Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin cảm ơn thầy cô trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM tận tình dạy bảo, xây dựng kiến thức cần thiết cho em trình học tập nghiên cứu trường Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt thầy Lê Văn Việt Mẫn giúp đỡ hướng dẫn tận tình mà thầy cô dành cho em suốt trình làm luận văn Mặc dù gặp nhiều khó khăn thời gian vừa qua, động viên, giúp đỡ thầy cô, bạn bè gia đình giúp em hoàn thành tốt nhiệm vụ giao Em xin chân thành cảm ơn tất người giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn Nguyễn Đức Ninh Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC Chương 1: GIỚI THIỆU Thời gian lên men dài, suất lên men thấp Tiêu tốn nhiều lượng để tách nấm men khỏi rượu vang sau trình lên men Khả tái sử dụng nấm men thấp Khoù tự động hóa trình lên men Tăng tốc độ sử dụng chất, rút ngắn thời gian lên men Ổn định hoạt tính nấm men Các chất mang cố định có tác dụng tác nhân bảo vệ tế bào chống lại ảnh hưởng bất lợi pH, nhiệt độ, dung môi kim loại nặng Dễ dàng tách nấm men khỏi sản phẩm sau trình lên men, làm giảm chi phí thiết bị lượng Có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần Taïo điều kiện thuận lợi cho việc tối ưu hóa tự động hóa trình lên men Động học trình sinh trưởng nấm men Động học trình sử dụng chất: đường khử, nitơ amin nitơ vô vơ Động học trình hình thành sản phẩm: thời gian hạn hẹp chưa có điều kiện kinh phí nên phạm vi luận văn này, trình bày sản phẩm quan trọng trình lên men cồn mà chưa trình bày hợp chất hương Và khảo sát thêm chuyển hóa acid hữu suốt trình lên men Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 TOÅNG QUAN VỀ RƯU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯU VANG 2.1.1 Rượu vang Nhóm rượu vang gas .3 Nhoùm rượu vang có gas 2.1.2 Nho Hàm lượng chất dinh dưỡng cao, cần thiết cho phát triển nấm men vang Haøm lượng acid cao, đủ để ức chế phát triển vi sinh vật không mong muốn sau trình lên men .4 Hàm lượng đường đủ để tạo hàm lượng cồn cao, nhờ ức chế vi sinh vật gây hư hỏng rượu vang Caùc hợp chất hương với thành phần lượng thích hợp, rượu vang tạo thành có tính chất cảm quan toát Đường Nitơ Acid hữu SO2 Tannin Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ acid phenolic laø acid gallic vaø acid ellagic Tannin ngưng tụ: polymer flavan-3-ol (epicatechin, catechin vaø gallocatechin) vaø flavan-3,4-diol 2.1.3 Naám men .9 i Luaän văn tốt nghiệp Thứ gọi non-Saccharomyces (NS – loài nấm men không thuộc giống Saccharomyces), thường xuất bề mặt trái nho với nhiều loại vi sinh vật khác Hầu hết loài NS khả tồn nồng độ cồn cao 6%v/v (ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis phát triển môi trường có nồng độ cồn lên đến 12%) Trước đây, nấm men NS xem vi sinh vật gây hư hỏng Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy rằng, số loài nấm men NS có lợi cho chất lượng rượu vang, giúp tăng cường hương vị rượu vang [23, 41, 42, 45, 149, 166, 207] Nhóm khác góp phần vào hương vị rượu vang, nhân tố trình lên men cồn loài thuộc giống Saccharomyces Saccharomyces có khả chịu đựng thay đổi điều kiện môi trường với nồng độ ethanol acid hữu tăng cạn kiệt chất dinh dưỡng (Pretorius, 2000) Như vậy, có nhiều giống loài nấm men dịch nho, giống Saccharomyces, mà chủ yếu loài Saccharomyces cerevisiae loài đảm nhiệm việc thực trình chuyển hóa sinh học quan trọng lên men vang Chính thế, Saccharomyces cerevisiae gọi “naám men vang” [58, 85, 92, 149, 166, 199] Bước thứ bước chọn lọc sơ dựa khả chịu đựng SO2, loài có hại, khả phát triển nhiệt độ cao tạo bọt thấp 10 Bước thứ hai bước chọn lọc thức dựa hàm lượng acid dễ bay ethanol tạo thành hàm lượng đường sót lại rượu vang 10 Shinohara cộng (1994) nghiên cứu việc chọn lọc lai giống chủng nấm men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả chịu đựng SO2 làm tăng chất lượng rượu vang [178] 11 Serra cộng (2005) nghiên cứu việc lai tạo Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces bayanus var uvarum để kết hợp ưu điểm loài này, làm tăng chất lượng sản phẩm sản xuất rượu vang có hàm lượng acid thấp (pH cao) [175] 11 2.2 CỐ ĐỊNH NẤM MEN 11 2.2.1 Sơ lược số vấn đề kỹ thuật cố định tế bào .11 Sử dụng màng membrane vi xốp .13 Sử dụng maøng vi bao 13 Đơn giản, dễ thực [113, 185, 189] 13 Không ảnh hưởng đến trình truyền khối [185, 138] 13 Diện tích tiếp xúc tế bào cố định chất mang lớn so với kỹ thuật khaùc [138] .13 Có thể đạt mật độ tế bào đơn vị thể tích chất mang cao so với canh trường vi sinh vật tự [138] 13 Chất mang có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại thực khuẩn tế bào ngoại lại điều kiện gây stress [138] 13 Đơn giản, dễ thực .13 10 Không ảnh hưởng đến trình truyền khối 13 Do màng chắn tế bào dung dịch tế bào dễ bị tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự dung dịch [113, 40] 13 11 Khi tế bào tăng nhiều sinh khối làm giảm độ bền mạng gel [39] 13 12 Tế bào bề mặt dễ thoát khỏi mạng gel phát triển môi trường tế bào tự [113, 39] 13 ii Luận văn tốt nghiệp 13 Do màng chắn tế bào dung dịch tế bào dễ bị tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự dung dịch 13 14 Các vật liệu cellulose: DEAE-cellulose, gỗ, mùn cưa, mùn cưa tách lignine, … [113, 138] .14 15 Các vật liệu vô cơ: polygorskite, montmorilonite, hydromica, sứ xốp, thủy tinh xốp, vòng Raschig, silicate, hợp chất titanium, … [113, 138] .14 16 Polymer tự nhiên [113]: .14 17 Polysaccharide: alginates, −carrageenan, agar, chitosan vaø polygalacturonic acid 14 18 Polymer khác: gelatin, collagen polyvinyl alcohol 14 19 