MỞ ĐẦU Tệ nạn ma tuý hiểm hoạ cho toàn xã hội, gây tổn hại sức khoẻ, làm suy thối nịi giống, phẩm giá người, phá hoại hạnh phúc gia đình gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến trật tự, an toàn xã hội an ninh quốc gia Tệ nạn ma túy tác nhân tăng nhanh loại tội phạm khác, đặc biệt nguyên nhân làm lây lan đại dịch HIV/AIDS Giám định ma tuý hoạt động tố tụng, sản phẩm kết luận giám định Theo quy định pháp luật, kết luận chất ma tuý nguồn chứng bắt buộc để luận tội định khung hình phạt, ảnh hưởng trực tiếp đến sinh mạng, trị cơng dân Do đó, q trình giám định chất ma tuý phải thực theo quy trình chuẩn thẩm định để đảm bảo kịp thời, xác, khách quan đồng kết phịng thí nghiệm m-TFMPP chất tổng hợp gây nghiện có tác dụng kích thích thần kinh trung ương kiểu thuốc lắc (ecstasy) Trước bùng phát chất gây nghiện này, nhiều quốc gia đưa m-TFMPP vào danh mục cần kiểm soát như: Đan mạch (12/2005), Thụy Điển (3/2006), New Zealand (Ở nước ta nay, mTFMPP quan tham mưu đề xuất Chính Phủ đưa vào danh mục chất ma túy cần kiểm sốt Ngày 22/2/2011 phủ ban hành nghị định số 17/2011/NĐCP bổ sung vào danh mục chất ma túy) Cho đến chưa có cơng trình nghiên cứu, xây dựng quy trình giám định m-TFMPP Điều gây khó khăn khơng nhỏ cho quan điều tra thời hiệu tạm giữ đối tượng có hạn khó khăn cho giám định viên bảo vệ kết luận giám định trước tòa Trên giới tiến hành nghiên cứu, giám định loại ma túy GCMS sử dụng rộng rãi phổ biến Vì vậy, luận văn tập trung tiến hành nghiên cứu, xây dựng quy trình giám định định tính định lượng chất m- TFMPP (1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]piperazine) sắc kí khí ghép nối khối phổ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.1 Lịch sử: - Chất m-TFMPP dẫn xuất piperazine Vào cuối năm 1970 m-TFMPP biết đến chất có tác dụng làm giảm đau, chống viêm tên biệt dược (Stakane), m-TFMPP làm hoạt hóa thụ thể (5-HT1B 5-HT2C) Serotonin chất làm phóng thích Serotonin làm tăng mức độ Serotonin khe tế bào thần kinh Vào năm 1985, m-TFMPP bị lạm dụng chất ma túy tổng hợp khác Năm 2002, quan phòng chống ma túy Mỹ (DEA) phát hiện, công bố chất m-TFMPP giới trẻ Mỹ sử dụng để lắc hộp đêm Hoạt chất thường phối hợp với chất ma túy khác BZP, MDMA, MDA để tăng tác dụng kích thích khối cảm dùng để lắc Trong thời gian này, Mỹ nhiều quốc gia khác Đan mạch (12/2005), Thụy Điển (3/2006), New Zealand (4/2008), Singapore (2007) đưa m-TFMPP vào danh mục chất ma túy cần kiểm soát - Tháng năm 2010 phát số lượng lớn viên nén giới trẻ dùng để lắc (có thành phần m-TFMPP ) số vũ trường Việt Nam có nguy bùng phát Đây hoạt chất gây nghiện quan ban ngành tham mưu đề xuất phủ đưa vào danh mục chất ma túy cần kiểm sốt Ngày 22/02/2011, Chính phủ ban hành Nghị định số 17/2011/NĐ-CP bổ sung chất m-TFMPP vào danh mục chất ma túy cần kiểm sốt Cho đến chưa có cơng trình nghiên cứu, xây dựng quy trình giám định m-TFMPP Điều gây khó khăn khơng nhỏ cho quan