I.Mở đầu Công nghệ sinh học lĩnh vực ưu tiên phát triển hầu hết quốc gia giới Nhiều học giả dự báo sức mạnh to lớn CNSH cải tạo sinh giới, có thân người Ngày CNSH có vai trị quan trọng ảnh hưởng đến nhiều nghành khoa học khác : kinh tế, y học mà đặc biệt công nghệ thực phẩm - CNSH đóng vai trị quan trọng nghành này, giúp cho thực phẩm có nguồn nguyên liệu phong phú, chất lượng để dáp ứng nhu cầu ngày cao số lường đông nhân loại mà thực phẩm túy đáp ứng - Để hiểu rõ tầm quan trọng cơng nghệ sinh học, nhóm chúng em nghiên cứu màng nhỏ ứng dụng sinh học đến thực phẩm thông qua sách, báo, internet hướng dẫn giáo viên: Nguyễn Văn Lục Đề tài nhóm chúng em: “ Lên men acid hữu từ vi sinh vật” Đề tài cho chúng em thấy vai trò to lớn VSV tạo sản phẩm sinh học mà cụ thể acid hữu cơ, loại acid có nhiều ứng dụng nghành công nghệ thực phẩm vậy, chúng em cịn hiểu quy trình ni cấy phương pháp nuôi cấy, tăng sinh với công nghệ tách chiết sản phẩm II.Nội dung Tổng quan công nghệ thực phẩm 1.1 Khái niệm chung: Công nghệ sinh học ngành khoa học quan tâm phát triển giới Nó cơng cụ áp dụng cho nhiều ngành kinh tế sản xuất lương thực thực phẩm, chăn nuôi thú y cơng nghiệp dược cơng nghiệp hóa học, chuyển hóa sinh khối thành lượng, xử lý số liệu phế liệu cơng nơng nghiệp, phịng chống nhiễm vệ sinh môi trường… - Công nghệ sinh học ứng dụng rộng rãi lĩnh vực thực phẩm dinh dưỡng để tạo đa dạng sản phẩm thực phẩm mà gọi chung ngành công nghệ sinh học thực phẩm - Công nghệ sinh học thực phẩm ngành ứng dụng sinh học sản xuất thực phẩm để tạo đa dạng, chất lượng, số lượng đáp ứng nhu cầu ngày cao người Cụ thể tiến hóa của kỹ thuật nông nghiệp truyền thống lai chéo, lên men sử dụng phương pháp di truyền đại nhằm cải thiện tính trạng có lợi cho trồng, động vật, VSV sản xuất thực phẩm, bao gồm việc thêm vào hay loại bỏ gen để tạo tính trạng mong muốn - Công nghệ sinh học thực phẩm phát triển giới đặc biệt Hoa Kì với kỹ thuật di truyền đại, lai tạo giống…đạt nhiều thành tựu thực phẩm chuyển gen (đậu nành, bắp BT ) với chất lượng số lượng cao, có khả chống chịu cao - Công nghệ sinh học VN bước phát triển, cịn gặp nhiều khó khăn cơng nghệ tài đạt số thành tựu (ngô chuyển gen tạo protein giàu sắt, dòng lúa chuyển gen kháng sâu đục thân…) Và ứng dụng truyền thống lên men phát triên truyền thống xưa VN ta 1.2.Phương pháp lên men vi sinh vật - Quá trình sản xuất sản phẩm sinh học (sinh khối, sản phẩm trao đổi chất) từ VSV hồn tồn khác với q trình sản xuất sản phẩm từ thực vật động vật Chính người ta dùng từ lên men (fermentation) để q trình sản xuất có đặc thù riêng - Quá trình lên men trình phức tạp Nó bao gồm từ q trình tuyển chọn giống, nâng cao chất lượng giống, bảo quản giống, trình lên men, trình thu nhận tinh chế sản phẩm Mỗi loại sản phẩm ứng với VSV đặc trưng quy trình giơng nguyên lý cách vận hành, khác khâu giống cách tinh chế Ví dụ: Một số sản phẩm trình lên men oPho mai oRượu oBia oBánh mì oAcid hữu (lactic, axetic…) Sơ đồ ngun lý qt trình cơng nghệ VSV: 2.Tổng quan acid hữu thực phẩm 2.1.Khái niệm chung: -Acid hữu loại hợp chất mà phân tử có chứa nhóm –COOH (nhóm cacboxyl) -Công thức tổng quát: R(COOH)n 2.2.Phương pháp lý chọn phương pháp lên men VSV sản xuất acid hữu - Acid hữu sử dụng rộng rãi chế biến bảo quản thực phẩm cơng nghệ vi sinh vật Chính mà acid hữu nghiên cứu sản xuất phổ biến Để sản xuất acid hữu người ta tiến hành nhiều pp khác như: •PP tổng hợp hóa học •PP tách chiết từ nguyên liệu thực vật •PP sinh tổng hợp nhờ VSV - Trong pp PP sản xuất acid hữu từ VSV PP sử dụng có ý nghĩa q trình sản xuất nhanh, sử dụng nguyên liệu rẻ tiền tạo nhiều acid hữu khác 2.3 Ứng dụng acid hữu thực phẩm: Các axit hữu sử dụng bảo quản thực phẩm hiệu ứng chúng vi khuẩn Nguyên tắc quan trọng phương thức hành động axit hữu vi khuẩn không phân ly (khơng ion hóa) axit hữu xâm nhập vào thành tế bào vi khuẩn làm gián đoạn sinh lý bình thường số loại vi khuẩn mà gọi pH-nhạy cảm, có nghĩa chúng chịu đựng gradient nội bên rộng pH Trong số loài vi khuẩn Escherichia coli , Salmonella spp C perfringens , Listeria monocytogenes , Campylobacter - Khi khuếch tán thụ động axit hữu thành vi khuẩn, nơi mà độ pH gần trung lập, axit tách giảm vi khuẩn pH nội bộ, dẫn đến tình làm giảm ngừng phát triển vi khuẩn Mặt khác, phần anion axit hữu khơng thể khỏi vi khuẩn mẫu phân ly tích tụ vi khuẩn phá