC môi trường ban đầu 43 Bảng 4.6: Tối ưu điều kiện mơi trường có bổ sung nguồn nitơ 45 Bảng 4.7: Thử khả kết hợp chủng vi khuẩn nấm mốc phương pháp đếm khuẩn lạc 47 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc phân tử cellulose Hình 2.2: Sơ đồ phân giải cellulose Srinivasan, 1973 15 Hình 4.1: Hình ảnh cấy trang vi sinh vật mơi trường đĩa thạch 34 Hình 4.2: Hình ảnh cấy chuyển khuẩn lạc để giữ giống vi khuẩn 35 Hình 4.3: Hình ảnh dịch enzyme 39 Hình 4.4: Xác định hoạt tính phương pháp đục lỗ thạch 40 Hình 4.5: Hình dạng tế bào khuẩn lạc chủng vi khuẩn B20 46 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CBD : Cellulose binding domain CMC : Careboxymethyl cellulose HEC : Hydroxyethyl cellulose OD : Optical density v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung vi sinh vật vi khuẩn phân giải cellulose 2.1.1 Giới thiệu vi sinh vật 2.1.2 Vi khuẩn phân giải cellulose 2.2 Enzyme từ vi sinh vật 2.2.1 Giới thiệu chung cellulose 2.2.2 Enzyme cellulase 2.3 Ứng dụng công nghệ vi sinh vật xử lý rác thải 15 2.4 Tình hình nghiên cứu nước nước 18 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 19 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 19 Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng (vật liệu) phạm vi nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng (vật liệu) nghiên cứu 20 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.1.3 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 20 3.1.4 Thiết bị hóa chất nghiên cứu 20 vi 3.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 21 3.2.1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose: môi trường CMC (MT1) 21 3.2.2 Môi trường thử nghiệm khả phân giải cellulose (MT2) 22 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.4 Phương pháp nghiên cứu: 22 3.4.1 Tiến hành phân lập vi khuẩn 23 3.4.2 Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập 25 3.4.3 Xác định khả phân giải cellulose chủng vi khuẩn 25 3.4.4 Đo mật độ tế bào phương pháp đo OD 28 3.4.5 Phương pháp thử khả phân giải cellulose phương pháp đục lỗ thạch môi trường thử nghiệm 29 3.4.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn 30 3.4.7 Định danh vi khuẩn 32 3.4.8 Thử khả kết hợp chủng vi khuẩn tuyển chọn với chủng vi sinh vật (nấm mốc) 32 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose 34 4.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn 34 4.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose 37 4.2 Kết tối ưu hóa điều kiện mơi trường 41 4.2.1 Thử khả đồng hóa nguồn cacbon 41 4.2.2 Thử khả đồng hóa nguồn nitơ 43 4.3 Định danh sơ vi khuẩn 46 vii 4.4 Thử khả kết hợp chủng vi khuẩn tuyển chọn với chủng vi sinh vật khác (nấm mốc) 47 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 PHỤ LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, ngành Công nghệ Sinh học phát triển mạnh mẽ, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực đời sống như: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế [26, 