điều tra thời hiệu tạm giữ đối tượng có hạn khó khăn cho giám định viên bảo vệ kết luận giám định trước tòa Trên giới giám định, nghiên cứu loại ma túy GC-MS sử dụng rộng rãi phổ biến Vì vậy, luận văn đặt vấn đề nghiên cứu, xây dựng quy trình giám định định tính định lượng chất m- TFMPP sắc kí khí ghép nối khối phổ 1.1.2 Dẫn xuất piperazine : Các dẫn xuất piperazine chia thành nhóm: Các dẫn xuất 1Phenylpiperazine dẫn xuất 1-Benzylpiperazine 1.1.3 Công thức cấu tạo: TFMPP (Trifluoromethylphenylpiperazine hay 1-[3-(trifluoromethyl) phenyl] piperazine, N-(α, α, α-trifluoro-m-tolyl)piperazine) dẫn xuất 1Phenylpiperazine có cơng thức phân tử C11H13F3N2 TFMPP có đồng phân ortho, meta, para tuỳ thuộc vào vị trí nhóm trifluormethyl nhân phenyl vị trí 2, 3, so với gốc piperazine: NHNH CF3 F 3C N N F 3C m-TFMPP p-TFMPP o-TFMPP Hình 1.1.3 Cơng thức cấu tạo TFMPP 1.1.4 Tính chất lý hóa: Trong tự nhiên, TFMPP tồn chủ yếu hai dạng: Dạng bazơ dạng muối hydroclorit, hai dạng bền điều kiện thường Các mảnh phổ đặc trưng cho TFMPP sau (m/z): 188, 230, 145, 56, 172, 73, 221 Dạng bazơ có tên khoa học 1-[3-(trifluoromethyl)phenyl] piperazine, công thức phân tử: C11H13F3N2, tỷ trọng: 1,226g/ml, sơi nhiệt độ 100 - 102 oC, nóng chảy nhiệt độ 65 – 71oC Dạng muối có tên khoa học 1-[3-(trifluoromethyl)phenyl] piperazine hydrochloride, công thức phân tử: C11H13F3N2 HCl, khối lượng phân tử: 266,66, nóng chảy nhiệt độ 239-241oC Ở dạng bazơ, TFMPP thường tồn dạng bột kết tinh màu trắng 1.1.5 Các dạng tồn thường dùng: Các dẫn xuất piperazin nói chung thường tồn dạng bột kết tinh tinh thể nguyên chất, không màu màu trắng Chất m-TFMPP thường tồn dạng muối hydroclorit, pha chế để tiêm, hút uống m-TFMPP dễ hấp thụ qua đường dày, ruột qua hàng rào máu não để tác dụng nên não Từ xuất nước ta nay, m-TFMPP chủ yếu lưu hành dạng viên nén, viên nhộng với nhiều hình dạng, kích thước, màu sắc kí hiệu khác Trong dạng chứa nhiều thành phần chất ma túy tùy sở sản xuất 1.1.6 Tác dụng m-TFMPP: Tác dụng dược lý: m-TFMPP có tác dụng hướng tâm thần kinh, vừa có tác dụng kích thích thuốc lắc (ecstasy), vừa có tác dụng gây ảo giác mescalin, psilocybin LSD Khi dùng m-TFMPP, người “bùng phát” thấy nhạy cảm hơn, tinh tế cảm nhận tốt Tác dụng thay đổi tùy theo liều dùng: Ở liều uống khoảng 25mg, tác dụng kích thích thuốc lắc thể rõ, với liều uống 75-105mg, tác dụng gây ảo giác hay “loạn sắc” lại chiếm ưu Tác dụng phụ xảy bao gồm phản ứng da, tiêu chảy hay rối loạn tiêu hóa, tăng thân nhiệt, tăng nhịp tim, buồn nôn nôn 1.2 Các phương pháp phân tích m-TFMPP: Hiện nay, nhà khoa học giới không nghiên cứu xác định m-TFMPP mẫu viên nén, viên nhộng,… mà nghiên cứu xác định m-TFMPP sản phẩm chuyển hóa mẫu sinh học Có nhiều phương pháp để phân tích định tính định lượng m- TFMPP như: Phản ứng màu, sắc ký lớp mỏng (TLC), quang phổ hồng ngoại (FTIR), sắc ký khí, sắc kí khí khối phổ (GC-FID, GC-MS), sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS) 