ĐO SỰ TRAO ĐỔI KHÍ Ở LÁ BẰNG MÁY OXYLAB (HANSATECH) Đỗ Thường Kiệt Nguyên lý hoa ̣t đô ̣ng và cấ u ta ̣o của máy 1.1 Nguyên lý hoa ̣t đô ̣ng của máy: Điện cực oxygen Điện cực oxy dựa nguyên tắc điện hóa học Delieu Walker (1972) phát triển từ điện cực Clark (1956) Bộ cảm biến bao gồm điện cực: cathode platin (Pt), anode bạc (Ag) điện cực đặt đĩa plastic, cathode nằm vòm nhô lên trung tâm đĩa, anode tạo thành vòng nằm rãnh chứa dung dịch KCl bão hòa Anode cathode nối với nhờ mao dẫn dung dịch điện ly lớp giấy thấm đặc biệt Một lớp màng teflon (màng polythene) mỏng đặt cho phép thấm oxy từ buồng đo vào dung dịch điện ly Lớp giấy thấm màng căng cố định đĩa điện cực nhờ vòng cao su nhỏ Khi điện ta ̣i điện cực 600 – 700 mV, oxy bị khử bề mặt cathode (Pt xúc tác) tạo H2O2 oxy nhận e- phóng thích từ phản ứng anode Dòng điện sinh ở cực âm phận Oxylab nối với điện cực ghi nhận số liệu tự động xử lý nhờ phần mềm Oxylab32 máy tính Phần mềm thể (dạng biểu đồ thời gian thực) lượng O2 (µmol) có buồng đo theo thời gian (phút) Phản ứng xảy Anode: Phản ứng xảy Cathode: Ag  Ag+ + e- O2 + 2H2O +2e-  H2O2 + OH- Ag+ + Cl-  AgCl H2O2 + 2e-  2OHO2 Màng thấ m oxy Cầ u điêṇ trở KCl Cathode (Pt) Dung dich ̣ KCl Anode (Ag) 600 – 700 mV C V A Hình 1: Cấu tạo điện cực oxy A: Anode (Ag); C: Cathode (platin); V: Vòng đệm cao su 1.2 Cấu tạo máy Nguồ n sáng Buồ ng giải nhiê ̣t (trên) van thông khí Buồ ng đo Điê ̣n cực Buồ ng giải nhiê ̣t (dưới) Hình 2: Cấu tạo buồng đo oxy LD2 và nguồ n sáng LH36/2R Máy tính Hình 3: Sơ đồ lắ p đặt ̣ thố ng đo quang hợp bằ ng điê ̣n cực oxy Buồng đo (với buồng giải nhiệt nối với hệ thống bơm giải nhiệt); Nhiệt kế (đo nhiệt độ buồng đo); Bộ nhận tín hiệu; Bộ nguồn sáng (gồm nguồn đèn LED); Bơm giải nhiệt Chuẩn bị điện cực (Do cán bô ̣ phu ̣ trách máy thực hiên) ̣ Nhỏ giọt dung dịch KCl bão hòa (50%) lên đầu điện cực Cathode (Pt) giọt vào rãnh chứa anode (Ag) Đặt giấy thấ m kích thước (1,5 cm x 1,5 cm) lên đầu điện cực Pt, đặt tiếp màng thấm oxy S4 (kích thước tương tự) lên Hình 4: Cách đặt màng giấy đệm vào điện cực Giấy đệm dùng làm cầu nối dẫn điê ̣n nên phải tiếp xúc điện cực Sau dùng dụng cụ kèm theo máy để đặt vòng đệm cao su bao lấy vòm điện cực làm căng giấy đệm màng bán thấm Đặt vòng đệm cao su bên điện cực và lắ p điê ̣n cực vào đáy buồ ng Hình 5: Cách dùng dụng cụ cố định màng giấy đệm vào điện cực nhờ vòng cao su Lưu ý: Buồ ng giải nhiêṭ dưới, điêṇ cực và buồ ng đo bây giờ là khố i cố đinh ̣ suố t thời gian sử du ̣ng (điê ̣n cực cầ n được