Polymer tổng hợp: polyacrylamide, polyurethane polyvinyl chloride [138] 14 2.2.2 Các chất mang cố định nấm men sản xuất rượu vang .14 2.2.3 Cố định nấm men gel alginate 19 Là thành phần cấu trúc tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối lượng chất khô 19 Laø polysaccharide maøng bao loại vi khuẩn đất .19 Block M: gồm gốc mannuronic acid nối tiếp 19 Block G: goàm gốc guluronic acid nối tiếp 19 Block MG: gồm gốc mannuronic acid guluronic acid luân phiên nối với 19 Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên 20 Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên 21 Ưu điểm .22 Quá trình cố định dễ thực [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209] 22 Điều kiện cố định ôn hòa, xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất Do đó, tế bào cố định không bị hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211].22 Alginate chất mang trơ mặt hóa hoïc [176] .22 Alginate độc tính, thích hợp cho sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169, 176, 192] .22 Độ xốp mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán chất sản phẩm [8, 27] 22 Gel alginate giữ độ bền nhiệt độ lên men cao [205] 22 Nhược điểm cách khắc phục 22 Độ bền gel giảm theo thời gian leân men [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]: 22 Gel Ca-alginate nhạy với chất tạo chelate (hợp chất hữu nguyên tử tạo thành nhiều liên kết phối trí với kim loại dung dịch) phosphate, citrate lactate chất không tạo gel (non-gelling) ion sodium magnesium Sự có mặt ion dung dịch làm cho hạt bị phồng ra, dẫn đến tăng kích thước lỗ xốp, làm giảm tính ổn định phá vỡ cấu trúc hạt gel Thông thường người ta thường thêm vào môi trường lên men chất ổn định gel CaCl2, celite pectine với hàm lượng thích hợp để ổn định độ bền gel Hoặc làm cứng gel cách sử dụng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) loại vật liệu composite (colloidal silica) [10, 102, 103, 144, 193, 194] 23 Không bền hóa học dung dịch điện phân dung dịch có pH cao Để khắc phục điều này, nhiều nghiên cứu thực có nhiều phương pháp đưa ra: tạo liên kết hạt gel với glutaraldehyde (Takata cộng sự, 1977), với polycations (Birnbaum cộng sự, 1981) sấy khô hạt gel (Klein Wagner, 1978; Burns cộng sự, 1985) Những phương pháp cải iii Luận văn tốt nghiệp thiện độ bền dung dịch điện phân, rõ ràng chúng phức tạp tốn nhiều thời gian Một số tác giả đưa phương pháp khác dùng ion Ba2+ Sr2+ thay cho ion Ca2+ truyền thống Các ion có lực mạnh alginate, hạt gel barium strontium alginate bền dung dịch điện phân so với hạt gel calcium alginate Tuy nhiên, ion không ứng dụng rộng rãi độc tính nấm men với môi trường [144, 183, 192, 193, 194] .23 nh hưởng khối lượng phân tử 23 nh hưởng tỷ lệ G/M 24 Tốc độ lên men có xu hướng tăng, không đáng kể [101] .24 Độ bền gel giảm, ion hóa trị calcium, barium, strontium ưu tiên liên kết vào block G block M block MG Do alginate có hàm lượng G lớn tạo thành gel xốp, giữ độ cứng vững thời gian dài Trong suốt trình tạo liên kết với Ca2+, loại alginate không bị phồng nở hay co rút, giữ hình dạng tốt Thêm vào đó, alginate có hàm lượng G cao cản trở sinh trưởng tế bào nấm men sau cố định Trái lại, alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm xốp dễ bị rã so với gel giaøu G [101, 116, 144, 173, 181, 192, 193] Kazuaki cộng (1995) nghiên cứu kết luận gel alginate giàu G thích hợp để cố định nấm men gel gây cản trở đến khả khuếch tán glucose có độ bền học cao [210] .24 nh hưởng nồng độ alginate 25 nh hưởng pH tạo gel 25 nh hưởng nhiệt độ tạo gel 25 nh hưởng mật độ tế bào hạt 25 nh hưởng tỷ lệ S/V .25 2.2.4 Moät số tính chất nấm men cố định 25 Banyopadhyay cộng (1982) tiến hành nghiên cứu khảo sát trình sinh trưởng nấm men cố định thủy tinh xốp (Controled pore glass) phương pháp hấp phụ Khả sinh trưởng nấm men tự cố định đánh giá gián tiếp thông qua tốc độ hấp thu O2 tốc độ sinh CO2 Kết nghiên cứu cho thấy nấm men cố định có tượng giảm khả hấp thu O2 sinh CO2 so với nấm men tự [16] 26 Doran cộng (1985) tiến hành khảo sát trình sinh trưởng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định gelatin Kết thực nghiệm thu tương tự kết Bandyopadhyay cộng (1982) Ngoài tác giả nhận thấy tốc độ sinh trưởng tỷ lệ nảy chồi nấm men cố định gelatin thấp so với nấm men tự [56] .26 Hệ lên men sử dụng nấm men cố định hệ phản ứng dị thể, đó, chất dinh dưỡng có xu hướng tập trung bề mặt chất mang, nấm men hấp phụ bề mặt chất mang có điều kiện tiếp xúc với nồng độ chất dinh dưỡng cao so với môi trường đồng thể Chính thay đổi áp lực thẩm thấu cách đột ngột gây cân trao đổi chất qua màng tế bào, làm ảnh hưởng đến trình hô hấp tế bào [16] .26 Chồi hình thành vị trí bề mặt tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, nhiên phổ biến chồi mọc cực ellipsoide tế bào nấm men lưỡng bội Vì cực tế bào nấm men gắn vào chất mang vô tình làm hình thành iv Luận văn tốt nghiệp chồi [56] 26 Wada cộng (1980) nhận thấy nấm men cố định sinh trưởng giữ ổn định khoảng 5,4.109 tế bào/mL gel [201] 26 Melzoch cộng (1994) nghiên cứu phát triển hình thái nấm men cố định gel Ca-alginate Các tế bào nấm men cố định sau hoạt hóa, nuôi cấy môi trường giàu chất dinh dưỡng, số lượng tế bào tăng lên nhanh (khoảng 1010 tế bào/mL gel) sau giữ nguyên không đổi [142] 26 Banyopadhyay vaø cộng (1982) giả thuyết cân trao đổi chất làm cho chồi nấm men sau mọc thành nhanh chóng bị tách khỏi tế bào mẹ, làm cho hình thái tế bào nấm men bị thay đổi [16] 26 Melzoch cộng (1994) khảo sát thay đổi hình thái tế bào nấm men cố định gel tiến hành cách quan