1.3.1 Nguyên tắc giám định ma túy: Nhằm thống đảm bảo chấp nhận quốc tế kết giám định chất ma túy, tiền chất mẫu bắt được, nhà khoa học hình thống đưa “ nguyên tắc tiêu chuẩn tối thiểu giám định ma túy bắt ” Việc áp dụng nguyên tắc tiêu chuẩn tối thiểu sau: Khi vận dụng phương pháp phân tích hạng A để phân tích mẫu phải dùng thêm phương pháp phân tích khác (hạng A, B hay C) Khi không sử dụng phương pháp phân tích hạng A phải sử dụng ba phương pháp khác thẩm định CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Nội dung phương pháp nghiên cứu: m-TFMPP xuất nước ta thường trộn với tá dược ép thành viên dạng viên nén viên nhộng Do đó, để định tính định lượng m-TFMPP ta cần tách, chiết m-TFMPP từ mẫu viên Dựa vào hệ thống sắc kí khí để tách hồn tồn m-TFMPP khỏi chất khác Cơ chế phân mảnh TFMPP sau: C2H3N m/z=29 C4H9N2 m/z=85 HN CH2 CF 3C 3H N m/z=57 N NH NH + C7H4F3 m/z=145 F3C +m/z=56 C3H6N NH N F3C CF3 N C 11H13F3N M+= 230 NH +CH CH2+ CH N N CH CH2 CH + CC99HH10 C9F m/z=188 m/z=42 2H 3N 4Nm/z=189 F3 C F3 C C C88H H56FF33N N m/z=173 m/z=172 + N NCHCH Hình 2.1: Sơ đồ phân mảnh khối m-TFMPP không dẫn xuất Để xây dựng quy trình giám định định tính định lượng m-TFMPP thiết bị GC-MS, luận văn nghiên cứu vấn đề sau đây: Nghiên cứu điều tối ưu để tách m-TFMPP hỗn hợp ATS thường gặp khác thiết bị GC-MS Khảo sát điều kiện tách, chiết m-TFMPP từ mẫu viên nén: • Dung mơi chiết • Mơi trường chiết (pH) • Đánh giá hiệu chiết Phương pháp định lượng m-TFMPP: • Xây dựng đường hồi qui tuyến tính m-TFMPP; • Tìm giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp • Đánh giá tính phù hợp phương pháp: Sai đố tương đối, hiệu suất thu hồi,… Ứng dụng: Định lượng m-TFMPP mẫu viên nén từ số vụ án xuất Việt Nam Bước đầu dẫn xuất hóa để phân tích lượng vết m-TFMPP 2.3.1 Lấy mẫu xử lí mẫu: Các viên nén thu giữ vụ án phân tích theo mẫu (các mẫu phân biệt theo đối tượng, vị trí thu giữ, tiến hành theo quy trình thu lượm dấu vết ma túy chung) Ở mẫu phân nhóm dựa theo kết nhận dạng cảm quan: màu sắc, kích thước, lơ-gơ Nếu nhóm có số viên ≤ thu tất n Nếu nhóm có số viên n ≥ số lượng thu +1, cách lấy ngẫu nhiên nhóm (với n tổng số viên nhóm) Các mẫu bảo quản túi nilon lọ thủy tinh nút mài chờ phân tích [35] Các mẫu viên chứa thành phần m-TFMPP nghiền mịn, trộn Cân xác lượng chất bột trên, hòa tan định mức đến vạch HCl 0,1M cho nồng độ dạng bột 1mg/ml Lắc đều, siêu âm lọc vào bình sạch, khơ, bảo quản nơi thống mát 2.3.2 Định tính, định lượng m-TFMPP: Mẫu chuẩn: m-TFMPP dạng tinh khiết phân tích hịa tan metanol trộn lẫn với docosan cho nồng độ docosan 0,1mg/ml Lấy hỗn hợp vào lọ tiến hành phân tích điều kiện tối ưu Mẫu phân tích: Lấy vào ống nghiệm có lắp 5ml mẫu phân tích, 1ml NaOH 25%, 5ml CHCl3, 0,5ml docosan 1mg/ml Lắc xoáy, để phân lớp, lấy dịch chiết vào lọ tiến hành phân tích điều kiện tối ưu Định tính, định lượng m-TFMPP: Trong nghiên