vỡ nhiều chức trao đổi chất, dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu, khơng tương thích với tồn vi khuẩn - Nó chứng minh nhà nước axit hữu (undissociated phân ly) quan trọng để xác định lực họ để ức chế phát triển vi khuẩn, so với axit undissociated - Lactic acid muối lactate natri kali lactate sử dụng rộng rãi kháng sinh sản phẩm thực phẩm, thịt, đặc biệt, gia cầm thịt giăm bơng xúc xích Tạo vị cho sản phẩm, chất làm lạnh (dấm) Điều chỉnh pH cho sản phẩm Kỹ thuật sản xuất acid hữu thực phẩm từ Vi Sinh Vật 3.1 Axit Citric 3.1.1 Giới thiệu chung -Cơng thức phân tử: C6H8O7 -Cơng thức hóa học: - Axít citric axít hữu yếu, axít ba lần axít, chất bảo quản tự nhiên sử dụng để bổ sung vị chua cho thực phẩm hay loại nước Trong hóa sinh học, axit citric tác nhân trung gian quan trọng chu trình axít citric xuất trao đổi chất gần sinh vật Nó coi tác nhân làm mặt mơi trường đóng vai trị chất chống ơxy hóa - Axít citric tồn nhiều loại rau quả, chủ yếu loại chi Citrus Các lồi chanh có hàm lượng cao axít citric; tới 8% khối lượng khơ chúng Hàm lượng axít citric cam, chanh nằm khoảng từ 0,005 mol/L loại cam bưởi chùm tới 0,030 mol/L Các giá trị phụ thuộc vào điều kiện môi trường gieo trồng 3.1.2 Ứng dụng Phụ gia thực phẩm - Trong vai trò phụ gia thực phẩm, axít citric sử dụng chất tạo vị chất bảo quản thực phẩm đồ uống, đặc biệt loại đồ uống nhẹ - Nó ký hiệu số E E330 Các muối citrat kim loại khác sử dụng để chuyển giao khoáng chất dạng sử dụng mặt sinh học nhiều chất bổ sung dinh dưỡng Các tính chất đệm citrat sử dụng để kiểm soát pH chất tẩy rửa dùng gia đình dược phẩm Tại Hoa Kỳ, độ tinh khiết axít citric cần thiết để làm phụ gia thực phẩm định nghĩa Food Chemical Codex (FCC), công bố Dược điển Hoa Kỳ (USP) - Ngồi axit citrit cịn sử dụng ngành dược phẩm, công nghệ sinh học, cơng nghệ hóa học,… 3.1.3 Các vi sinh vật sử dụng trình lên men axit citric : Nấm (Fungi): việc lựa chọn chủng nấm thích hợp quan trọng nấm gửi vai tro định suốt trình sản xuất, chủng nấm lựa chọn phải đảm bảo yêu cầu để phù hợp với sản xuất quy mô công nghiệp, yêu cầu :tính ổn định dài hạn, có khả hình thành bào tử cao, tăng trưởng tốt chất sử dụng, thời gian lên men ngắn, kháng vi sinh vật, tạo nồng độ axit cao (khoảng 70-100g/l) - Trong năm qua có nhiều chủng vi sinh vật sử dụng để sản xuất axit citric Aspergillus niger lựa chọn hàng đầu cơng nghiệp đáp ứng nhiều u cầu Một số chủng thuộc aspergillus phân lập sử dụng sản xuất như: A awamori, A fenicis, A fonsecaeus, A luchensis, A fumaricus, A wentii, A saitoi, A usami, A phoenicus, A lanosus, A foetidus,và A flavus ,ngồi cịn có số chủng thuộc Penicillium P janthinellum, P simplicissimum,và P restrictum số loài khác như: Trichoderma viride, Mucor piriformis, Ustulina vulgaris, loài Botrytis, Ascochyta, Absidia, Talaromyces, Acremonium, Eupenicillium Ngày nay, tất acid citric sản xuất lên men sản xuất chủng A niger phương pháp lên men chìm - Nấm men (Yeasts): Mặc dù A niger vi sinh vật sản xuất truyền thống acid citric, 30 năm qua nhà nghiên cứu ý vào việc sử dụng nấm men để sản xuất axít citric Nấm men có số lợi so với chủng A niger Thời gian lên men ngắn (một nửa thời gian A niger) suất cao chủng nấm không nhạy cảm với mật đường sử dụng để lên men liên tục Ngồi ra, nấm men chịu dựng ô nhiễm, có khả chuyển hóa lượng đường cao n-ankan ,với tăng trưởng nhanh kết cho suất cao Hơn nữa, nấm men bị tác động ion kim loại, cho phép việc tinh chế dể dàng Những đặc tính làm giảm chi phí xử lý chất chất thải chi phí thu hồi sản phẩm Những bất lợi nấm men sử dụng sản xuất axit isocitric trình lên men - Các chủng nấm men sản xuất axit citric chủ yếu thuộc chi Candida,Saccharomycopsis, Hansenula, Pichia, Debaryomyces, Torulopsis, Kloeckera, Trichosporon,Torula, Rhodotorula, Sporobolomyces, Endomyces, Nocardia, Nematospora, Saccharomyces,và Zygosaccharomyces Trong số này, chủng Candida sử dụng rộng rãi cho việc sản xuất axit citric Các chủng bao gồm C lipolytica, C tropicalis, C zeylanoides, C fibrae, C intermedia, C parapsilosis, C petrophilum, C subtropicalis, C oleophila,C hitachinica, C citrica, C guilliermondii, C.sucrosa Gần đây, sản xuất acid citric chủng thông thường đột biến C lipolytica cơng bố -Vi khuẩn (Bacteria): có thơng tin sản xuất citrate vi khuẩn Vi khuẩn thường bao gồm