chuẩ n bi ̣la ̣i sau – tháng) Hình 6: Phầ n dưới buồ ng đo gồ m buồ ng giải nhiê ̣t dưới và thân buồ ng đo giữ cố ̣nh điê ̣n cực ở giữa Nối dây từ điện cực vào OxyLab nối với máy tính (Hiǹ h 3) Các lưu ý trước sử dụng máy 3.1 Điện cực áp suất buồng đo Trước ĐẬY (hoặc MỞ) nắp CÀI CHỐT khóa buồng đo (phần nắp buồng giải nhiệt trên), phải MỞ van thông buồng đo với bên ngoài, tránh áp lực lên màng điện cực Nế u điề u này xảy ra, thông số điê ̣n cực sẽ thay đổ i rấ t lớn làm sai kế t quả đo Hình 7: Á p lực tạo buồ ng đo đậy hoặc mở nắ p 3.2 Sự cân bằ ng oxy buồ ng đo Điê ̣n cực oxy chỉ có thể đo được lượng oxy xung quang đầ u điê ̣n cực, nên sự khuyế ch tán đề u oxy buồ ng đo rấ t quan tro ̣ng Để đa ̣t được điề u này, lớp xố p dày, thoáng khí được đă ̣t vào buồ ng đo giúp cho oxy khuyế ch tán nhanh và đề u ta ̣i mo ̣i điể m Hình 8: Thứ tự đặt lá, điã đê ̣m, các lưới kim loại và lớp xố p buồ ng đo 3.3 Sự cân CO2 buồng đo Buồng đo LeafLab2 Hansatech hệ thống kín Trong trình quang hợp mẫu làm giảm lượng CO2 buồng (Buồng đo oxy tích ≈ 7ml, VCO2≈ 0,035%*7*1000=245µl) 10cm2 mẫu tươi sử dụng khoảng 50µl CO2/phút, lượng CO2 buồng đo cạn sau 4-5 phút Để cân lượng CO2 buồng đo, đệm bicarbonate (KHCO3 hay NaHCO3) M sử dụng Dung dịch cho vào lớp vải xốp; diều kiện 25˚C, dung dịch phân ly thành [HCO 3-] [CO2] với tỷ lệ 90:1 làm ổn định lượng CO2 buồng đo Lưu ý: Sau đo mẫu nên thay lớp vải đê ̣m khác hoă ̣c thấ m khô trước cho thêm đê ̣m bicarbonat vào Nế u buồ ng đo chứa quá nhiề u nước sẽ ảnh hường đế n sự khuyế ch tán của oxy buồ ng đo, làm sai lê ̣ch kế t quả Chuẩn điện cực  Đê ̣m CO2: Nhỏ giọt (≈ 0,2 ml) dung dịch đệm (KHCO3 1M) lên lớp vải xốp để trì lượng CO2 buồng đo  Đâỵ nắ p buồ ng đo: Lắ p ̣ thố ng hiǹ h Nắp (buồng giải nhiệt (trên)) được gài chă ̣t vào buồ ng đo nhờ chố t ở bên Nguồn sáng được đă ̣t ở cùng để chiế u sáng hoă ̣c che tố i  Khôi phục cài đă ̣t gố c: Trên giao diện phần mềm, chọn Configure  Control box Đánh dấ u chọn Auto calibrate nhấ n nút Default setting chọn OK  Bắ t đầ u chuẩ n điê ̣n cực: Nhấ n nút Calibrate (hoặc Calibrate  Oxygen  New)  Khai báo nhiê ̣t đô ̣ buồ ng đo: Nhập giá trị nhiệt độ buồng đo (đo ̣c nhiê ̣t kế , ví dụ 27oC) chọn OK  Bước 1: Khi xuất bảng Oxygen calibration lần đầu (có khuyến cáo chương trình: Establish “air line” in chamber), mở van thông buồng chứa mẫu với bên chọn OK Chờ đường biểu diễn O2 ổn định (đường thẳ ng song song với tru ̣c hoành) chọn Stop  Lưu ý: Bước này chương triǹ h ghi nhâ ̣n lượng oxy buồ ng đo (cũng chiń h là lượng oxy bên ngoài vì van thông buồ ng đo mở)  Bước 2: Khi xuất bảng Oxygen calibration lần 2, khóa van buồng, bơm vào buồng 1ml O2 qua van lại sau khóa van Chọn OK Chờ đế n đường biểu diễn O2 ổn định, chọn Stop Lưu ý: Bước này chương triǹ h ghi nhâ ̣n lượng oxy gia tăng buồ ng kiń có thêm mô ̣t lượng oxy 1ml không khi.