Thiết kế đầu dò AND cho kỹ thuật LAI DOT BLOT Nguyễn Thị Thu Hường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số 60 42 01 21 Người hướng dẫn: PGS.TS Võ Thị Thương Lan Năm bảo vệ: 2013 Abstract Nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN, nguyên tắc kỹ thuật lai axit nucleic, đầu dò, số kỹ thuật lai axit nucleic, yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật lai pha rắn, ứng dụng kỹ thuật lai axit nucleic Trình bày số phương pháp sử dụng nghiên cứu như: Thiết kế đầu dò; Phương pháp PCR; Quá trình lai điểm; Quá trình lai điểm ngược; Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm; Tách plasmid; Tinh sản phẩm PCR kit High pure PCR cleanup micro; Phương pháp điện di Đưa kết nghiên cứu đạt được: Kết khuếch đại đánh dấu đầu dò M; So sánh hiệu đánh dấu với biotin DIG; Chuẩn bị trình tự đích trình tự đối chứng; Kết lai điểm phân biệt trình tự đích trình tự đối chứng; Sàng lọc số đột biến gen β-globin; Chuẩn bị đánh dấu trình tự đích cho quy trình lai điểm ngược; Kết lai điểm ngược phát đột biến gen β-globin Keywords Di truyền học; Đầu dò; AND; Kỹ thuật lai Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học MỞ ĐẦU Ngày nay, đƣợc sống thời kỳ với y học phát triển nhanh chóng Sự tiến y học đại song hành mối liên hệ khăng khít tri thức y học phát triển vƣợt trội công nghệ hỗ trợ cận lâm sàng Điều giúp có nhìn tổng quan bệnh lý am hiểu sâu rộng sở phân tử bệnh Trong đó, hiểu biết bệnh mức độ phân tử hỗ trợ đắc lực việc chẩn đoán, phòng ngừa bệnh có ý nghĩa đặc biệt nghiên cứu hệ thuốc - thuốc điều trị đích Nền tảng sở học phân tử bệnh yếu tố thúc đẩy kỹ thuật di truyền phân tử phát triển không ngừng ngƣợc lại Xu hƣớng chẩn đoán phân tử nhắm tới kỹ thuật phát nhanh, đồng thời nhiều trình tự đích với số lƣợng mẫu phân tích lớn nhƣ: PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) giải trình tự gen Đáng ý số phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - phát triển phƣơng pháp lai ADN Đây kỹ thuật kinh điển nhƣng đƣợc sử dụng phổ biến nhờ vào ƣu điểm vƣợt trội nhƣ thao tác đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp, xác định đồng thời nhiều đột biến với số lƣợng mẫu lớn đặc biệt phù hợp với nƣớc phát triển Ở nƣớc ta kỹ thuật lai điểm đƣợc ứng dụng định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung Tuy nhiên ứng dụng kỹ thuật việc xác định đột biến di truyền chƣa đƣợc công bố Do đó, tiến hành đề tài "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot" với mục tiêu thiết lập quy trình lai nhằm phát sai khác mức độ nucleotide bệnh lý di truyền Đề tài đƣợc thực Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Chấn Hùng (2004), Ung thư học nội khoa, Nhà xuất Y học Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Tuyết Vân, Nguyễn Hoàng Quân, Cao Minh Nga (2010), "Nhiễm type Human Papillomavirus phụ nữ tuối sinh đẻ", Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 14 (1), tr 504-508 Võ Thị Thƣơng Lan (2009), Giáo trình Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, Nhà xuất Giáo dục Tiếng Anh Amann R., Ludwig W (2000), "Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology", FEMS Microbiology Reviews, 24, pp 555565 An S F., Franklin D., Fleming K A (1992), "Generation of digoxigeninlabelled double-stranded and single-stranded probes using the polymerase chain reaction", Moleculer and Cellular Probes, 6, pp 193-200 Barbu V (2007), "Molecular hybridization techniques of nucleic acids", Innovative Romanian Food Biotechnology, 1, pp 1-12 Bottari B., Santarelli M., Neviani E., Gatti M (2010), "Natural whey starter for Parmigiano Reggiano: culture-independent approach", Journal of Applied Microbiology, 108, pp 1676-1684 Boussiou M., Karababa P., Sinopoulou K., Tsaftaridis P., Plata E., LoutradiAnagnostou A (2008), "The molecular heterogeneity of β-thalassemia in Greece", Blood Cells, Molecules, and Diseases, 40, pp 317-319 10 Braissant O., Wahli W (1998), "A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labeled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections", Biochemia, 1, pp 10-16 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 63 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 11 Chan V., Yam I., Chen F E., Chan T K (1999), " A reverse dot blot method for rapid detection of non-deletion α thalassaemia", British Journal of Haematology, 104, pp 513-515 12 Clement G., Benhattar J (2005), "A methylation sensitive dot blot assay (MSDBA) for the quantitative analysis of DNA methylation in clinical samplas", J Clin Pathol, 58, pp 155-158 13 Colah R., Gorakshakar A., Nadkarni A, Phanasgaonkar S., Surve R., Sawant P., Mohanty D., Ghosh K (2009), "Regional heterogeneity of β-thalassemia mutations in the multi ethnic Indian population", Blood Cells, Molecules, and Diseases, 42, pp 241-246 14 Dawson D B (1990), "Use of nucleic acid probes in genetic tests", Clin Biochem, 23, pp 279-285 15 Dessauer H C., Reeder T W., Cole C J., Knight A (1996), "Rapid screening of DNA diversity using dot-blot technology and allele-specific oligonucleotides: Maternity of hybrids and unisexual cones of hybrid origin (Lizards, Cnemidophorus)", Molecular Phylogenetics and Evolution, 6, pp 366-372 16 Dianandis E P., Christopoulos T K (1991), "The biotin-(strept)avidin system: Principles and applications in biotechnology", Clinical chemistry, 37, pp 625-636 17 Dooki M E., Akkhavan-Niaki H., Juibary A G (2011), "Detecting common CFTR mutations by reverse dot blot hybridization method in cystic fibrosis first report from Northern Iran", Iran I Pediatr, 21, pp 51-57 18 Fernandez J., Sandino A., Yudelevich A., Avendano L F., Venegas A., Hinrichsen V., Spencer E (2009), "Rotavirus detection by dot blot hybridization assay using a non-radioactive synthetic oligodeoxynucleotide probe", Epidemiol Infect., 108, pp 175-184 19 Forslund O., Hansson B G., Bjerre B (1994), "Typing of human papillomaviruses by consensus polymerase chain reaction and a nonradioactive reverse dot blot hybridization", Journal of Virological Methods, 49, pp 129-140 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 64 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 20 Fox J L., Hsu P H., Legator M S., Morrison L E., Seelig S A (1995), "Fluorescence in situ hybridization: Powerful molecular tool for cancer prognosis", Clin Chem, 41, pp 1554-1559 21 Gall J G., Pardue M L (1969), "Formation and detection of ARN-ADN hybrid molecular in cytological preparations", Proc Natl Acad Sci USA, 63, pp 378-383 22 Gong Y., Sweet W., Duh Y., Greenfield L., Fang Y., Zhao J., Tarco E., Symmans W F., Isola J., Sneige N (2009), "Chromogenic in situ hybridization is a reliable method for detecting HER2 gene status in breast cancer", Am J Clin Pathol, 131, pp 490-497 23 Gonzalez M P., Sanchez X., Ganga M A., Lopez-Lastra M., Jashes M., Sandino A M (1997), "Detection of the infectious hematopoietic necrosis virus directly from infected fish tissues by dot blot hybridization with a nonradioactive probe", Journal of Virological Methods, 65, pp 273-279 24 Gupta D., Middleton L P., Whitaker M J., Abrams J (2003), "Comparison of Fluorescence and Chromogenic in situ hybridization for detection of HER2/neu oncogen in breast cancer", Am J Clin Pathol, 119, pp 381-387 25 Hammermueller J D., Krell P J., Derbyshire J B., Nagy E (1991), "An improved dot-blot method for virus detection in chicken embryo fibroblast cultures", Journal of Virological Methods, 31, pp 47-56 26 Harris M R (1991), "Non-radioactive techniques for the labelling of nucleic acids", Biotech adv, 9, pp 185-196 27 Hassan S., Ahmad R., Zakaria Z., Zulkafli Z., Abdullah W Z (2013), "Detection of β-globin gene mutations among β-thalassaemia carriers and patients in Malaysia: Application of Multiplex Amplification Refractory Mutation System–Polymerase Chain Reaction", Malays J Med Sci., 20, pp 1320 28 Heitzler J., Marechal-Drouard