Bacillus, Brevibacterium,Arthrobacter, Corynebacterium, Klebsiella, Aerobacter, Pseudomonas, Micrococcus Trong số này, B subtilis, B licheniformis, B flavum, A paraffinens có triển vọng chủng B licheniformis ni mơi trường có glucose, urê, cacbonat canxi, ammonium sulfate glutamate (pH 7.0) sản xuất 42g / l axit citric Nói chung, citric acid vi khuẩn sản xuất 50-100% thấp so với nấm nấm men Tuy nhiên, nghiên cứu mở hướng cho sản xuất acid citric vi khuẩn 3.1.4 Nguồn chất sử dụng trình sản xuất axit citric: a Môi trường nuôi cấy tối ưu phịng thí nghiệm: Mơi trường tối ưu bao gồm (g / L) saccharose 100-140; NH4NO3 1,52,5;KH2PO4 0,25-1,0; MgSO4.7H2O 0,25; CuSO4.5H2O 40,0(mg / L), K4Fe(CN)6 6,0 (mg / L) Độ pH môi trường điều chỉnh khoảng 2,5-5,0 A niger nuôi môi trường tổng hợp thu lượng axit citric tối đa 110 g/l Qazi et al nghiên cứu sản xuất acid citric từ môi trường tổng hợp nghiên cứu thí điểm (500 L 2.6 m3 bể khuấy lên men) có nồng độ tối đa axit citric 60,0 80,0 g / L, tương ứng Maddox cộng nghiên cứu sản xuất axit citric từ đường, mannose, galactose, xylose, arabinose, hỗn hợp chất A niger S.lipolytica thấy nồng độ tối đa acid citric khoảng 5,0 g 27,0g / L Ngoài ra, họ kết luận S lipolytica khơng đồng hóa xylose, arabinose galactose, A niger không chuyển hóa galactose Asenjo, et al điều tra việc sản xuất axit citric (6.0 g / L) từ cellulose thủy phân guilliermondii C Kirimura et al nghiên cứu sản xuất citric acid từ xylan thủy phân xylan Yang niger A Drysdale McKay nghiên cứu sản xuất citric acid từ inulin trình lên men bề mặt thấy sản lượng acid citric cải thiện luồng khơng khí bề mặt trình lên men, sản lượng từ inulin thấp từ saccharose 20-30% b Mật rỉ: Mật rỉ sản phẩm phụ ngành cơng nghiệp sản xuất đường ln sẵn có với giá thành tương đối thấp thành phần gồm: nước, đường (saccharose, đường nghịch chuyển khoảng 50% w / w), hợp chất nitơ betain (glutamine, asparagin,leucine, isoleucine, alanine, valine, glycine, nitơ nitrat nitrit), axit hữu kim loại nặng sắt, kẽm, đồng, mangan, magiê, canxi - Cao hàm lượng kim loại nặng mật đường vấn đề quan trọng trình lên men ức chế phát triển vi sinh vật, ảnh hưởng đến chất, pH, bất hoạt enzym liên quan với sinh tổng hợp sản phẩm Để khắc phục vấn đề này, mật rỉ chứa 14% (w / w) ban đầu xử lý nhựa trao đổi cation, axit sulfuric, tricalcium phosphate, kali ferrocyanide, EDTA Trong phương pháp hóa học dùng kali ferrocyanide phổ biến Nồng độ tối đa axít citric sản xuất từ mật rỉ A niger phương pháp lên men chìm lên men dao động từ 60,0 110,0 g / L c Tinh bột: Là nguồn liệu phổ biến,tinh bột có nhiều loại ngũ cốc, sắn, ngô, khoai …tuy nhiên với nguồn nguyên liệu tinh bột cần chủng vi sinh có hoạt tính amylase mạnh Mourya Jauhri thử nghiệm 17 dòng A niger để kiểm tra khả tạo axít citric sử dụng tinh bột thủy phân làm chất - Những dòng hiệu nhất, A Niger ITCC-605, lựa chọn cho để tiếp tục cải tiến Trong trường hợp này, nồng độ acid tối đa 64,7 g / kg glucose tiêu thụ - Ngoài nhiều nghiên cứu khác với nguồn nguyên liệu tinh bột khác từ đậu, ngô…và chủng vi sinh khác d Nguyên liệu từ trái cây: - Trong năm qua, nguồn nguyên liệu từ sản phẩm nông nghiệp quan tâm, loại chà là, sung, …cũng thử nghiệm nguyên liệu ta cần phải qua q trình trích xiro từ quả, xử lý kim loại… e Nguyên liệu từ hydrocarbon: Việc sản xuất acid citric từ hydrocarbon (n-parafin, n-ankan, olefin-) men lipolytica Y nghiên cứu Parafin sử dụng cho sản xuất axit citric thường gồm 12-19 nguyên tử carbon Môi trường có chứa n-parafin (50,0 g / L) bổ sung (g / L) : NH4NO3 5.0; KH2PO4 4,0; MgSO.7H2O 2.0; FeSO4 7H2O 0,4; MnSO4 H2O 0,05; thiamine • HCl 0,0005 Hỗn hợp n-parafin có thành phần sau (theo%): C12 0,10; C13 3,50; C14 21,50; C15 28,70; C16 25,30; C17 18,20; C18 2,30; C19 0,15; isoparaffins 0,25; chất thơm 0.01 - Những bất lợi sản xuất acid citric từ hydrocacbon nấm men hình thành acid isocitric trình lên men f Nguyên liệu từ chất thải nông nghiệp: Đây nguồn nguyên liệu quan tâm bên cạnh tạo lợi nhuận từ việc tạo axit citric mà giải gánh nặng môi trường nhà khoa học nghiên cứu sản xuất axit citric từ bã nho ép, táo ép, phế phẩm từ ngành công nghiệp chế biến kiwi, dứa…tuy nhiên nguyên liệu khác vấn đề lượng tạp chất nguyên liệu ảnh hưởng đến trình lên men 3.1.5 Sơ đồ qui trình sinh tỗng hợp axit citric: - Chú thích:Sinh tổng hợp acid citric từ đường sucrose A niger (a) invertase, (b) hexokinase;(c) phosphofructokinase; (d) pyruvate cacboxylaza; (e) citrate synthase; (f) aconitase; (g) isocitrate dehydrogenase; dehydrogenase (h)ketoglutarate; (i) succinic dehydrogenase; (k) malat dehydrogenase.