sát kính hiển vi điện tử Kết khảo sát cho thấy tế bào nấm men cố định có hình dạng kích thước không đồng Điều cho thấy phát triển tế bào bị nhốt hạt gel phụ thuộc vào độ xốp cấu trúc mạng gel khả chiếm chỗ trống hạt gel tế bào nấm men Trong chất mang, tế bào nấm men có xu hướng kết tụ lại với [142] .26 Thay đổi thành phần lipid màng membrane [96, 138] 27 Thay đổi hàm lượng chất trao đổi trung gian fructose-1,6-diphosphate, glucsoe-6-phosphate 3-phosphoglycerate [73] 27 Hàm lượng polysaccharide tạo cấu trúc (glycogen, mannan, glucan, trehalose), chất dự trữ glycogen, DNA, RNA cao so với tế bào tự [38, 71, 73, 96, 113, 138, 150, 193] .27 Desimone cộng (2002) cho nấm men tiếp xúc với ethanol nồng độ 80% (v/v) nhiều khoảng thời gian khác Kết nghiên cứu cho thấy khả sống sót nấm men cố định cao nhiều so với nấm men tự Sau phút tiếp xúc với ethanol, nấm men tự bị tiêu diệt hoàn toàn, số lượng nấm men cố định tương đương với thời điểm ban đầu [53] 28 Nghiên cứu Krisch Szajáni (1997) cho thấy hàm lượng glucose 16% (v/v) có ảnh hưởng độc tế bào nấm men tự Khi nồng độ cồn đạt 20% nấm men tự không tồn Các tế bào nấm men nhốt gel alginate hấp phụ cellulose có khả sống sót cao nhiều so với nấm men tự do, 72 62% [117] .28 Holcberg Margalith (1981) cho hàm lượng glucose 40 50%w/w ức chế tế bào tự do, làm cho trình lên men không xảy ra, tế bào cố định lên men tốc độ chậm [91] .28 Sự có mặt chất mang bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng hàm lượng cồn cao ảnh hưởng áp suất thẩm thấu cao đường gây [12, 113, 117, 133, 150, 206] .29 Nấm men cố định tạo thành glycerol nhiều Glycerol có tác dụng làm cân oxy hóa khử nội bào nấm men cân NAD+/NADH hoạt động chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu áp lực thẩm thấu cao đường suốt trình lên men Nhiều tác giả cho hàm lượng đường tăng lượng glycerol tạo thành taêng [15, 43, 52, 60] 29 Nấm men cố định chứa lượng acid béo no cao so với nấm men tự do, nên làm tăng khả chịu nồng độ cồn cao Mức độ no acid béo tăng làm tăng khả chịu đựng ethanol Agudo (1992) nhận thấy v Luận văn tốt nghiệp giống Saccharomyces chịu cồn có số không no thấp so với chủng chịu cồn [53, 117, 150] 29 Naám men cố định có thay đổi khả vận chuyển chất qua màng, làm tăng khả giải phóng ethanol nội bào môi trường Nagodawithana Steinkraus (1976) cho khả chịu cồn tùy thuộc vào khả tế bào giải phóng ethanol nội bào môi trường [150, 163, 206] 29 Có hoạt tính enzyme ADH (là enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa acetaldehyde thành ethanol) cao hôn [59] 29 Tạo thành nhiều ester Do việc cố định tế bào nấm men làm thay đổi hoạt động enzyme acetyl-transferase theo hướng tích cực hơn, làm tăng trình tổng hợp ester [20, 56, 113, 131, 133, 135, 193, 208] 30 Tạo thành diacetyl [113] 30 Tạo thành acetaldehyde [193, 196, 208] 30 Tạo thành methanol hôn [196, 208] 30 Tạo thành acid dễ bay hôn [18, 196] 31 Tạo thành rượu bậc cao lên men nhiệt độ thấp [20, 193] 31 2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯU VANG 32 2.3.1 Ảnh hưởng hàm lượng đường .32 2.3.2 Ảnh hưởng pH 36 2.3.3 Ảnh hưởng hàm lượng SO2 38 Chống hóa nâu: dịch nho tiếp xúc với O2 không khí suốt trình chà ép, dịch nho phản ứng với O2 không khí bị oxy hóa Quá trình oxy hóa làm cho dịch nho bị sậm màu, dịch nho dần chuyển sang màu nâu Quá trình hóa nâu tăng tốc có mặt enzyme polyphenoloxidase dịch nho Loại enzyme nhạy với SO2 tự enzyme bị bất hoạt thêm SO2 vào dịch nho SO2 làm ổn định cầu disulfide enzyme Ngoài ra, SO2 có khả liên kết với acetaldehyde, chất làm cầu liên kết cho hợp chất phenolic, nhờ làm kìm hãm trình hoá nâu [59, 30] 38 Ức chế vi khuẩn nấm men dại: nấm men vang có khả chịu đựng tốt SO2 hoạt động nấm men dại vi khuẩn bị giảm đáng kể thêm vào lượng nhỏ SO2 Độ nhạy sulfite khác giống nấm men khác Kloeckera apiculata nhạy với hàm lượng SO2 tự nhỏ 5mg/L Nhưng Candida guilliermondii Zygosacccharomyces spp nhạy với hàm lượng SO2 gấp khoảng 10 laàn [59, 90, 171] 39 2.3.4 Ảnh hưởng tannin .40 2.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ 41 Làm giảm mật độ tế bào nấm men .42 Kéo dài pha lag, giống non-Saccharomyces dễ chiếm ưu so với Saccharomyces 42 Thu hẹp màng lipid, làm giảm khả vận chuyển hợp chất 42 Kéo dài thời gian lên men, làm tăng mối nguy xảy tượng kéo dài thời gian lên men qúa trình lên men kết thúc hàm lượng đường sót cao .42 Khi khaûo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến động học trình lên men rượu vi Luận văn tốt nghiệp vang sử dụng nấm men cố định DCM, Bardi Koutinas (1994) nhận thấy nhiệt độ lên men giảm từ 30 xuống 15oC, thời gian lên men rượu vang sử dụng nấm men cố định tăng 158%, nấm men tự tăng tới 331% Kết minh họa Hình 22 [17] 43 Bakoyianis cộng (1997) tiến hành cố nấm men chất mang kissiris, −alumina calcium alginate tiến hành lên men nhiệt độ khác 7, 13 27oC Trong tất trường hợp, tốc độ lên men tế bào cố định cao gấp – lần so với tế bào tự do, khác biệt tốc độ lên men tăng nhiệt độ giảm [14] .44 Bardi cộng (1996) nghiên cứu trình lên men rượu vang sử dụng nấm men cố định gluten nhiệt độ phòng nhiệt độ thấp Kết cho thấy tốc độ lên men nấm men cố định cao nhiều so với nấm men tự Khi nhiệt độ giảm từ 30 xuống 15oC, thời gian lên men nấm men cố định tăng 22%, đó, nấm men tự tăng 76% [18] 44 2.4 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT RƯU VANG 45 2.4.1 Dùng kỹ thuật cố định để khắc phục số vấn đề sản xuất rượu vang .45 Cung cấp thêm chất dinh dưỡng (ammonium phosphate, chất chiết naám men) [163] 48 Cấy lại nấm men [163] 48 Hấp phụ acid béo