́  Bước 3: Khi xuất bảng Oxygen calibration lần (có khuyến cáo chương trình: Establish “air line” in chamber tương tự bước 1), mở van thông buồng chứa mẫu với bên chọn OK Chờ đường biểu diễn O2 ổn định chọn Stop Kế t thúc quá triǹ h chuẩ n điê ̣n cực (cho ̣n OK) Vận hành máy – Đo sự trao đổ i khí Đĩa mẫu dùng để đo mẫu cắt dụng cụ cắt xác 10 cm2 Nhỏ giọt (≈ 0,2 ml) dung dịch đệm (KHCO3 1M) lên lớp vải xốp để trì CO2 buồng (sau lần đo hay chuẩn phải thay lớp vải xốp nhỏ dùng dịch mới) Lắp hệ thống lại hình Chương trình Oxylab V1.15 phải mở từ lúc chuẩn đến lúc đo 5.1 Các lê ̣nh bản được sử dụng đo sự trao khí GraphSet axes: Thay đổ i giới ̣n oxy và thời gian được thể hiê ̣n FileSave/Load: Lưu/xuấ t đồ thi.̣ ToolGet rate: Vào chế đô ̣ lấ y từ đồ thi ̣ giá tri ̣ của lượng oxy thay đổ i khoảng thời gian bấ t kỳ (µmol O2/phút) Start/stop: Bắ t đầ u ghi nhâ ̣n đường biể u diễn oxy theo thời gian 5.2 Đo cường đô ̣ quang hợp Mở nguồn sáng nhấn Start để bắt đầu ghi nhâ ̣n đồ thi ̣và Stop để dừng Thời gian đo khoảng 3-10 phút (tùy mẫu), lúc đường biểu diễn gia tăng oxygen tuyến tính hệ số góc (rate) số mol oxy gia tăng phút 5.3 Đo cường đô ̣ hô hấ p Tắt nguồn sáng và thao tác tương tự đo quang hợp Thời gian đo khoảng 35 phút, lúc đường biểu diễn gia giảm oxygen tuyến tính hệ số góc (rate) số mol oxy giảm phút 5.4 Ghi nhận kết Chọn menu Tools  Get rate để vào chế đô ̣ ghi nhận số liệu từ biểu đồ Chọn đoạn tuyến tính (di chuyển mũi tên đỏ) biểu đồ hoă ̣c cho ̣n nút options và nhâ ̣p khoảng thời gian cầ n lấ y số liệu Nên chọn đoạn tuyến tính giá trị quang hợp hay hô hấp ổn định mẫu Click lên đoạn vừa chọn (hoă ̣c nhấ n Options, nhâ ̣p khoảng thời gian và cho ̣n OK), máy tính tính toán đưa số liệu Chọn OK để ghi nhận số liệu vào bảng Đây số liệu trung bình đoạn vừa chọn Nếu cần lấy sai số máy theo thời gian chọn lấy số liệu đoạn tính trung bình Kết hệ số góc (Rate) trên bảng rate measurement với đơn vị: µmolO2/10cm2/phút số mol Oxygen phóng thích (quang hợp) hay thu vào (hô hấp) 10 cm2 phút 5.5 Lưu mở lại biểu đồ Nếu xuất bảng Start Recording: Chọn Save để lưu lại đường biểu diễn thành tập tin; chọn append đường biểu diễn tiếp