(From Milsom, 10 + Khả tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sống vi khuẩn yếu + Chúng vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, loại có khả lên men hiếu khí kỵ khí Mơi trường MRS: (Mơi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn lactic Canxicacbonat ( CaCO3 ), acid sunfuric ( 78% ), cột trao đổi ion, than lọc hoạt tính, KMnO4, dung mơi hữu ( iso- propyl ether, isobutanol, trialkyl tertiary amines ) 3.3.3.5 Qui trình sản xuất 29 a) Sơ đồ qui trình b) Thuyết minh quy trình: - Quá trình sản xuất acid lactic gồm cơng đoạn chính: lên men, thu nhận tinh sản phẩm •Pha lỗng: Mục đích: chuẩn bị cho trình xử lý dung dịch Các Biến đổi: Vật lý: dung dịch tăng thể tích, giảm độ nhớt Hóa học: nồng độ chất tan giảm Hóa lý: tăng độ hòa tan chất Phương pháp thực hiện: Pha loãng với tỉ lệ nước : mật rỉ = 3:1 Yếu tố ảnh hưởng: chất lượng mật rỉ, nước pha lỗng •Xử lý dịch pha lỗng: Lọc than hoạt tính: Mục đích: tẩy chất màu, tách chất keo có mật rỉ Phương pháp thực hiện: cho dung dịch đường sau pha loãng chảy qua cột than hoạt tính 30 Các biến đổi: Vật lý : tăng độ trong, giảm khối lượng riêng dung dịch Hóa học: tạp chất bị loại bỏ Hóa lý :tách pha rắn khỏi pha lỏng Các yếu tố ảnh hưởng: Chất lượng than hoạt tính Acid hóa: Mục đích: chuẩn bị cho trình lên men tiêu diệt vi sinh vật Phương pháp thực hiện: Tiếp tục pha loãng dung dịch mật rỉ đến nồng độ chất khô 15%, Dùng H2SO4 với tỉ lệ 5% so với khối lượng dịch để acid hóa mơi trường Đun nóng dung dịch đến 90-95 0C Thực ly tâm lọc để thu dịch Các biến đổi: Hóa học: chuyển hóa đường saccharose thành đường nghịch đảo, pH dung dịch giảm cịn 2,8-3,0 Hóa lý: hệ keo bị phá vỡ Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt pH giảm xuống thấp Các yếu tố ảnh hưởng: Thời gian, nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân ™ •Chuẩn bị mơi trường Mục đích: tạo điều kiện tốt dung dịch để chuẩn bị cho trình lên men Phương pháp thực hiện: Tiếp tục pha lỗng dung dịch đường xuống cịn 5-10% Sử dụng bột CaCO3 để điều chỉnh pH ngược lại 6,3-6,5 Hạ nhiệt độ dung dịch 50 0C Chuẩn bị chất: Môi trường phải chứa đầy đủ chất dinh dưỡng điều kiện nhiệt độ, pH, thích hợp cho trình lên men - Tuỳ theo thành phần dịch rỉ thu tuỳ vào thành phần rỉ đường ban đầu mà bổ sung cho phù hợp Các biến đổi : Vật lý : dung dịch tăng thể tích, nhiệt độ giảm 50 0C Hóa học : pH tăng từ 2,8-3,0 lên 6,5 Các yếu tố ảnh hưởng : Khối lượng CaCO3 để chỉnh pH •Nhân giống : Mục đích : tăng sồ lượng tế bào vi khuẩn, chuẩn bị cho trình lên men 31 Phương pháp thực Cũng giống phòng thí nghiệm, muốn thực q trình lên men quy mô công nghiệp phải tiến hành nhân giống, đảm bảo số lượng tế bào với tuổi sinh lí thờikỳ hoạt động mạnh để cấy vào mơi trường lên men Nhân giống phải qua 2-3 bước, ta thường gọi nhân giống cấp 1, cấp 2, cấp v.v tuỳ thuộc vào quy mô sản xuất Việc nhân giống thường diễn cách ni chìm Các điều kiện ni lựa chọn cho xảy sinh trưởng không xảy tạo thành sản phẩm Ta tiến hành nhân giống môi trường dịch rỉ đường sản xuất điều kiện nhiệt độ, pH, dinh dưỡng yếu tố sinh trưởng tối ưu cho sinh sản vi khuẩn Canh trường nhân giống vi khuẩn canh trường khiết từ tế bào ban đầu Vi sinh vật nhân giống để đưa vào lên men đảm bảo yêu cầu công nghệ sau: - Dịch giống không tạp nhiễm - Các tế bào đảm bảo độ tuổi sinh lí thời gian sinh trưởng tốt nhất, có hoạt tính cao nhất, thường sau pha log - Các thông số kĩ thuật pH, màu sắc, mùi vị quy định dây chuyền công nghệ - lượng giống đảm bảo số lượng tế bào: 106 tế bào / ml Các biến đổi: Sinh học: số lượng tế bào tăng lên nhanh chóng Hố sinh: phản ứng xảy xúc tác hệ enzyme vi khuẩn lactic •Lên men: Mục đích: khai thác, tăng nồng độ acid lactic dịch lên men tổng hợp vi khuẩn Phương pháp thực hiện: Trong sản xuất acid lactic thường sử dụng loại vi khuẩn đồng hình, vi khuẩn Lactobacillus delbruckii sử dụng phổ biến Cấy giống vi sinh vật vào thiết bị lên men có đảo trộn học Trong giai đoạn đầu bổ sung O2 để tăng sinh khối vi khuẩn, sau loại O2 tiến hành lên men bề sâu điều kiện yếm khí Giống lấy từ q trình ni cấy đơn giản ta lấy giống mẻ trước Lượng giống cấy: 10% thể tích dung