L., Dirheimer G., Keith G (1992), "Use of a dot blot hybridization method for identification of pure tRNA species on different membranes", Biochimica et Biophysica Acta, 1129, pp 273-277 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 65 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 29 Hopp H E., Hain L., Almonacid F B., Tozzini A C., Orman B., Arese A I., Ceriani M F., Saladrigas M V., Celnik R., Vas M., Mentaberry A N (1991), "Development and application of a nonradioactive nucleic acid hybridization system for simultaneous detection of four potato pathogens", Journal of Virological Methods, 31, pp 11-30 30 Hsu Y C., Yeh T J., Chang Y C (2005), "A new combination of RT-PCR and reverse dot blot hybridization for rapid detection and identification of potyviruses", Journal of Virological Methods, 128, pp 54-60 31 Juan M., Qin-sheng G U., Shi-ming L., Peng B., Li-feng L., Yan-bing T., Li L (2007), "Dot-blot hybridization for detection of five cucurbit viruses by digoxigenin- labelled cDNA probes", Agricultural Sciences in China, 6, pp 1450-1455 32 Kafatos F C., Jones C W., Efstratiadis A (1979), "Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure", Nucleic Acids Research, 7, pp 1541-1552 33 Kessler C (1994), "Non-radioactive analysis of biomolecules", Journal of Biotechnology, 35, pp 165-189 34 Lahtinen S., Gueimonde M., Ouwehand A., Reinikainen J., Salminen S (2005), "Probiotic bacteria may become dormant during storage", Applied and Environmental Microbiology, 71, pp 1662-1663 35 Landry M L (1990), "Nucleic acid hybridization in viral diagnosis", Clin Biochem, 23, pp 267-277 36 Leary J., Brigati D J., Ward D C (1983), "Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots”, Proc Natl Acad Sci USA, 80, pp 4045-4049 37 Li D., Liao C., Xie X., Huang Y., Zhong H., Wei J (2006), "Prenatal diagnosis of β-thalassemia in Southern China", European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 128, pp 81–85 38 Lin M., Zhu J J., Wang Q., Xie L X., Lu M., Wang J L., Wang C F., Zhong T Y., Zheng L., Pan M C., Wu J R., Wen Y F., Liu G R., Zhan X F., Lin Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 66 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học F., Yang L Y (2012), "Development and evaluation of a reverse dot blot assay for the simultaneous detection of common alpha and beta thalassemia in Chinese", Blood Cells, Molecular, and Diseases, 48, pp 86-90 39 Liu Y., SunB., Wang X., Zheng C., Zhou G (2007), "Three digoxigeninlabeled cDNA probes for specific detection of the natural population of Barley yellow dwarf viruses in China by dot-blot hybridization", Journal of Virological Methods, 145, pp 22-29 40 Lo Y M D., Mehal W Z., Fleming K A (1988), "Rapid production of vector-free biotinylated probes using the polymerase chain reaction", Nucleic Acids Research, 16, pp 8719 41 Lodish H., Berk A., Zipursky S L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J (2000), Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W H Freeman 42 Lu X., Hua L., Zhang T., Li S., Fan X., Peng Q., Li W., Ye J., Long J., He X (2013), "A reverse dot blot assay for the expanded screening of eleven Chinese G6PD mutations", Clinica Chimica Acta, 418, pp 45-49 43 Machado A., Almeida C., Carvalho A., Boyen F., Haesebrouck F., Rodrigues L., Cerca N., Azevedo N F (2013), "Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for identification of Lactobacillus spp in milk samples", International Journal of Food Microbiology, 162, pp 64-70 44 Madrid M A., Lo R W (2004), "Chromogenic in situ hybridization (CISH): a novel alternative in screening archival breast cancer tissue samples for HER2/neu status", Breast Cancer Research, 6, pp 593-600 45 Matsumoto K., Takada T., Shimizu K., Kado Y., Kawakami K., Makino I., Yamaoka Y., Hirano K., Nishimura A., Kajimoto O., Nomoto K (2006), "The effects of a probiotic milk product containing Lactobacillus casei strain Shirota