27] Một số enzyme sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase, glucooxydase, cellulase Trong số cellulase enzyme nhận nhiều quan tâm nhà khoa học chúng ứng dụng vào nhiều mục đích khác q trình chuyển hóa chất liệu chứa cellulose, công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi trường [7, 23] Đặc biệt ngành công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học, cellulase nghiên cứu phát triển để giải vấn đề thiếu nhiên liệu nguồn nhiên liệu truyền thống ngày cạn kiệt giải vấn đề ô nhiễm môi trường [28] Nước ta nước nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase phong phú, khoảng nửa hợp chất cacbon sinh khối mặt đất cellulose, chiếm tới 35-50% lượng sinh khối thực vật Tất sản phẩm sinh khối khống hóa nhờ hệ thống enzyme cung cấp vi sinh vật Hệ thống phân giải cellulose thường chậm khơng hồn tồn Tuy nhiên khoảng thời gian ngắn (48h) hệ vi sinh vật cỏ (vi khuẩn kỵ khí) phân giải 60 - 65 % cellulose [4] Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên Việt Nam quan tâm 40  Tuyển chọn chủng vi khuẩn dựa vào hoạt tính enzyme phương pháp đục lỗ thạch môi trường thử nghiệm Dựa vào kết đo OD (bảng 4.2), chủng vi khuẩn có giá trị OD cao B12, B15, B20 lựa chọn để khảo sát hoạt tính sinh cellulase phương pháp đục lỗ thạch môi trường thử nghiệm kết sau: Hình 4.4: Xác định hoạt tính phương pháp đục lỗ thạch Bảng 4.3: Hoạt tính enzyme cellulase phƣơng pháp đục lỗ thạch STT Chủng vi sinh vật B12 B15 B20 Hoạt tính cellulase (D-d,cm) 1,2 1,0 1,2 41 Qua bảng đựa vào kết thử nghiệm hoạt tính cellulase, thấy chủng đem thử hoạt tính enzyme chủng B12, B20 cho kết tốt, D-d =1,2 cm tức chủng vi khuẩn B12, B20 có hoạt tính enzyme trung bình Dựa vào thử nghiệm hoạt tính sơ ban đầu, thử nghiệm dựa vào khả tăng sinh (kết đo OD) thử nghiệm hoạt tính enzyme phương pháp đục lỗ thạch môi trường thử nghiệm ta nhận thấy chủng B20 có khả phân giải enzyme khả tăng sinh tốt → Chúng chọn B20 để tiến hành nghiên cứu 4.2 Kết tối ƣu hóa điều kiện mơi trƣờng Mơi trường CMC môi trường nghèo chất dinh dưỡng (môi trường có muối thành phần CMC) Để đánh giá khả tăng sinh vi khuẩn môi trường tối ưu hơn, tiến hành thay phần CMC nguồn cacbon (đường glucose, saccharose) bổ sung nguồn nitơ (NH4N03) 4.2.1 Thử khả đồng hóa nguồn cacbon - Để xác định ảnh hưởng nguồn cacbon tới sinh trưởng vi khuẩn sử dụng môi trường CMC, hàm lượng CMC thay nguồn cacbon: glucose, saccarose, hàm lượng chất thay lấy hàm lượng cacbon môi trường CMC (tiến hành thay hàm lượng: 0,1g; 0,2g; 0,3g; 0,4g; 0,5; 0,6g; 0,7g; 0,8g; 0,9g; 1,0g) Ta tiến hành đo OD 36 giờ, từ mốc 24 - 36 mật độ tế bào thay đổi không đáng kể Nên bảng số liệu chúng tơi trình bày kết đo OD đến mốc 24 Ta thu kết bảng sau: 42 Bảng 4.4: Hàm lƣợng glucose thay thành phần CMC môi trƣờng ban đầu Thời gian (h) Hàm lượng 12 15 18 21 24 nguồn dinh dưỡng C (g) Glucose CMC 0,1 0,9 0,123 0,397 0,638 0,642 0,657 0,673 0,686 0,578 0,581 0,2 0,8 0,135 0,379 0,698 0,749 0,898 0,910 1,019 