lên than hoạt tính [163] 48 2.4.2 Dùng kỹ thuật cố định số phương pháp lên men 48 M Iconomopoulou cộng (2002) nghiên cứu khả ứng dụng nấm men cố định sấy thăng hoa (FGB) công nghiệp nhận thấy chu kỳ 1, thời gian lên men suất lên men khác biệt so với nấm men tự (ffdc) chu kỳ 2, nấm men cố định cho suất lên men cao hẳn tốc độ lên men tăng lên đáng kể (Hình 24) [93] 48 Bardi cộng (1997) cố định nấm men loại chất mang DCM gluten để sử dụng cho trình lên men tónh nhiều chu kỳ nhiệt độ khác Kết cho thấy nấm men cố định DCM sử dụng 43 chu kỳ, đó, nấm men cố định gluten sử dụng 29 chu kỳ Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng nấm men cố định để tiến hành lên men hàm lượng ethyl acetate tạo thành cao gấp – lần so với nấm men tự do, sử dụng nấm men cố định DCM để lên men nhiệt độ thấp hàm lượng amyl alcohol thấp nhiều so với nấm men tự do, nhờ mà giảm độc tính cho sản phẩm rượu vang Như vậy, sử dụng nấm men cố định cải thiện hương vị tốt so với nấm men tự [20] 48 Kourkoutas cộng (2003) sử dụng nấm men cố định miếng mộc qua để lên men rượu vang theo phương pháp lên men tónh nhiều chu kỳ Và kết cho thấy trình lên men tiếp tục khoảng tháng mà không làm đáng kể hoạt tính nấm men Khi thực lên men nhiệt độ thấp (< 10oC) trình lên men rượu vang hoàn thành vòng ngày, ngắn nhiều so với phương pháp lên men truyền thống Còn lên men 0oC thời gian cần thiết khoảng 50 ngày Năng suất sinh tổng hợp ethanol cao lần so với trình lên men truyền thống Bên cạnh đó, hương vị sản phẩm cải thiện nhiều, đặc biệt nhiệt độ thấp [27] Như vậy, mộc qua vii Luận văn tốt nghiệp chứng tỏ chất mang thích hợp cho trình sản xuất rượu vang, đặc biệt nhiệt độ thấp Kết nghiên cứu Kourkoutas cộng (2001) cố định miếng táo cho kết tương tự, với thời gian sử dụng khoảng tháng mà không làm hoạt tính [110] 49 Tsakiris cộng (2004) tiến hành lên men rượu vang trắng sử dụng nấm men cố định nho khô theo phương pháp lên men tónh nhiều chu kỳ kết cho thấy rượu vang tạo thành có hàm lượng acid dễ bay hơi, methanol acetaldehyde thấp, nấm men cố định có độ bền sinh học khoảng tháng [196] Một nghiên cứu khác Tsakiris cộng (2004) cho thấy hệ thống lên men sử dụng nấm men cố định nho khô có độ bền vận hành cao, tiến hành trình lên men tónh nhiều chu kỳ khoảng năm phải thay nấm men cố định [197] 49 Bakoyianis cộng (1997) tiến hành lên men liên tục rượu vang nhiệt độ thấp nhiệt độ phòng sử dụng chất mang kissiris, − alumina calcium alginate Kết cho thấy rằng, sử dụng nấm men cố định suất sinh tổng hợp cồn lên men theo phương pháp liên tục cao so với phương pháp lên men tónh (bảng 2.11) [14] .50 Kourkoutas cộng (2002) thực trình lên men rượu vang liên tục sử dụng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae ưa lạnh cố định miếng táo Kết nghiên cứu cho thấy suất lên men theo phương pháp cao nhiều so với phương pháp lên men tónh truyền thống Năng suất lên men cồn 5oC với suất lên men cồn 22 – 25oC theo phương pháp truyền thống Bình lên men vận hành liên tục vòng 95 ngày mà không làm giảm suất tạo cồn Đồng thời, hàm lượng rượu bậc cao acetaldehyde rượu vang thấp so với rượu vang lên men theo phương pháp lên men tónh truyền thống (bảng 2.12) Điều chứng tỏ chất lượng rượu vang cải thiện [112] Một nghiên cứu khác Kourkoutas cộng (2005) sử dụng chất mang miếng táo, mộc qua lê cho kết tương tự [107] .50 Ogbonna cộng (1989) tiến hành trình lên men rượu vang theo phương pháp liên tục thiết bị phản ứng sinh học nhiều cấp (multistage bioreactor) sử dụng đóa sinh học (bioplate) làm tác nhân lên men Các đóa sinh học nấm men cố định đóa thủy tinh gia công tạo mặt lưới Kết nghiên cứu cho thấy trình lên men liên tục sử dụng nấm men cố định đóa thủy tinh có tính ổn định cao, bền thời gian dài sử dụng mà có khả tạo sản phẩm có chất lượng không thua sản phẩm tạo theo phương pháp lên men truyền thống [152] 50 2.4.3 Dùng kỹ thuật cố định sản xuất số loại rượu vang 51 Làm lạnh để giảm tốc độ lên men 51 Taùch dịch lên men khỏi nấm men (bằng cách xử lý với bentonite lọc) 51 Thêm SO2 sau loïc xong 51 Sử dụng nấm men cố định không gây thay đổi đáng kể trình lên men 52 Teá bào giải phóng không ảnh hưởng đến độ rượu vang 52 Các thành phần ethanol, acid hữu cơ, nitơ tổng rượu bậc cao khác biệt đáng kể so sánh rượu vang tạo nấm men cố định rượu vang tạo nấm men tự 52 viii Luận văn tốt nghiệp Chương 3: NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54 3.1 NGUYÊN LIỆU .54 3.1.1 Nho 54 3.1.2 Naám men .55 3.1.3 Alginate 55 Chế phẩm dạng rắn, độ ẩm 20,05% 55 Độ nhớt dung dịch alginate 2% 25oC 423,6cP 55 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55 3.2.1 Mục đích nội dung nghiên cứu 55 3.2.2 Phương pháp cố định nấm men gel alginate 57 Nhân giống 57 Nấm men trước sử dụng cần nhân giống hai cấp: 57 Ly taâm 57 Sau nhân giống, nấm men đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 40C, thời gian 30 phút, để tách sinh khối 57 Pha loaõng .57 Dùng nước vô khuẩn pha loãng sinh khối nấm men ly tâm để đạt dung dịch huyền phù nấm men mật độ 50.106 tế bào/mL 57 Tạo dung dịch alginate 57 Dùng nước cất hòa tan alginate để thu dung dịch có nồng độ alginate 4% 58 Hấp tiệt trùng 58 Vô khuẩn dung dịch alginate 1210C, 20 phút 58 Làm nguội 58 Làm nguội dung dịch alginate sau hấp tiệt trùng đến nhiệt độ thường 58 Trộn58 Trộn dịch huyền phù tế bào nấm men 50.106 tế bào/mL với dung dịch alginate 4% theo tỉ lệ 1:1 (v/v) để tạo hỗn hợp đồng 58 Taïo haït 58 Nhỏ giọt hỗn hợp alginate natri-nấm men vào dung dịch CaCl2 2% Đường kính ống nhỏ giọt 3mm, lỗ đặt cách mặt dung dịch CaCl2 