cứu, sử dụng phương pháp nội chuẩn để phân tích định tính, định lượng m-TFMPP: Đối với phân tích định tính, cần xác định mảnh phổ đặc trưng chất phân tích Đối với phân tích định lượng, yếu tố cần xác định tỷ lệ diện tích píc m-TFMPP (dựa mảnh target) so với diện tích pic nội chuẩn docosan nồng độ chất phân tích điều kiện tối ưu chọn; Nồng độ m-TFMPP mẫu phân tích tính dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính mTFMPP tính phần mềm Xcalibul thiết bị GC-MS: ThermoFinnigant - Autosampler AS3000 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Điều kiện phân tích: Chế độ MS: SIM( m/z: 56, 57, 72, 85, 91, 134, 135, 145, 176, 180, 182, 188, 230, 310) Chế độ chạy EI + (Electron Impact) Khí mang heli, tốc độ dịng 1,2 ml/phút Lị sắc kí: 80oC giữ 0,5 phút, tăng 20oC/ phút đến 170oC, giữ phút, tăng 15oC/phút đến 270oC giữ đẳng nhiệt phút Tổng chương trình 15,7 phút Hình 3.1.7 Sắc kí đồ hỗn hợp chuẩn điều kiện phân tích 3-chế độ SIM Ở điều kiện phân tích sắc đồ chất khỏi 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết: 10 Từ đồ thị biểu diễn ảnh hưởng dung mơi tới q trình chiết Để tối ưu q trình phân tích chúng tơi sử dụng Cloroform 3.2.2 Khảo sát môi trường pH: 11 STFMPP/SIS 14 12 Linear Regression for Data1_B: Y=A+B*X 10 Parameter Value Error t-Value Prob>|t| A 0.09856 0.10762 0.91575 0.41161 B 0.0068 1.141E-4 59.6379 12 cho kết tương đương 3.2.3 Khảo sát hiệu suất chiết: Kết thí nghiệm chiết với tỉ lệ 1:1 cho thấy: Hiệu suất chiết m-TFMPP cao (98,1%) Nói cách khác, kết chiết đáp ứng yêu cầu phân tích định tính định lượng 3.2.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng thiết bị: Kết thu cho thấy, thiết bị có giới hạn phát giới hạn định lượng tương đối nhỏ: LOD = 0,22 ppb, LOQ = 0,72 ppb 3.3.1 Phương trình hồi qui tuyến tính: y = (0,0986 ± 0,2992) + (0,0068 ± 0,0003).x (ppb) 3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp: Kết tính tốn cho ta thấy giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp 22,3 ppb 74,4 ppb Do vậy, để phân tích định 12 lượng m-TFMPP thiết bị GC-MS phương pháp nồng độ m-TFMPP mẫu tối thiểu phải ≥ 74,4 ppb 3.3.3 Đánh giá tính phù hợp phương pháp: Kết phân tích cho thấy: Chất phân tích có thời gian lưu xác định mTFMPP cho hai giá trị RSD nhỏ: RSD thời gian lưu RSD tỉ lệ diện tích pic so với nội chuẩn điểm đầu điểm cuối đường chuẩn nhỏ 5% Như hệ thống sắc kí phù hợp, phương pháp có độ lặp lại tốt, độ xác cao, đáp ứng yêu cầu phân tích định tính định lượng Viên nén m-TFMPP 3.3.4 Hiệu suất thu hồi phương pháp: Tiến hành ba thí nghiệm độc lập sau: Từ kết thu ta nhận thấy, với mức độ tin cậy 95% phương pháp Bột viên có độ thu hồi tốt Do đó, kết phân tích hồn tồn tin cậy 3.3.5 Quy trình giám định m-TFMPP thiết bị GC-MS: Bước 1: Đồng hoá mẫu Nghiền thành bột, trộn Dịch lọc Thêm HCl lỗng 0,1M (1mg bột/1ml) Bước 2: Hồ tan mẫu Lắc siêu âm 30phút Dịch lọc Lọc kiềm bỏ phần khơng tan Bước 3: Kiềm hóa