0,901 0,935 0,3 0,7 0,139 0,360 0,706 0,806 0,997 1,068 1,214 1,094 1,196 0,4 0,6 0,137 0,532 0,686 0,799 1,045 1,089 1,335 1,236 1,236 0,5 0,5 0,171 0,540 0,747 0,879 1,019 1,052 1,258 1,262 1,271 0,6 0,4 0,155 0,501 0,736 0,883 1,052 1,102 1,339 1,260 1,288 0,7 0,3 0,160 0,349 0,644 0,954 1,115 1,134 1,363 1,366 1,381 0,8 0,2 0,185 0,526 0,633 0,743 0,974 0,974 1,002 1,002 1,010 0,9 0,1 0,126 0,335 0,495 0,679 0,880 0,918 0,928 0,930 0,930 1,0 0,149 0,336 0,441 0,689 0,723 0,814 1,113 1,206 1,435 Từ kết đo OD ta xác định hàm lượng đường thay vào môi trương thích hợp 0,4g glucose Với tỉ lệ glucose 0,6g khả tăng sinh so với hàm lượng glucose 0,4g cao khơng đáng kể, xét mặt kinh tế sản xuất hàm lượng glucose cao đẫn đến giá thành cao, hàm lượng glucose 0,4g thích hợp Từ bảng số liệu trên, ta thấy thay hàm lượng CMC glucose số lượng tế bào tăng nhanh đạt giá trị lớn tỉ lệ CMC/glucose 6/4 (tức 1lit mơi trường, có hàm lượng CMC 10g ta bớt 4g thay vào ta bổ sung lượng glucose tương ứng 4g), thời gian đạt giá trị cân động rút ngắn đáng kể từ 3036 môi trường CMC ban đầu xuống 12-18h (giảm 50% thời lượng) 43 Bảng 4.5: Hàm lƣợng saccharose thay thành phần CMC môi trƣờng ban đầu Thời gian (h) Hàm lượng 12 15 18 21 24 nguồn dinh dưỡng C (g) Saccharose CMC 0,1 0,9 0,035 0,114 0,456 0,709 0,781 0,784 0,769 0,762 0,760 0,2 0,8 0,099 0,117 0,408 0,559 0,567 0,569 0,599 0,802 1,089 0,3 0,7 0,089 0,139 0,421 0,922 1,112 0,890 0,793 0,773 0,771 0,4 0,6 0,062 0,116 0,435 0,766 1,074 0,540 0,737 0,949 1,175 0,5 0,6 0,5 0,4 0,082 0,084 0,131 0,119 0,434 0,236 0,935 0,717 1,181 1,081 1,182 1,102 1,183 1,107 1,191 1,138 1,248 1,147 0,7 0,3 0,089 0,134 0,507 0,874 1,114 1,116 1,117 1,124 1,205 0,8 0,2 0,069 0,105 0,353 0,813 1,071 1,075 1,084 1,086 1,152 0,9 0,1 0,068 0,076 0,364 0,625 1,029 1,031 1,033 1,045 1,098 1,0 0,011 0,043 0,309 0,702 0,858 1,219 1,220 1,227 1,248 Từ kết đo OD ta xác định hàm lượng đường thay vào mơi trường thích hợp 0,5g saccharose Từ bảng số liệu trên, ta thấy thay hàm lượng CMC saccharose số lượng tế bào tăng nhanh đạt giá trị lớn tỉ lệ CMC/saccharose 5/5 (tức lít mơi trường, có hàm lượng CMC 10g ta bớt 5g thay vào ta bổ sung lượng saccharose tương ứng 5g), thời gian đạt giá trị cân động rút ngắn đáng kể từ 30-36 môi trường CMC ban đầu xuống 12-18 (giảm 50% thời lượng) 4.2.2 Thử khả đồng hóa nguồn nitơ Để xác định ảnh hưởng nguồn nitơ ta tiến hành thử nghiệm sau: - Chuẩn bị bình tam giác chứa 100ml môi trường lỏng (CMC) bổ sung nguồn nitơ (NH4N03) 0,25g; 0,5g; 0,75g;1,0g, hấp khử trùng 44 - Chuẩn bị bình tam giác chứa 100ml mơi trường lỏng có 0,6g CMC + 0,4g glucose bổ sung nguồn nitơ (NH4N03) 0,25g; 0,5g; 0,75g;1,0g, hấp khử trùng - Chuẩn bị bình mơi trường làm đối chứng, hấp khử trùng - Hòa mẫu 7ml nước cất khử trùng, sau tiến hành cấy mẫu vào mơi trường chuẩn bị, nuôi lắc nhiệt độ 370C với tốc độ 100 r/min - Tiến hành đo OD bước sóng 590nm, chế độ VIS chọn bước nhảy Kết trình bày bảng đây: 45 Bảng 4.6: Tối ƣu