2cm, hạt tạo thành có đường kính khoảng 4÷5mm Dung dịch CaCl2 khuấy đảo liên tục bàn khuấy từ với tốc độ 100÷200 vòng/phút Mỗi giọt hỗn hợp alginate nấm men rơi xuống dung dịch tạo thành hạt nấm men cố định 58 Ngâm hạt 58 Hạt nấm men cố định tạo ngâm dung dịch CaCl2 2% giờ, tốc độ khuấy đảo hạt giữ từ 100÷200 vòng/phút Ta phải thay dung dịch CaCl2 2% sau ngâm để nồng độ ion Ca2+ dung dịch không bị giảm xuống thấp 58 Rửa hạt .58 Chắt bỏ dung dịch CaCl2, rửa lại hạt gel nước cất dịch lên men để muối CaCl2 không bám bề mặt hạt gel Chúng tiến hành rửa hạt gel lần nước cất lần dịch lên men cho tất thí nghiệm 58 Hạt sau tạo thành phải tiến hành lên men Nếu muốn bảo quản hạt cho hạt gel chứa nấm men cố định vào dung dịch CaCl2 0,4%, bảo quản 5oC vòng tối đa 24h 58 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường ban đầu đến động học trình lên men rượu vang nho sử dụng nấm men cố định gel alginate .58 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến động học ix Chương 4: Kết bàn luận Thêm vào đó, khảo sát tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình nấm men cố định nấm men tự suốt trình lên men, nhận thấy tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình nấm men cố định cao hẳn so với nấm men tự do, gấp khoảng 1,5 – lần Khi hàm lượng đường cao (320 – 360g/L) chênh lệch lớn nhất) Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu trước Galazzo cộng sự, 1987; Galazzo Bailey, 1989, 1990; Doran cộng sự, 1985; Parascandola cộng sự, 1992; Ciani Ferraro, 1996; Balli cộng sự, 2003; Mallouchos cộng sự, 2003,… Parascandola cộng (1992) nghiên cứu nấm men cố định gel gelatin sản xuất rượu vang kết luận tốc độ sinh tổng hợp cồn nấm men cố định cao so với nấm men tự mật độ tế bào nấm men thấp [154] Bảng 4.26: nh hưởng hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình nấm men trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Hàm lượng đường ban đầu (g/L) 200 240 280 320 360 Tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình KP (g/L/h) Nấm men cố định Nấm men tự 1,005 ± 0,038e 0,770 ± 0,026c 1,125 ± 0,026g 0,746 ± 0,023c 1,050 ± 0,022f 0,750 ± 0,010c 1,099 ± 0,017fg 0,598 ± 0,019b 0,933 ± 0,014d 0,526 ± 0,035a Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác nghóa khác có nghóa (P < 0,05) Trang 82 Chương 4: Kết bàn luận Hình 4.41: nh hưởng hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Tuy nhiên, đánh giá hiệu suất sinh tổng hợp cồn (số mol ethanol tạo thành mol glucose) lại thấy khoảng nồng độ 200 – 280g/L, hiệu suất sinh tổng hợp cồn nấm men cố định nấm men tự khác biệt đáng kể (P < 0,05) (Hình 41, bảng 4.12) Nhưng hàm lượng đường ban đầu lên đến 320 – 360g/L hiệu suất sinh tổng hợp cồn nấm men cố định thấp so với nấm men tự Điều cho thấy nấm men cố định chiếm ưu tốc độ sử dụng đường tốc độ sinh tổng hợp cồn hiệu suất sinh hợp cồn nấm men cố định lại không cao Cùng với kết khảo sát động học trình sinh trưởng nấm men, nhận thấy nấm men cố định sử dụng đường nhiều chúng chuyển hóa phần thành cồn tăng mật độ tế bào Kết tương tự kết Doran Bailey (1985) Theo chúng tôi, nguyên nhân tế bào nấm men cố định sử dụng nhiều đường để chuyển hóa thành hợp chất trao đổi trung gian chu trình đường phân, tạo thành nhiều polysaccharide cấu trúc polysaccharide dự trữ, tạo thành nhiều glycerol acid béo no, làm tăng khả trao đổi chất khả chịu đựng áp suất thẩm thấu môi trường xung quanh Ngoài ra, theo có nguyên nhân khác tế bào cố định trì pha cân kết thúc trình lên men, Trang 83 Chương 4: Kết bàn luận mật độ tế bào tự lại giảm nhanh chóng, tế bào cố định cần sử dụng lượng đường định để trì ổn định này, nghóa trì tốc độ sinh sản với tốc độ chết tế bào Trang 84 Chương 4: Kết bàn luận Bảng 4.27: nh hưởng hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Hàm lượng đường ban đầu (g/L) 200 240 280 320 360 Hiệu suất sinh tổng hợp cồn η (mol glucose/ mol ethanol) Nấm men cố định Nấm men tự 1,58 ± 0,07cd 1,65 ± 0,07cde 1,63 ± 0,09cd 1,65 ± 0,06cde 1,57 ± 0,05c 1,62 ± 0,09cd 1,43 ± 0,11b 1,77 ± 0,08e 1,29 ± 0,06a 1,71 ± 0,09de Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác biểu thị khác có nghóa (P < 0,5) 4.1.3.2 Quá trình chuyển hóa acid hữu Acid đóng vai trò quan trọng rượu vang thành phần giúp ổn định rượu vang bảo vệ tính chất cảm quan rượu vang Quá trình chuyển hóa acid hữu đánh giá thông qua thay đổi pH, hàm lượng acid tổng hàm lượng acid dễ bay (hình 4.15, hình 4.16, hình 4.17) Error: Reference source not found Hình 4.42: Sự thay đổi pH trong trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi khoảng 200 – 360g/L) Kết cho thấy 36h đầu trình lên men, pH giảm nhanh, sau giảm chậm 24h (trừ trường hợp nấm men cố định ứng với hàm lượng đường ban đầu 320 360g/L pH giảm chậm vòng 48h tiếp theo) tăng chậm kết thúc trình lên men Trong đó, hàm lượng acid tổng tăng dần 60h đầu trình lên men (trừ trường hợp lên men dịch nho với hàm lượng đường ban đầu 320 360g/L thời gian dài hơn), sau giảm nhẹ giữ ổn định kết thúc trình lên men Điều chứng tỏ giai đoạn đầu, nấm men tổng hợp thêm acid hữu Error: Reference source not found Hình 4.43: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi khoảng 200 – 360g/L) Lamikanra (1997) cho bắt đầu trình lên men, acid tartaric acid malic chiếm ưu Nhưng sau đó, hàm lượng acid tartaric acid malic có xu hướng giảm dần Đó acid tartaric dễ dàng kết hợp với potassium calcium để tạo thành hợp chất potassium bitartrate calcium tartrate Các hợp chất kết tủa dịch nho trình lên men Ngoài ra, acid tartaric chuyển hóa thành acid lactic acid acetic hoạt