dich Nhiệt độ len men 50 0C q trình lên có nhiêt phát sinh phản ứng lên men ta cần làm lạnh trì pH= 5,5 Trong q trình lên men qui mơ sản xuất cơng nghiệp ta ln trì nhiệt độ tương đối cao khoảng 500C nhằm tạo nhiệt độ tối ưu cho L.delbrueckii số giống tương tự hoạt động Đồng thời nhiệt độ cao giảm nguy nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn 32 làm ảnh hưởng chất lượng sản phẩm Quá trình lên men bắt đầu sau tiêm giống vào dịch lên men Ta nhận biết lên men dựa vào lượng CO2 sinh phản ứng CaCO3 acid dung dịch Thời gian lên men 2-6 ngày Bổ sung CaCO3 dạng vôi mịn để trung hòa lượng acid tạo thành nhằm tránh tượng ức chế phát triển vi khuẩn lactic, tạo lactate canxium Cho vôi mịn khoảng 3-4 lần ngày, số lượng cho vào tùy thuộc vào lượng acid sinh ra, trì lượng pH dung dịch len men mức độ 5-6 Thực khuấy trộn trình lên men Các yếu tố ảnh hưởng: Ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy Trong nghiên cứu vi khuẩn lactic, thường sử dụng môi trường như: MRS, MRS tổng hợp, M17, môi trường cao nấm men, nước chiết cà chua, môi trường sữa, huyết sữa… Vi khuẩn lactic thuộc loai vi sinh vật dị dưỡng Nguồn lượng cần thiết cho hoạt động sống phát triển chúng nguồn lượng trao đổi chất với mơi trường ngồi Để trì sống, điều hịa q trình chuyển hóa tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có mơi trường dinh dưỡng làm nguồn cacbon (chủ yếu đường glucose), nguồn nitơ (cao nấm men, acid amin…), vitamin, muối khoáng nguyên tố vi lượng Mặt khác, nồng độ muối cao (> 6.5%) có mặt chất kháng sinh (penicillin, chloramphenicol…) ức chế sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic Vì vậy, ta cần bổ sung nguồn dinh dưỡng với liều lượng thích hợp giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men Ảnh hưởng pH mơi trường Mỗi loại vi sinh vật thích hợp với giá trị pH định môi trường nuôi cấy pH tối ưu cho phát triển vi khuẩn Lactobacillus delbruekii nằm khoảng 5-6 , trình lên men bị ức chế mạnh pH 4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ :Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng sâu sắc đến hoạt động sống tế bào vi khuẩn Nếu nhiệt độ thấp gây ức chế đến sinh trưởng tế bào, thời gian lên men chậm, hiệu suất lên men thấp Nếu nhiệt độ cao việc gây ức chế cịn gây chết tế bào Trong q trình lên men lactic ta cần thực trình lên men yếm khí để thu nhận sản phẩm đạt hiệu cao Ảnh hưởng nồng độ acid Acid lactic sản phẩm q trình lên men lactic hoạt động sống vi khuẩn lactic tạo nên Các vi khuẩn chịu acid, nhiên với lượng acid tích lũy mơi trường ngày nhiều làm ức chế phát triển chúng Điều giải thích thay đổi hình thái vi khuẩn lactic ủ chua thức ăn hay ủ chua rau Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường, khơng bị sản phẩm thân chúng tạo ức chế, người ta cho vào mơi trường chất đệm 33 thích hợp với lượng vừa đủ để trung hoà lượng acid sinh ra.Điều ứng dụng sản xuất acid lactic Người ta dùng chất đệm CaCO3 để chuyển acid lactic sang dạng lactate calcium, sau trình xử lý lactate calcium để thu hồi acid lactic •Tạo lactate canxium Mục đích :thu hồi axit lactic •Tinh sản phẩm Sản phẩm sau tách calcium ta thu acid lactic thô đưa qua cơng đoạn tinh Có ba cách tinh sản phẩm thường dùng lọc than hoạt tính, trao đổi ion sử dụng dung môi hữu methylic •Cơ đặc chân khơng: Mục đích: hồn thiện sản phẩm, tăng nồng độ acid lactic để dễ dàng bảo quản, vậnchuyển 3.3.3.6 Ứng dụng acid lactic công nghệ thực phẩm: ™ Sản xuất sản phẩm lên men từ sữa: Các sản phẩm lên men từ sữa như: sữa chua, phomat, bơ, Các trình chuyển hóa sản xuất làm cho sản phẩm thêm giàu dinh dưỡng tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm - Lên men sữa chua: Lên men sữa chua làm tăng giá trị dinh dưỡng có tác dụng trị bệnh đường ruột giúp ăn ngon dễ tiêu hóa bảo quản sữa tươi lâu khỏi bị hư hỏng Nguyên tắc làm sữa chua phát triển vi khuẩn lactic làm pH giảm mạnh, cazein sữa bị đông tụ Sữa từ dạng lỏng chuyển sang dạng keo sệt có mùi vị thơm ngon Quá trình làm sữa chua người ta phải sử dụng hai chủng vi khuẩn lactic đồng hình dị hình Vi khuẩn lactic đồng hình lên men nhanh làm giảm pH, vi khuẩn lactic dị hình lên men chậm tạo thành mùi thơm đặc trưng sữa chua - Sản xuất phomat: để sản xuất phomat người ta dùng enzyme đơng kết thu cazein sữa, sau tiếp tục cho lên men với nồng độ muối loãng Tuỳ loại phomat mà q trình ủ chín người