dịch lọc Thêm NaOH 25% ( pH > 12) Thêm Docosan (1mg/1ml) (tỷ lệ thể tích Docosan với Dịch lọc 1: 10 ) 13 Phân tích thiết bị GC-MS điều kiện tối ưu Thêm Cloroform (tỷ lệ thể tích 1:1) Bước 4: Chiết xuất Lắc xoáy 30 phút, để phân lớp phút Ly tâm phút 3000 vòng/phút Hút lấy pha dung môi, lấy 1ml 3.4 Ứng dụng qui trình để phân tích định tính định lượng m-TFMPP số vụ án có chứa m-TFMPP Việt Nam với hàm lượng dao động (25-75%) 3.5 Dẫn xuất hóa m-TFMPP: Phản ứng dẫn xuất hóa xảy theo chế nguyên tử hydro linh động m-TFMPP với nhóm trifluoro acetic axit để tạo thành chất dẫn xuất mTFMPP-TFA theo phương trình phản ứng sau: 14 Kết phân tích cho thấy chúng tơi chuyển lượng m-TFMPP thành m-TFMPP-TFA Trên sắc kí đồ cho pic rõ nét, chân pic không kéo vết chưa dẫn xuất Do vậy, việc gắn nhóm cấu trúc vào phân tử m-TFMPP thành công tạo tiền đề để tăng độ nhạy, độ xác phân tích định tính KẾT LUẬN 15 Từ kết thực nghiệm nghiên cứu xây dựng quy trình giám định m-TFMPP phương pháp sắc kí khí khối phổ sau Đã tìm điều kiện tối ưu thiết bị GC-MS để định tính định lượng m-TFMPP: Loại khối phổ sử dụng: Tứ cực Cột Rtx-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm) Chế độ chạy EI + (Electron Impact) Kiểu va chạm điện tử điện 70 ev Chế độ MS: full Scan Khoảng m/z: 40-500 Chế độ MS: SIM( m/z: 56, 57, 72, 85, 91, 134, 135, 145, 176, 180, 182, 188, 230, 310) Điều kiện GC: Khí mang heli, tốc độ dịng 1,2 ml/phút Lị sắc kí: 80 oC giữ 0,5 phút, tăng 20oC/ phút đến 170oC, giữ phút, tăng 15oC/phút đến 270oC giữ đẳng nhiệt phút Tổng chương trình sắc kí 15,7 phút Điều kiện MS: nhiệt độ Transferline: 2800 Các mảnh ion TFMPP: 230 (M+), 189, 188, 173, 172, 145, , 85, 57, 56, 42 Ion target: 188, 145, 230 Các mảnh BZP: 176(M+), 134, 91, 85, 56 Ion target: 134, 176, 91 Các mảnh Docosan ( C22H46 ) : 310(M+),176, 134, 91, 85, 71, 57, 43 Ion target: 57, 71, 85, 43, 310 - Đọc kết phân tích Việc xây dựng tính kết thực dựa phần mềm (Xcalibul ) thiết bị 16 Tìm điều kiện tối ưu cho trình tách chiết m-TFMPP mẫu viên nén: Chiết m-TFMPP Cloroform với tỉ lệ chiết 1:1, hiệu suất chiết 98,1%, môi trường chiết xuất: kiềm mạnh (NaOH 25%) Định lượng m-TFMPP phương pháp đường chuẩn: • Xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính để xác định mTFMPP khoảng nồng độ 100 - 2000 ppb, xác định giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp với LOD = 22,3 ppb, LOQ = 74,4 ppb • Đánh giá tính phù hợp phương pháp với RSD thời gian lưu RSD tỉ lệ diện tích pic so với nội chuẩn điểm đầu điểm cuối đường chuẩn nhỏ ( 95%) Ứng dụng qui trình để phân tích định tính định lượng m-TFMPP số vụ án có chứa m-TFMPP Việt Nam Mẫu viên nén chứa thành phần m-TFMPP xuất Việt Nam với nhiều logo, hình dạng, màu sắc khác nhau, hàm lượng m-TFMPP có mẫu viên dao động khoảng 25-79% tùy sở sản xuất Bước đầu dẫn xuất hóa m-TFMPP TFA để phân tích định tính lượng vết m-TFMPP phát m-TFMPP giới hạn phát phương pháp (10 ppb) 17