nối đường biểu diễn cũ; Chọn Overwrite để xóa đường biểu diễn cũ bắt đầu đường biểu diễn Chọn Files  Save để lưu biểu đồ Đánh vào ô file name tên tập tin muốn lưu chọn Save Nhập ghi tập tin chọn OK để hoàn tấ t quá triǹ h lưu Tương tự, chọn Files  Load để lấy lại biểu đồ Có thể lấy số liệu từ biểu đồ bước ghi nhận kết Chọn tập tin cần lấy chọn Open Mô ̣t số lưu ý đo các mẫu thực vâ ̣t khác  Máy leaflab2 với buồ ng đo LD2 được thiế t kế để đo sự trao đổ i khí của lá Khi đo những mẫu thực vâ ̣t khác mô se ̣o và các phầ n với diê ̣n tić h tiế p xúc phức ta ̣p, phải giảm thiể u sai số cho máy bằ ng cách: không để khoảng trố ng quá lớn xung quanh mẫu, không làm dâ ̣p mẫu, số lầ n lă ̣p la ̣i lớn tùy mẫu (trên lầ n lă ̣p la ̣i)  Đố i với các mẫu lá khác nhau, cầ n để ổ n đinh ̣ mẫu (giữ ẩ m và đă ̣t tố i) mô ̣t khoảng thời gian tùy loài thực vâ ̣t Phải khảo sát pha không ổ n đinh ̣ (pha lag, biể u hiê ̣n bằ ng đường cong đồ thi)̣ đă ̣t vào buồ ng đo để có được giá tri ̣ ổ n đinh ̣ sau đó (pha ổ n đinh, ̣ biể u hiê ̣n bằ ng đường thẳ ng đồ thi).̣  Thực hiê ̣n thao tác đo cho các lầ n đo lă ̣p la ̣i phải tuân theo nguyên tắ c: thu mẫu càng tương đồ ng càng tố t (mẫu có cùng đô ̣ tuổ i, cùng vi ̣ trí cây, vi ̣trí cắ t các lá giố ng nhau), thời điể m thu mẫu, thời gian ổ n đinh ̣ mẫu và đo mẫu phải giố ng  Sau đo mẫu, phải sử du ̣ng mô ̣t tấ m đê ̣m khác có tẩ m lượng dung dich ̣ bicarbonat xác đinh ̣ (3 gio ̣t) để đo mẫu kế tiế p Lưu ý viêc̣ bảo quản máy  Viê ̣c chuẩ n bi ̣ điê ̣n cực chỉ người hiể u rõ về máy làm Không tự ý chuẩ n bi ̣điê ̣n cực Nế u điê ̣n cực có vấ n đề cầ n báo cho người quả lý máy  Trước và sau đo xong, dùng kep̣ gắ p các điã đê ̣m và inox khỏi buồ ng đo, dùng khăn giấ y đã thấ m mô ̣t it́ nước cấ t lau nhe ̣ bên buồ ng đo (không lau ở lỗ điê ̣n cực) Sau đó, lau khô buồ ng đo và đă ̣t các điã trở vào  Luôn kiể m tra và giữ cho các điã đê ̣m và buồ ng đo khô, sa ̣ch hóa chấ t trước và sau đo  Mở van thông buồ ng đo đâ ̣y hoă ̣c mở nắ p buồ ng  Đâ ̣y kiń (khóa van thông buồ ng đo) không còn sử du ̣ng máy, đâ ̣y máy la ̣i để tránh bu ̣i và nước làm hỏng các thiế t bi ̣điê ̣n của máy Tài liệu tham khảo Clark, L.C (1956) Monitor and Control of Blood and Tissue Oxygen Tension (Transaction of the American Society for Artificial Internal Organs 2, 41) Delieu, T.D and Walker, D.A (1972) An and Improved Cathode for the Measurement of Photosynthetic Oxygen Isolated Chloroplasts (New Phytologist 71, 201-225) URL: http://www.hansatech-instruments.com