ta sử dụng loài vi sinh vật khác Các loại vi sinh vật thường sử dụng để làm chín phomat là: vi khuẩn propionic, nấm mốc… - Sản xuất dưa chua: Trong rau vi khuẩn phát triển tạo acid lactic acid acetic với số chất hữu khác Các acid hữu làm giảm pH dịch chống lại tượng gây thối rau Bên cạnh làm tăng hương vị khối ủ chua rau Vì sản xuất sữa chua muối chua rau trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản - Sản xuất tương: Trong sản xuất tương q trình lên men lactic tạo pH thích hợp 34 cho sản phẩm tăng hương vị cho sản phẩm Muối chua rau Muối chua rau nhằm hai mục đích sau đây: bảo quản nguyên liệu làm tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan rau Nguyên tắc để muối chua rau tạo điều kiện để phát triển vi khuẩn lactic đồng thời hạn chế tác dụng vi khuẩn gây thối rữa Hiện có nhiều sản phẩm rau muối chua sử dụng rộng rãi Việt Nam giới ™ Ứng dụng sản xuất loại sữa bột bột giàu canxi: Bổ sung Lactate calcium vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh nướng,… 3.4 Công nghệ sản xuất acid amin 3.4.1 Khái niệm chung Acid amin, acid hữu gồm 20 loại: lyzin, methionin, treonin… Acid amin thường chứa nhóm –NH2 –COOH (nhóm amin nhóm cacboxylvà có cấu trúc đặc trưng sau: 3.4.2 Vai trị aa cơng nghệ thực phẩm: Phụ gia tạo vị: glutamat Dinh dưỡng: - Axít amin (amino acid) thành phần tạo nên giá trị dinh dưỡng riêng biệt phân tử protein, cần cho sống Trên thực tế, có loại axít amin liên kết chặt chẽ với nhau, kích thích thể phát triển mạnh mẽ Nếu thiếu loại quan trọng dẫn đến số bệnh nguy hiểm đáng tiếc xảy Một số aa thông dụng: Histidine - Histidine giúp thể phát triển liên kết mơ bắp với Nó cịn có tác dụng hình thành màng chắn myelin, chất bảo vệ bao quanh dây thần kinh 35 giúp tạo dịch vị, kích thích tiêu hóa - Histidine có nhiều dạng thực phẩm thịt, sữa, cá, gạo, bột mì Phenylalanine - Phenylalanine axít amin có chức bồi bổ não, tăng cường trí nhớ, tác động trực tiếp đến hoạt động não Ngồi ra, làm tăng lượng chất dẫn truyền xung động thần kinh, tăng tỷ lệ hấp thụ tia UV từ ánh sáng mặt trời, giúp tạo vitamin D nuôi dưỡng da - Tuy nhiên, dùng phenylalanine nhiều, dẫn đến độc hại, nên cần hạn chế Phenylalanine có sữa, hạnh nhân, bơ, lạc, hạt vừng Lysine - Nhiệm vụ quan trọng loại axít amin khả hấp thụ canxi, giúp cho xương khỏe, chống lão hóa cột sống, trì trạng thái cân nitơ có thể, tránh tượng giãn mệt mỏi Ngoài ra, lynsine cịn có tác dụng giúp thể tạo chất kháng thể điều tiết hormone truyền tải thông tin - Nguồn thực phẩm chứa lynsine: Phô mai, khoai tây, sữa, trứng, thịt đỏ, sản phẩm men Leucine - Leucine tương đối quan trọng trình điều chỉnh hàm lượng đường máu; nên tốt cho bệnh nhân mắc chứng “hyperglycemica”, người mong muốn đốt cháy chất béo nhanh chóng Hơn nữa, loại axít amin cịn có chức trì lượng hormone tăng trưởng để thúc đẩy q trình phát triển mơ - Nguồn thực phẩm chứa leucine: Đậu tương, đậu lăng, lịng đỏ trứng, hạnh nhân, cá, lạc, tơm Methionine - Axít amin đặc biệt cần thiết cho nam giới muốn phát triển bắp cuồn cuồn nhanh chóng phân hủy đốt cháy chất béo, đồng thời tăng thêm lượng testosterone sinh dục nam Ngoài ra, menthinine hỗ trợ chống chữa kiệt sức, viêm khớp bệnh gan - Nguồn thực phẩm chứa methinnine: Thịt, cá, đậu đỗ tươi, trứng, đậu lăng, hành, sữa chua, loại hạt Isoleucine - Loại axít đóng vai trị sống cịn q trình phục hồi sức khỏe sau quãng thời gian luyện tập thể dục thể thao Đồng thời giúp điều tiết lượng đường máu, hỗ trợ q trình hình thành hemoglobin đơng máu - Nguồn thực phẩm chứa isoleucine: Thịt gà, cá, hạnh nhân, hạt điều, trứng, gan, đậu lăng thịt bò Threonine 36 - Chức threonine hỗ trợ hình thành collagen elastin - hai chất liên kết tế bào thể Ngồi ra, tốt cho hoạt động gan, tăng cường hệ miễn dịch thúc đẩy thể hấp thụ mạnh dưỡng chất - Tuy nhiên, người ăn chay cần phải cân nhắc loại axít amin tồn chủ yếu thịt Và để bổ sung threonine, bạn ăn phó mát làm từ sữa gặn kem, gạo tấm, đậu tươi, lạc, hạt điều Thế hàm lượng amin nguồn lại thấp, nên buộc phải dùng sinh tố bổ sung - Nguồn thực phẩm chứa nhiều threonine nhất: Thịt, cá, trứng Valine - Loại axít amin chữa lành tế bào hình thành tế bào mới, đồng thời giúp cân nitơ cần thiết Ngồi ra, cịn phân hủy đường glucozơ có thể Nguồn thực phẩm chứa valine: Sữa, thịt, ngũ cốc, nấm, đậu tương lạc - Axít amin có tác dụng điều hịa protein hỗ trợ bạn