điều kiện mơi trƣờng có bổ sung nguồn nitơ Thời gian (h) Mơi trường có 12 15 18 21 24 27 30 0,25g/100ml 0,033 0,035 0,041 0,046 0,051 0,054 0,056 0,058 0,062 0,065 0,068 0,5g/100ml 0,085 0,091 0,091 0,092 0,096 0,097 0,097 0,099 0,101 0,103 0,103 0,75g/100ml 0,080 0,083 0,087 0,091 0,092 0,098 0,098 0,099 0,101 0,102 0,102 1g/100ml 0,090 0,091 0,096 0,097 0,098 0,105 0,106 0,107 0,110 0,112 0,113 0,25g/100ml 0,205 0,483 0,495 0,501 0,509 0,532 0,541 0,552 0,552 0,558 0,560 0,5g/100ml 0,126 0,554 0,685 0,686 0,726 0,729 0,730 0,731 0,738 0,749 0,787 0,75g/100ml 0,152 0,555 0,722 0,735 0,735 0,740 0,741 0,749 0,720 0,721 0,722 1g/100ml 0,160 0,520 0,764 0,768 0,790 0,798 0,803 0,813 0,829 0,831 0,830 CMC 0,043 0,063 0,068 0,068 0,069 0,069 0,071 0,072 0,076 0,073 0,072 CMC có bổ sung glucose 0,088 0,524 0,959 1,064 1,164 1,202 1,281 1,298 1,305 1,289 1,276 bổ sung nguồn nitơ theo tỷ lệ Mơi trường CMC Mơi trường CMC có bổ sung glucose Mẫu đối chứng 46 Thí nghiệm bổ sung nguồn nitơ vào mơi trường nghiên cứu trình bày bảng 4.6, ta thấy hàm lượng nitơ bổ sung có ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển vi khuẩn lượng nitơ bổ sung vào môi trường có bổ sung glucose đạt tỉ lệ cao Trong thời gian nghiên cứu so với mẫu đối chứng CMC có bổ sung nitơ hàm lượng tăng gấp 20 lần so với CMC khơng có nitơ Từ ta rút mơi trường tối ưu để nuôi cấy vi sinh vật (vi khuẩn) môi trường có bổ sung hàm lượng nitơ với tỉ lệ 1:1 (1g CMC : 1g nitơ), hàm lượng glucose tỉ lệ 6:4 (6g CMC : 4g glucose), 4.3 Định danh sơ vi khuẩn Định danh sơ vi khuẩn phân lập tuyển chọn dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào tính chất hóa sinh Qua kết nghiên cứu tơi nhận thấy chủng vi khuẩn B20 có đặc điểm sau: - Đặc điểm hình thái: khuẩn lạc trịn , mặt trơn mịn, màu trắng sữa - Hình thái vi thể: vi khuẩn có hình que ngắn - Khuẩn lạc bắt màu thuốc nhuộm (tím tinh thể) vi khuẩn Gram + (dương) → Có thể đưa kết luận sơ chủng vi khuẩn B20 phân lập tuyển chọn thuộc chi Bacillus Hình 4.5: Hình dạng tế bào khuẩn lạc chủng vi khuẩn B20 47 4.4 Thử khả kết hợp chủng vi khuẩn tuyển chọn với chủng vi sinh vật khác (nấm mốc) Khi nuôi cấy kết hợp phương pháp đếm khuẩn lạc phương pháp tối ưu nhất, ta tiến hành thử khả kết hợp chủng vi khuẩn B20 chủng nấm mốc M17C (Aspergillus) cách nuôi cấy kết hợp chủng vi sinh vật môi trường nuôi cấy CMC nồng độ pha loãng 10-8 ta thu kết bảng sau: Bảng 4.7: Thử khả kết hợp chủng vi khuẩn nấm mốc phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Nuôi cấy kết hợp Vi khuẩn đối chứng Số lƣợng tế bào vi Số lƣợng tế bào nấm mốc khuẩn×108 ×108 12h 24h 36h 48h 12h 24h 36h 48h 1,1 3,1 7.0 8,1 1,1 2,3 4,3 7,1 1,3 4,2 7,5 9,1 1,2 2.5 5,1 8,0 Nấm mốc đối chứng - Qua kết bảng cho ta thấy nuôi cấy kết hợp chủng vi sinh vật có tác động qua lại định, nhiên khả tăng sinh không cao nuôi cấy riêng rẽ - Đưa định hướng để xác định tổ hợp vi sinh vật chứa vi khuẩn nấm mốc sinh cellulase cao, hỗ trợ cho việc sản xuất chế phẩm sinh học