động vi khuẩn lactic Còn acid malic giảm chuyển hóa vi khuẩn dịch lên men Trong đó, hàm lượng acid succinic tăng dần theo thời gian [59, 118] Như vậy, hàm lượng acid tổng tăng giai đoạn đầu trình lên men độ tăng acid succinic đủ lớn để bù lại độ giảm acid tartaric acid malic Acid succinic tạo chủ yếu từ glyoxylate thường sản phẩm trình sinh trưởng nấm men Khoảng 10 – 12% đường Trang 85 Chương 4: Kết bàn luận chuyển hóa thành sinh khối nấm men suốt trình lên men 0,3% số chuyển thành acid succinic Quá trình tạo thành acid succinic diễn liên tục tất đường lên men sử dụng hết [118] Kết thí nghiệm cho thấy rằng, suốt trình lên men, hàm lượng đường tăng hàm lượng acid tổng acid dễ bay tăng Hiện tượng giải thích do, hàm lượng đường tăng nấm men việc sử dụng đường để chuyển hóa thành cồn sử dụng đường để chuyển hóa thành acid acetic Bên cạnh đó, có nhiều đường sót môi trường nên loài vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa thành acid lactic acid acetic Error: Reference source not found Hình 4.44: Sự thay đổi hàm lượng acid dễ bay trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi khoảng 200 – 360g/L) Kết thí nghiệm cho thấy, pH thấp hàm lượng acid tổng dịch lên men nấm men cố định thấp so với trường hợp sử dụng nấm men tự Hiện tượng co thể dịch lên men nấm men tự có chứa nhiều acid không phân ly so với dịch lên men nấm men cố định Cũng tương tự trên, hàm lượng acid dễ bay tạo dịch lên men nấm men cố định thấp so với nấm men tự Nguyên nhân do: − Nấm men cố định có khả sử dụng đường tốt so với nấm men tự nên hàm lượng đường sót dịch lên men thấp, nấm men vi khuẩn có khả sử dụng đường để chuyển hóa thành loại acid dễ bay (acid acetic acid dễ bay chiếm ưu thế) − Quá trình cố định ảnh hưởng đến hình thái hoạt động trao đổi chất nấm men nên làm giảm khả chuyển hóa đường thành acid acetic nấm men Tóm lại, qua việc khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường đến chuyển hóa acid hữu suốt trình lên men, nhận thấy rằng: − Dịch lên men nấm men cố định có pH thấp so với dịch lên men nấm men tự Mà biết, rượu vang pH thấp có độ bền sinh học độ bền hóa lý cao rượu vang pH cao, đồng thời cường độ màu độ bền màu cao [59] Khi pH thấp, SO2 dạng tự nhiều hơn, mà khả ức chế vi khuẩn nấm men dại tốt − Dịch lên men nấm men cố định có hàm lượng acid dễ bay thấp so với nấm men tự Mà biết, acid dễ bay hợp chất không mong muốn sản xuất rượu vang Dựa quan điểm cho nấm men cố định tạo rượu vang có chất lượng tốt so với nấm men tự Kết giống với kết nghiên cứu nhiều tác giả khác Bardi cộng (1996), Tsakiris cộng (2004),… [18, 196] 4.1.4 Kết luận chung Qua kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường đến động học trình lên men sản xuất rượu vang sử dụng nấm men cố định gel alginate, có số kết kuận sau − Mật độ tế bào cực đại tốc độ sinh trưởng riêng cực đại tế bào cố định thấp so với tế bào tự Trang 86 Chương 4: Kết bàn luận − Tốc độ sử dụng đường tốc độ sinh tổng hợp cồn nấm men cố định cao so với nấm men tự hiệu suất sinh tổng hợp cồn không cao Nấm men cố định đặc biệt chiếm ưu so với nấm men tự dịch nho có hàm lượng đường ban đầu cao (320 – 360g/L) − Khả sử dụng nitơ ammonium nitơ hữu tế bào cố định cao so với tế bào tự − pH acid tổng dịch lên men nấm men cố định thấp hơn, làm tăng độ ổn định mặt hóa lý sinh học cho sản phẩm − Hàm lượng acid dễ bay tạo thành nấm men cố định thấp hơn, chất lượng sản phẩm cải thiện Trang 87 Chương 4: Kết bàn luận 4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯNG TANNIN ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE Tannin hợp chất polyphenol phổ biến dịch nho đỏ Đã có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng tannin đến màu sắc mùi vị rượu vang [29, 31, 51, 64, 80, 99, 141, 157, 165, 174, 182] Tuy nhiên ảnh hưởng tannin đến trình lên men rượu vang chưa nghiên cứu rõ ràng Vì thế, nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ phần vấn đề Chúng khảo sát động học trình lên men cho nấm men cố định lẫn nấm men tự để đối chiếu so sánh cách rõ ràng Chúng điều chỉnh hàm lượng tannin dịch nho đến giá trị 1,8g/L; 2,8g/L; 3,8g/L; 9,8g/L 17,8g/L sau bổ sung vào dịch nho lượng acid tannic thích hợp 4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng tannin đến động học trình sinh trưởng nấm men Kết khảo sát động học trình sinh trưởng nấm men trình bày hình 4.18, hình 4.19, hình 4.20 bảng 4.13 Kết cho thấy hàm lượng tannin ban đầu tăng mật độ tế bào giảm tốc độ sinh trưởng riêng, nhìn chung, giảm − Đối với nấm men cố định, hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 17,8g/L mật độ tế bào nấm men cực đại giảm từ 223.106 tế bào xuống 190,78.106 tế bào Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại giảm từ 0,340 xuống 0,371 h-1 − Đối với nấm men tự do, hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 17,8g/L mật độ tế bào nấm men cực đại giảm từ 240,63.10 tế bào xuống 178,7.10 tế bào Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại giảm từ 0,682 xuống 0,052 h-1 Qua đó, thấy tannin có ảnh hưởng lớn đến khả sinh trưởng nấm men, làm kìm hãm sinh sản nấm men Một số tác giả đưa giả thuyết khác để giải thích cho tượng Tuy nhiên, chế cụ thể chưa nghiên cứu rõ ràng: − Yajima Yokotsuka (2001) cho tannin hấp phụ lên bề mặt nấm men, làm ảnh hưởng đến khả vận chuyển chất qua màng [208] − Wauters cộng (2001b) cho acid tannic ảnh hưởng đến trình tổng hợp chuỗi hô hấp (functional respiratory chain), dẫn đến tượng thiếu hụt sắt, làm giảm tốc độ sinh trưởng nấm men [204] − Một giả thuyết khác acid tannic ảnh hưởng đến