trình ăn kiêng luyện tập thể dục thể thao Do đó, bạn cần hấp thụ loại liệt kê 3.4.3 Những phương pháp sản xuất aa Có nhiều pp sản xuất aa như: • Pp thủy phân • Pp tổng hợp hóa học • Pp kết hợp • Pp tổng hợp aa cơng nghệ VSV - Trong đó, ta thường sử dụng Pp VSV pp cho phép ta thu nhận aa dạng L Nguyên liệu sản xuất rẻ, dễ kiếm Tốc độ chao đổi chất, tốc độ sinh sản VSV cao cho ta xuất cao Giá thành sản phẩm thấp 3.4.4 Sản xuất aa cơng nghệ VSV Trong q trình sinh trưởng, phát triển, VSV tiến hành sinh tổng hợp aa tế bào Sau acid amin giải phóng khỏi tế bào MT mà người ta sử dụng VSV sản xuất aa theo quy mô công nghiệp 37 - Như vậy, việc sản xuất acid amin công nghệ vi sinh vật trình thu nhận aa tự từ trình tổng hợp tế bào VSV Đây điểm khác PP với PP thủy phân Do đó, việc điều khiển q trình sản xuất việc điều khiển q trình sống tế bào.Đây vấn đề phức tạp gồm hang loạt cơng việc điều khiển có liên quan đến tế bào sống nên đòi hỏi kiến thức sâu VSV kỹ thuật hóa lý Mặt khác, aa địi hỏi cơng nghệ riêng, chúng hồn tồn khơng giống vận hành sản xuất III Tổng kết Tầm quan trọng phương pháp sản xuất - Sản xuất acid hữu PP truyền thống lên men nhờ VSV PP quan trọng, phổ biến kĩ thuật đơn giản nguồn nguyên liệu rẻ, sản lượng nhanh nhiều Tuy nhiên, số acid hữu không sản xuất PP sử dụng PP đại với giá thành cao Tuy nhiên pp đại tốn nên việc sản xuất nước có cơng nghệ cao Hướng phát triển ứng dụng công nghệ sinh hoc giới Công nghệ sinh học (CNSH) làm nên nhiều điều kỳ diệu sống người đại, mở khả nhiều lĩnh vực Tuy nhiên lĩnh vực có nhiều bàn cãi, tranh luận chưa ngã ngũ Điển hình 38 phát minh nhân vơ tính cừu Dolly, phạm vi áp dụng người, Tác giả điểm qua vài nét hướng phát triển ứng dụng CNSH, qua nắm cách sơ lược tình hình phát triển CNSH xu hướng phát triển mạnh nước giới Từ đầu năm 80,CNSH vượt lên song hàng công nghệ tin học lĩnh vực thu hút đầu tư chất xám lĩnh vực đầu tư tài Với cạnh tranh "cực" lớn Mỹ, Nhật Liên hiệp Châu Âu (EU), sang kỷ 21 CNSH trở thành cơng nghệ thương mại hóa hàng đầu, mà cơng nghệ điện tử tin học làm kỷ 20 Để dễ theo dõi vấn đề, trước tiên điểm qua tình hình CNSH Hiện nay, người ta quan niệm CNSH (Biotechnology) gồm loạt kỹ thuật sinh học phân tử dùng thể sống phần thể sống để tạo sản phẩm có ích cho người Sức mạnh CNSH dựa khả hợp đồng tập thể nhiều kỹ thuật hợp tế bào, tái tổ hợp di truyền, phản ứng chuỗi nhờ men polymerase v.v nhằm thao tác biến đổi gen thể sống cách có mục tiêu Thực tế thập kỷ 70 80 nhà khoa học thành thạo việc nhận dạng, chuyển tách gen đặc hiệu nhằm làm cho người "chế tạo di truyền học" thể khác dù vi khuẩn, trồng hay động vật nuôi Triển vọng CNSH thật hấp dẫn: Gen sai hỏng thay gen lành để chữa bệnh; cung cấp cho trồng khả chống virus gây bệnh nhờ ghép gen lấy từ vi khuẩn, biến vi sinh vật thành "nhà máy" sản xuất Hormon hay dược phẩm, sản xuất Enzym công nghiệp hoạt động chất làm sạch, thuốc nhuộm, chất tẩy mầu v.v Đặc biệt lĩnh vực dược phẩm, CNSH sở phát minh nhiều phương pháp tạo thuốc hãng dược phẩm nhanh chóng bỏ hàng tỷ đô la để cải tiến xây dựng Labo thuốc cao tốc (highspeed drug labs) nghiên cứu thuốc với tốc độ cực nhanh hàng chục năm triển khai thuốc trước Trong lĩnh vực nông nghiệp, sau nhiều kỷ cải tiến trồng vật nuôi cách lai giống gây biến dị vừa tốn nhiều thời gian mà thuộc tính lại khơng chắn, từ đầu năm 80 người ta dùng CNSH đưa gen vào trồng vật nuôi để có đặc tính mong muốn Trong 15 năm qua, người ta tạo nhiều giống mễ cốc, đậu tương, hạt có dầu, bơng vải mang gen chống sâu bệnh kháng thuốc trừ cỏ dại, có chất lượng cao Người ta ước tính giới nửa đậu tương 39 khoảng phần ba mễ cốc trồng từ hạt giống có chuyển gen chống trùng bệnh Trong khoa học hình sự, năm 1986 người ta bắt đầu áp dụng CNSH việc nhận dạng "dấu vân di truyền" (genetic prints) qua xét nghiệm phân tích ADN thu từ mẫu sinh học (máu, tóc, tinh dịch v.v ) tìm thấy trường Đến năm 90 dấu vân sinh học người ứng dụng rộng rãi mục đích pháp lý y học Đặc biệt, năm 1998 vừa qua nhà nghiên cứu khoa học xúc tiến cực nhanh việc kết hợp sinh học kỹ nghệ tạo khơng lốc xoáy lĩnh vực Tháng năm 1998, J.Craig Ventor - nhà nghiên cứu hàng đầu trình tự chuỗi gen (gene sequencing) cộng tác với hãng bán máy xác định trình tự chuỗi gen để hoàn thành việc lập đồ genome (tức toàn tập hợp gen) người vào năm 2001 với chi phí 300 triệu USD, Dự án genome