on the defecation frequency and the intestinal microfola of sub-optimal health state volunteers: a randomized placebo-controlled cross-over study", Bioscience and Microfola, 25, pp 39-48 46 Metaferia B., Wei J S., Song Y K., Evangelista J., Aschenbach K., Johansson P., Wen X., Chen Q., Lee A., Hempel H., Gheeya J S., Getty S., Gomez R., Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 67 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Khan J (2013), "Development of peptide nucleic acid probes for detection of the HER2 oncogene", Plos One, 8, e58870 47 Mifflin T E (1989), "Use and applications of nucleic acid probes in the clinical laboratory", Clin, Chem., 35, pp 1819-1825 48 Mo Q H., Li X R., Li C F., He Y L., Xu X M (2005), "A novel frameshift mutation (+G) at codons 15/16 in a β0 thalassaemia gene results in a significant reduction of β-globin mRNA values", J Clin Pathol, 58, 923-926 49 Moliaka I., Ovchinnikov I.V., Shlenskii A.B., Korovaitseva G.I., Rogaev E.I (1997), "DNA genotyposcoy in determining paternity: use of hybridized probes", Genetika, 33, pp 831-835 50 Nakamura R M (1990), "Overview and principles of in situ hybridization", Clin Biochem, 23, pp 255-259 51 Osiowy C., Giles E (2003), "Evaluation of the INNO-LiPA HBV Genotyping Assay for determination of Hepatitis B Virus genotype", Journal of Clinical Microbiology, 41, pp 5473-5477 52 Pas S D., Tran N., Man R A., Burghoorn-Maas C., Vernet G., Niesters H G M (2008), "Comparison of reverse hybridization, microarray, and sequence analysis for genotyping Hepatitis B Virus", Journal of clinical microbiology, 46, pp 1268-1273 53 Richards J C (1991), "Gene probes", Current Opinion in Biotechnology, 2, pp 76-85 54 Saiki R K., Walsh P S., Levenson C H., Erlich H A (1989), "Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes", Genetics, 86, pp 6230-6234 55 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 56 Shawky R M., Kamal T M (2012), "Thalassemia intermedia: An overview", The Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 13, pp 245-255 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 68 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 57 Stahl D A., Kane M D (1992), "Methods in microbial identification, tracking and monitoring of function", Curr Opin Biotechnol., 3, pp 244–252 58 Strachan T., Read A P (2004), Human Molecular Genetics, 3rd edition, Garland Science 59 Svasti M L S., Tran M H., Mukongdee T., Winichagoon P., Tran V B., Tran V B., Fucharoen S (2002), "Molecular analysis of β-thalassemia in south Vietnam", American Journal of Hematology, 71, pp 85-88 60 Sun Y., Perch-Nielsen I., Dufva M., Sabourin D., Bang D D., Hogberg J., Wolff A (2012), "Direct immobilization of DNA probes on non-modified plastics by UV irradiation and integration in microfluidic devices for rapid bioassay", Anal Bioanal Chem, 402, pp 741-748 61 Sutcharitchan P., Saiki R., Huisman T H J., A Kutlar, McKie V., Erlich H., Embury S H (1995), "Reverse dot-blot detection of the African-American βthalassemia mutations", Blood, 86, pp 1580-1585 62 Svasti M L S., Tran M H., Munkongdee T., Winichagoon P., Tran V B., Tran V B., Fucharoen S (2002), "Molecualr analysis of β-thalassemia in south Vietnam", American Journal of Hematology, 71, pp 85-88 63 Syrjanen S., Andersson B., Juntunen L., Syrjanen K (1991), "The use of polymerase chain reaction in generation of biotinylated human papillomavirus DNA probes for in situ hybridization", Journal of Virological methods, 31, pp 147-160 64 Takahashi T., Mitsuda T., Okuda K (1989), "An alternative nonradioactive method for labeling DNA using biotin", Analytical biochemistry, 179, pp 7785 65 Tenover F C (1988), "Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infectious diseases", Clinical Microbiology Reviews, 1, pp 82-101 66 Twomey T A., Krawetz S A (1990), "Parameters affecting hybridization of nucleic acids blotted onto nylon or nitrocellulose