xử lý rác thải 48 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đạt được, rút số kết luận sau: Từ mẫu dịch cỏ động vật nhai lại ban đầu phân lập 25 chủng vi khuẩn Qua kiểm tra sơ hoạt tính phân giải cellulose chủng chọn 23 chủng có khả phân giải cellulose để nghiên cứu tiếp Các chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose Trong chủng vi khuẩn B20 có khả phân giải cellulose cao so với chủng vi khuẩn lại, hoạt tính phân cellulose theo D-d (cm) 1,2cm (hoạt tính trung bình) Chủng vi khuẩn B20 phát triển thích hợp điều kiện có bổ sung 40% đường glucose 50% đường saccharose vào môi trường nuôi cấy ban đầu (CMC) bổ sung thêm hàm lượng nitơ (NH4NO3), vi khuẩn phát triển mạnh ta bổ sung 1g NH4NO3 vào mơi trường ni cấy CMC có bổ sung glucose Định danh sơ dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào tính chất hóa sinh cho thấy chủng vi khuẩn B20 thuộc chi Bacillus Khi nuôi cấy kết hợp chủng vi sinh vật chúng có tác động qua lại định, nhiên khả tăng sinh không cao nuôi cấy riêng rẽ 5.2 Kiến nghị Trong phạm vi nghiên cứu đề tài cho thấy enzyme cellulase tách từ chủng vi khuẩn B20 có hoạt độ khả phân giải cellulose tương đối cao Đây kết nghiên cứu phạm vi phịng thí nghiệm 49 số hạn chế điều kiện nghiên cứu, thiết bị máy móc thời gian tiến hành nghiên cứu nên nghiên cứu chưa hoàn toàn trọn vẹn Vì chúng tơi có số kiến nghị sau: - Cần tiếp tục sâu định danh vi khuẩn B20 đến chủng loài phương pháp đại - Tiếp tục nghiên cứu điều kiện tối thích cho chủng vi khuẩn B20 phát triển tốt - Nghiên cứu chế tác động vi khuẩn nấm mốc sinh cellulase để thiết lập hệ vi sinh tốt hơn, hỗ trợ cho việc sản xuất chế phẩm sinh học xử lý rác thải bảo vệ môi trường 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Quang Mai, Cù Xuân Dần (2007), Sinh lý học vật nuôi, NXB Đại học Sư phạm Hà Thanh Toàn, Mai Thu Thảo, Nguyễn Thu Phướng, Trần Lê Kim Ngân, Bùi Thế Vinh Cao Ngọc Điệp, 2008 “Phân lập vi khuẩn phân giải cellulase, tinh bột, protein nước rỉ từ bãi rác thành phố Cần Thơ” Tạp chí Khoa học, pp 195-202 Phạm Thị Phương (2011), Bài giảng thực hành vi sinh vật công nghệ lên men, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Võ Văn Phước Quệ, Cao Ngọc Diệp (2011), Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose, Tạp chí Khoa học 2011:18a 177-184 Hồ Viết Quý (2012), Cơ sở hóa học phân tích đại, tập 4, Các phương pháp toán học thống kê ứng dụng hóa học đại, NXB ĐH Sư Phạm Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Đường, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoàn (2009), Giáo trình sinh học đất, NXB Giáo dục Hồ Sỹ Tráng (2006), Cơ sở hóa học gỗ celluloza tập 2, Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội, NXB Khoa học Kỹ thật Trần Cẩm Vân (2005), Giáo trình vi sinh học vật mơi trường, NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội Lương Đức Phẩm (2009), Cơ sở khoa học công nghệ bảo vệ môi trường, NXB Giáo dục, Hà Nội 10 Tăng Thị Chính (2005), Cơng nghệ xử lý chất