trình tổng hợp acid béo không no và/hoặc sterol, làm giảm khả hấp thu O nấm men, tốc độ sinh trưởng nấm men giảm Hoặc acid tannic liên kết mạnh với thành phần (đây lipid màng) nên làm giảm khả hấp thu O (Wauters cộng sự, 2001a,2001b; Mazauric Salmon, 2005) [95, 203, 204] Error: Reference source not found Hình 4.45: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 17,8g/L) Trang 88 Chương 4: Kết bàn luận Soto Huber (1968) nghiên cứu ảnh hưởng tannin đến trình lên men phụ rượu champagne kết luận hàm lượng tannin cao ức chế sinh trưởng nấm men Mật độ tế bào cực đại giảm khoảng 3,6; 11,7; 22,5 29,7% thêm tannin với lượng 0,5; 1,7; 2,9 4,1g/L vào rượu vang có chứa 0,3g/L tannin [50] Bên cạnh đó, nhận thấy hàm lượng tannin ban đầu tăng từ 1,8 – 2,8g/L mật độ tế bào nấm men tự cực đại cao nấm men cố định tốc độ sinh trưởng riêng cực đại tế bào tự cao Nhưng hàm lượng tannin nằm khoảng 9,8 – 17,8g/L mật độ tế bào tự tốc độ sinh trưởng riêng tế bào tự thấp so với tế bào cố định Còn hàm lượng tannin 3,8g/L nấm men tự có tốc độ sinh trưởng riêng cực đại lớn mật độ tế bào cực đại lại thấp Điều chứng tỏ hàm lượng tannin cao ức chế sinh trưởng nấm men tự nhiều so với nấm men cố định Theo chúng tôi, nguyên nhân do: tannin đại phân tử nên khả khuếch tán qua gel alginate hạn chế Vì thế, tế bào nấm men cố định tiếp xúc với tannin nên bị ảnh hưởng Qua kết khảo sát ANOVA (bảng 4.13), thấy hàm lượng tannin ban đầu tăng từ 1,8 – 2,8g/L tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax nấm men cố định nấm men tự không bị ảnh hưởng (P < 0,05) Còn hàm lượng tannin tăng từ 2,8 – 3,8g/L µmax tế bào cố định giảm chậm, khoảng lần; đó, µmax tế bào tự giảm nhanh, khoảng lần Sau đó, tannin tăng từ 3,8 - 9,8g/L µmax giảm chậm lại, tannin tăng từ 9,8 lên tới 17,8g/L µmax giảm khoảng nửa Qua đó, thấy nấm men tự thực bị ức chế mạnh hàm lượng tannin 3,8g/L Nấm men cố định bắt đầu bị ức chế hàm lượng tannin ban đầu đạt đến giá trị ức chế so với nấm men tự Error: Reference source not found Hình 4.46: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng nấm men trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 9,8g/L) Quan sát thời gian để tốc độ sinh trưởng riêng đạt đến giá trị cực đại tế bào nấm men tự tế bào nấm men cố định, nhận thấy hàm lượng tannin có ảnh hưởng rõ ràng đến sinh trưởng nấm men Khi hàm lượng tannin nằm khoảng 1,8 – 2,8g/L thời gian khoảng 4h, hàm lượng tannin nằm khoảng 3,8 – 9,8g/L thời gian khoảng 8h Còn tăng lên đến 17,8g/L thời gian 12h Như vậy, hàm lượng tannin cao khuếch tán chất hấp thu O diễn chậm, đồng thời ion sắt thiếu nấm men cần thời gian lâu để đạt đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại Cũng tương tự phần 4.1 khảo sát, sau đạt đến mật độ cực đại, mật độ tế bào nấm men cố định giảm chậm mật độ tế bào nấm men tự giảm nhanh Nguyên nhân nấm men tự bị ức chế hàm lượng cồn có môi trường nhiều so với nấm men cố định Error: Reference source not found Hình 4.47: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng nấm men trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate hàm lượng tannin ban đầu 17,8g/L Trang 89 Chương 4: Kết bàn luận Bảng 4.28: nh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Hàm lượng tannin ban đầu (g/L) 1,8 2,8 3,8 9,8 17,8 Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax (h-1) Nấm men cố định Nấm men tự 0,340 ± 0,008f 0,682 ± 0,013g 0,338 ± 0,009f 0,680 ± 0,014g 0,160 ± 0,012e 0,132 ± 0,006c 0,142 ± 0,013d 0,130 ± 0,011cd 0,071 ± 0,009b 0,052 ± 0,006a Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác biểu thị khác có nghóa (P < 0,05) 4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng tannin đến động học trình sử dụng chất trình lên men Error: Reference source not found Hình 4.48: Sự thay đổi nồng độ chất khô trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 17,8g/L) Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến trình sử dụng chất khô lên men vang trình bày hình 4.21 Và tương tự khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường, khảo sát khả sử dụng chất nấm men cố định thông qua trình sử dụng đường trình sử dụng nitơ (nitơ amin tự nitơ ammonium) Quan sát thay đổi nồng độ chất khô suốt trình lên men (hình 4.21), nhận thấy hàm lượng tannin ban đầu tăng nồng độ chất khô lại dịch lên men nhiều Đồng thời, nồng độ chất khô dịch lên men nấm men cố định nhỏ nấm men tự 4.2.2.1 Quá trình sử dụng đường Qua kết thay đổi hàm lượng đường suốt trình lên men (hình 4.22), nhận thấy mối tương quan tốc độ sinh trường riêng mật độ tế bào nấm men cố định tế bào nấm men tự thay đổi hàm lượng tannin thay đổi, trình lên men, khả sử dụng đường nấm men cố định tốt so với nấm men tự Hàm lượng đường sót lại môi trường dịch lên men nấm men cố định thấp so với nấm men tự (bảng 4.14) Error: Reference source not found Hình 4.49: Sự thay đổi hàm lượng đường trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 17,8g/L) Tương tự vậy, nhìn chung, hàm lượng tannin tăng tốc độ sử dụng đường cực đại giảm (hình 4.23, bảng 4.15) tốc độ sử dụng đường cực đại nấm men cố định lớn so với nấm men tự Khoảng cách lớn hàm lượng tannin nằm khoảng 1,8 – 9,8g/L Tuy nhiên, Trang 90 Chương 4: Kết bàn luận hàm lượng tannin ban đầu 17,8g/L khác biệt nấm men cố định nấm men tự (P < 0,05) Điều cho thấy rằng, hàm lượng tannin cao, tốc độ sử dụng đường nấm men cố định bị ức chế mạnh Và thấy thời gian cần thiết để tốc độ sử dụng đường nấm men cố định đạt cực đại luôn ngắn so với nấm men tự Điều cho thấy nấm men cố định có khả sử dụng đường nhanh Khi hàm lượng