membranes", Biotechniques, 8, pp 478-482 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 69 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 67 Uhlmann V., Prasad M., Silva I., Luettich K., Grande L., Alonso L., Thisted M., Pluzek K L., Gorst J., Ring M., Sweeney M., Kenny C., Martin C., Russell J., Bermingham N., O'Donovan M., Sheils O., O'Leary J J (2000), "Improved in situ detection method for telomeric tanddem repeats in metaphase spreads and interphase nuclei", Mol Pathol, 53, pp 48-50 68 Velazquez W A C., Hernandez H C., Marquez C A., Hernandez A F O., Rodriquez C M., Salamanca G F., Coral V R (2008), "Identification of duchence muscular dystrophy female carriers by fluorescence in situ hybridization and RT-PCR", Genet Test, 12, pp 221-223 69 Ward D M., Bateson M M., Weller R., Ruff-Roberts A L (1992), "Ribosomal RNA analysis of micro-organisms as they occur in nature", Adv Microb Ecol., 12, pp 219–286 70 Weeks I., Behesti I., McCapra F., Campbell A K., Woodhead J S (1983), "Acridinum ester as high-specific-activity labels in immunoassay", Clin Chem., 29, pp 1474-1479 71 Wetmur J G (1991), "DNA probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization", Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26, pp 227-259 72 Wang W., Kham S K Y., Yeo G., Quah T., Chong S S (2003), "Multiplex minisequencing screen for common Southeast Asian and Indian β-thalassemia mutations", Clinical Chemistry, 49, pp 209-218 73 Yamsri S., Sanchaisuriya K., Fucharoen G., Sae-ung N., Fucharoen S (2011), "Genotype and phenotype characterizations in a large cohort of β-thalassemia heterozygote with different forms of α-thalassemia in northeast Thailand", Blood Cells, Molecules, and Diseases, 47, pp 120-124 74 Yang T., Yuan L., Huang S., Zhao S (1998), "Screening mutations in phenylketonuria by means of non-radioactive reverse dot blot hybridization", Zhonghua Yi Xue Chuan Xue Za Zhi, 15, pp 307-309 75 Zakrzewska K., Ciappi S., Azzi A (1993), "Polymerase chain reaction for synthesis of digoxigenin-labelled DNA probe: application to parvovirus B19 and to polyomavirus BK", Molecular and Cellular Probes, 7, pp 55-60 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 70 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 76 Zhang Y., Coyne M Y., Wil S G., Levenson C H., Kawasaki E S (1991), "Single-base mutational analysis of cancer and genetic diseases using membrane bound modified oligonucleotides", Nucleic acids research, 19, pp 3929-3933 Trang web 77 http://www.cnx.org/content/m45473/latest/ 78 http://www.keywordpicture.com/keyword/hybridization%20protection%20ass ay/ 79 http://www.lifetechnologies.com/vn/en/home/life-science/cell-analysis/cellular -imaging/in-situ-hybridization-ish.html 80 http://www.millipore.com/techpublications/tech1/www1 81 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/455025 82 http://www.pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page?id=28575 83 http://www.viennalab.com/products/genetic_disorders/thalassemia_stripassay 84 http://www.vietacorp.com/product_detail.php?module=product&menuitem=& category_ID=12&product_ID=801#anchor_body Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 71 [...]...Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 76 Zhang Y., Coyne M Y., Wil S G., Levenson C H., Kawasaki E S (1991), "Single-base mutational analysis of cancer and genetic diseases using membrane bound modified oligonucleotides", Nucleic acids research, 19, pp 3929-3933 Trang web 77 http://www.cnx.org/content/m45473/latest/ 78 http://www.keywordpicture.com/keyword/hybridization%20protection%20ass... http://www.pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page?id=28575 83 http://www.viennalab.com/products/genetic_disorders/thalassemia_stripassay 84 http://www.vietacorp.com/product_detail.php?module=product&menuitem=& category_ID=12&product_ID=801#anchor_body Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 71