người (Human Genome Project) nhà nước Mỹ với thời gian hạn định đến năm 2005 hồn thành chi phí tới tỷ USD Chưa hết, tháng sau (tức tháng năm 1998) hãng khác tun bố hồn thành đề án năm (tức kết thúc vào năm 2000) Những kiện khiến cho năm 1998 người lãnh đạo khoa học Dự án nhà nước "Human Genome" phải đồng ý gia tăng nỗ lực gọt dũa lại đề cương để hoàn thành vào năm 2001 Nếu kỷ 20, kỹ nghệ hóa học điện tử lớn lên từ chương trình nghiên cứu phân tán để thành người khổng lồ toàn cầu, trước thềm kỷ 21 nhiều bước đột phá định lĩnh vực CNSH tốc độ kỹ nghệ hóa, thương mại hóa CNSH tăng nhanh khiến cho tập đoàn kỹ nghệ thương mại dần trở thành nơi thu hút nhà khoa học chuyên ngành Tất nhiên, trình kỹ nghệ hóa áp dụng qui mơ rộng CNSH đặt nhiều vấn đề "Đạo đức sinh học" (Bioethics) mà nhà đạo đức sinh học cảnh báo cần có quan tâm đặc biệt Thí dụ tháng 11 năm 1998, nhóm nghiên cứu Mỹ báo cáo phân lập tế bào gốc từ bào thai người (human embryonic stem cells) Khi nuôi cấy tế bào (lấy từ ca nạo thai cho phép lý y học), trình phân chia chúng trở nên biệt hóa thành tế bào tổ chức thể xương, ruột, tế bào máu v.v Điều mở khả cung cấp mô ghép cách dồi dào, an toàn dùng để chữa bệnh đặc biệt thối 40 hóa tế bào, chẳng hạn cấy neuron (tế bào thần kinh) vào não bệnh nhân Parkinson để điều trị bệnh Nhưng sở pháp lý cho công việc loại khác nước châu Âu nói chung, Mỹ nói riêng cịn nhiều điều khác phải bàn luận thêm Sự cạnh tranh CNSH thể rõ "cực" lớn Nhật Mỹ Các nhà dự báo khoa học cho rằng: Tương tự ứng dụng kỹ nghệ trước đây, CNSH dù đẻ Hoa Kỳ khai thác tốt Nhật dầm vốn, lành nghề sản xuất, chuyên vào việc tạo sản phẩm cải tiến sản phẩm Mặc dầu vậy, 20 năm qua Mỹ ln dẫn đầu CNSH lý chủ yếu sau đây: • Tuy Nhật có ưu việc tạo sản phẩm kỹ thuật chế tạo chưa trở thành nguồn cạnh tranh CNSH Đó CNSH cịn phụ thuộc nhiều vào việc làm sáng tỏ chế bệnh chức chuyển hóa thể sống (thuộc lĩnh vực nghiên cứu bản) để triển khai sản phẩm có ích mặt thương mại • Ưu việt Mỹ cấu trúc nghiên cứu khoa học Chính phủ Mỹ ủng hộ nghiên cứu sinh học y tế nông nghiệp mà cịn khuyến khích nhà nghiên cứu khu vực nhà nước tư nhân Chính viện hàn lâm Mỹ có vai trị xúc tác cho việc chuyển cơng nghệ từ phịng thí nghiệm trường đại học sang khu vực tư nhân Còn Nhật sao? Nhật chi phí cho nghiên cứu khoa học CNSH chủ yếu cho "kỹ thuật chế tạo trình sinh học" (Bioprocess engineering) cho nghiên cứu Các nghiên cứu khoa học sinh học không đầu tư đầy đủ việc chuyển từ khu vực nhà nước sang khu vực tư nhân bị hạn chế Người Nhật dựa vào Mỹ nước châu Âu cung cấp "đột phá" (breakthroughs), cách áp dụng nhanh với lành nghề đáng kể trình triển khai nâng bậc kỹ nghệ, họ nhẩy lên hàng đầu nắm phần lớn thị phần thị trường giới sản phẩm CNSH Người Nhật làm thời kỳ sau đại chiến giới lần thứ hai để trở nên nhà sản xuất hàng đầu acid amin, vitamin kháng sinh dựa công nghệ lên men cổ điển Trong CNSH Mỹ tập trung vào lĩnh vực y dược Nhật lại tập trung nhiều vào lĩnh vực 41 nơng nghiệp, hóa học mơi trường Trong năm qua, sản phẩm CNSH đặn thâm nhập thị trường doanh số giới lên đến 50 tỷ USD vào năm 2000 bước tiến coi chậm nhiều so với mong đợi Sở dĩ lí sau : -Phát minh triển khai nhanh thương mại hóa sản phẩm sinh học khó nhiều -Các mối quan tâm đến an toàn sức khỏe đạo đức sinh học (bioethics) khiến cho nhiều ứng dụng CNSH xã hội chấp nhận cách dè dặt chậm chạp, đặc biệt ứng dụng lĩnh vực y học Nhiều tranh luận nổ chưa ngã ngũ phạm vi áp dụng người sau phát minh nhân vơ tính cừu Dolly hay việc có dùng hay khơng dùng làm thực phẩm vật ni trồng có thuộc tính lạ ghép gen lồi khác ? Tóm lại, Mỹ nước đầu CNSH Hệ thống nghiên cứu khoa học Mỹ đẩy nhà nghiên cứu suy nghĩ CNSH phương tiện để tạo sản phẩm Trong hệ thống nghiên cứu khoa học Nhật định hướng nhiều vào kỹ thuật sản xuất Không phải sở nói tương lai gần, vị tương đối yếu Nhật khoa học sinh học cản trở nỗ lực Nhật việc trở thành nước cạnh tranh hàng đầu CNSH kỷ 21 Nếu điều thể nghiệm lĩnh vực CNSH thể nghiệm số lĩnh vực cơng nghệ cao khác có tình hình tương tự , thí dụ y học cơng nghệ cao 42 Tài liệu tham khảo: - Công nghệ vi sinh : Nguyễn Đức Lượng - Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen: TS Khuất Hữu Thanh - Sinh học 12: giáo dục đào tạo - Các sản phẩm lên men cổ truyền : Nguyễn thị Hiền - Trang Web: Tailieu.vn http://en.wikipedia.org/wiki/Organic_acid 43