hữu phế thải nông nghiệp sinh hoạt vi sinh vật ưa nhiệt, Tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị mơi trường tồn quốc 51 11 Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thùy Dương (2008), Công nghệ sinh học môi trường tập xử lý chất thải hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiền, Hồng Hải, Vũ Thị Hồn (2007), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo dục 13 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Thị Hiền (2007), Vi sinh học nông nghiệp, NXB Đại học Sư phạm 14 Lê Gia Huy (2010), Giáo trình vi sinh vật xử lý chất thải, NXB Giáo dục Việt Nam 15 Phạm Hồng Hải, Ngô Kim Chi (2007), Xử lý số liệu quy hoạch thực nghiệm nghiên cứu hóa học NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội 16 Nguyễn Hữu Chấn, Enzyme xúc tác sinh học, NXB Y học Hà Nội 17 Bùi Huy Hiển (2010), “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nhanh phế thải chăn nuôi’’, Báo cáo tổng kết đề tài, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, Hà Nội Tài liệu tiếng anh 18 Coughlan, M.P (1994), Enzyme hydrolysis of cellulose: an overview Bioresource Technology 19 King K W (1969), Enzyme of the cellulase complex, Gould R F Cellulases and their application, American chemical society, pp 7-25 20 Li X H., Yang H J, Roy B., Wang D., Yue W F, Jiang L J and Enoch Y., 2009, “The most stirring technology in future: Cellulase enzyme and biomass utilization”, African Journal of Biotechnology Vol (11), pp 2418-2422 52 21 Lynd L R., Weimer P J., Zyl W H V., and Pretorius I S., 2002, “Microbial Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology”, Microbiology 22 Jervis E J., Haynes C A., Kilburn D G., 1997, “Surface diffusion of cellulases and their isolated binding domains on cellulose”, J Biol Chem 272(38):24016-24023 23 Sukumaran R K., Singhania R R and Pandey A., 2005, “Microbial cellulases-Production, applications and challenges”, Journal of Scientific and Industrial Research, volume 64, pp 832-844 24 Aihemaiti M , Zhen F, Li Y, Aibaidoula G, Yimit W., 2013, “Isolation and identification of rumen bacteria for cellulolytic enzyme production” 25 Yan-Ling Liang, Zheng Zhang, Min Wu, Yuan Wu, and Jia-Xun Feng., 2014 “Isolation, Screening, and Identification of Cellulolytic Bacteria from Natural Reserves in the Subtropical Region of China and Optimization of Cellulase Production by Paenibacillus terrae ME27-1” 26 2011, Enzymes in industrial applications: Global markets 27 Sanchez S, Demain AL (2011), Enzymes and bioconversions of industrial, pharmaceutical, and biotechnological significance, Org Process Res Dev 15: 224–230 28 Himmel, ME (2007), Biomass recalcitrance: Engineering plants and enzymes for biofuels production, Science 316: 982–982 29 Lori MR and Gleen HC (1989), “Cellulases of bacterial origin” Enzyme and Microbial Technology, Vol 11: 626-644 PHỤ LỤC a 1A: Thử nghiệm đục lỗ thạch 1B: Thử nghiệm cỏ Hình 1: Một số hình ảnh thử nghiệm sơ khả phân giải cellulose vi khuẩn