tannin ban đầu nằm khoảng 1,8 – 9,8g/L, thời gian cần thiết để nấm men cố định đạt đến tốc độ sử dụng đường cực đại khoảng 12h Chỉ hàm lượng tannin tăng lên đến 17,8g/L thời gian dài nhiều, lên tới 180h Trong nấm men tự do, hàm lượng tannin ban đầu 9,8g/L thời gian kéo dài đến 108h Còn hàm lượng tannin ban đầu là17,8g/L thời gian là204h Bảng 4.29: nh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến hàm lượng đường sót trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Hàm lượng tannin ban đầu (g/L) 1,8 2,8 3,8 9,8 17,8 Hàm lượng đường sót (g/L) Nấm men cố định Nấm men tự 4,02 ± 0,46a 5,75 ± 0,66bc 4,31 ± 0,60a 6,01 ± 0,48cd 4,51 ± 0,50ab 7,03 ± 0,96d 7,20 ± 0,72d 9,70 ± 0,61e 10,00 ± 1,32e 17,40 ± 0,53f Caùc giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác biểu thị khác có nghóa (P < 0,5) Error: Reference source not found Hình 4.50: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 17,8g/L) Bảng 4.30: nh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Hàm lượng tannin ban đầu (g/L) 1,8 2,8 3,8 9,8 17,8 Tốc độ sử dụng đường cực đại gSmax (g/L/h) Nấm men cố định Nấm men tự 4,08 ± 0,11h 3,34 ± 0,09e 3,80 ± 0,07g 3,28 ± 0,07e 3,50 ± 0,10f 3,01 ± 0,07d 2,51 ± 0,10c 1,60 ± 0,04b 1,45 ± 0,09a 1,40 ± 0,09a Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác biểu thị khác có nghóa (P < 0,05) Mặc dù tốc độ sử dụng đường nấm men cố định không cao đáng kể so với nấm men tự tốc độ sử dụng đường riêng nấm men cố định lại chiếm ưu hẳn (hình 4.24, bảng 4.16) Qua kết khảo sát, thấy tốc độ sử dụng đường riêng cưc đại nấm men cố định cao gấp – lần so với nấm men tự Hàm lượng tannin khoảng 1,8 – 9,8g/L không ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ sử dụng đường riêng cực đại nấm men cố định Error: Reference source not found Trang 91 Chương 4: Kết bàn luận Hình 4.51: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 17,8g/L) Bảng 4.31: nh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường riêng cực đại (chỉ xét cho giá trị cực đại đầu tiên) trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Hàm lượng tannin ban đầu (g/L) 1,8 2,8 3,8 9,8 17,8 Tốc độ sử dụng đường riêng cực đại γPmax (g/h/1012 tế bào) Nấm men cố định Nấm men tự 47,0 ± 1,8d 17,1 ± 1,7b 51,7 ± 2,3e 17,9 ± 2,0b 49,8 ± 2,4de 24,8 ± 2,6c 48,0 ± 1,8d 12,0 ± 0,9a 17,7 ± 1,5b 10,8 ± 1,6a Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác biểu thị khác có nghóa (P < 0,5) Tất điều cho thấy khả sử dụng đường nấm men cố định nhanh triệt để so với nấm men tự Theo chúng tôi, nguyên nhân khả trao đổi chất tế bào nấm men tự bị ảnh hưởng nhiều hấp phụ tannin lên bề mặt, làm cản trở vận chuyển glucose vào bên tế bào Đồng thời, tiếp xúc trực tiếp với tế bào nấm men nên tannin ảnh hưởng mạnh đến trình tổng hợp acid béo không no và/hoặc sterol nấm men tự nên làm ảnh hưởng đến khả vận chuyển chất qua màng Hàm lượng tannin nhiều ức chế nhiều Nấm men cố định bị ức chế hơn, phần 4.2.1 giải thích, nấm men cố định bảo vệ chất mang Bên cạnh đó, nhận thấy rằng, nhìn chung, hàm lượng tannin tăng hàm lượng đường sót tăng Có nghóa nấm men khả sử dụng hết hàm lượng đường có môi trường Nguyên nhân giải thích vận chuyển chất qua màng bị cản trở Do hàm lượng tannin tăng hàm lượng đường sót tăng, nghóa ứng với giá trị tannin độ lên men khác Tuy nhiên, khác biệt không nhiều, để thuận tiện cho việc so sánh nấm men tự nấm men cố định so sánh ảnh hưởng hàm lượng tannin đến tốc độ sử đường, chọn độ lên men thống cho tất giá trị 92,75% Thời gian lên men ứng với độ lên men trình bày bảng 4.17 Kết cho thấy thời gian lên men nấm men cố định ngắn so với nấm men tự Sự khác biệt lớn hàm lượng tannin ban đầu cao Điều cho thấy nấm men cố định chiếm ưu thời gian lên men hàm lượng tannin ban đầu cao Khi hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 2,8g/L không làm ảnh hưởng đến thời gian lên men nấm men cố định nấm men tự (P < 0,05) Dựa vào thời gian lên men xác định được, tiến hành khảo sát ảnh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình toàn trình lên men Kết khảo sát trình bày hình 4.25 vàbảng 4.17 Kết cho thấy tốc độ sử dụng đường trung bình nấm men cố định cao so với nấm men tự hàm tannin tăng từ 1,8 – Trang 92 Chương 4: Kết bàn luận 2,8g/L không làm ảnh hưởng đến tốc độ sử dụng đường trung bình nấm men cố định nấm men tự Khi hàm lượng tannin tăng cao tốc độ sử dụng đường trung bình nấm men cố định nấm men tự giảm Tóm lại, qua việc khảo sát ảnh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến trình sử dụng đường, nhận thấy rằng, mặt, nấm men cố định tốt so với nấm men tự do: − Hàm lượng đường sót thấp − Tốc độ sử dụng đường cực đại cao thời gian để tốc độ sử dụng đường đạt đến giá trị cực đại ngắn − Tốc độ sử dụng đường riêng cao hẳn − Tốc độ sử dụng đường trung bình cao − Thời gian lên men ngắn Bảng 4.32: nh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến thời gian lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Hàm lượng tannin ban đầu (g/L) 1,8 2,8 3,8 9,8 17,8 Thời gian lên men (h) Nấm men cố định Nấm men tự 76,8 ± 2,0a 88,8 ± 2,4c 79,2 ± 3,3a 91,2 ± 2,4c 84,0 ± 2,6b 102,0 ± 4,0d 134,4 ± 3,8e 175,2 ± 5,8f 218,4 ± 6,9g 276,0 ± 8,6h Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác biểu thị khác có nghóa (P < 0,05) Trang 93 Chương 4: Kết bàn luận Hình 4.52: Ảnh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Bảng 4.33: nh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Tốc độ sử dụng đường trung bình (g/L/h) Hàm lượng tannin ban đầu (g/L) Nấm men cố định Nấm men tự 1,8 3,05 ± 0,09h 2,64 ± 0,07fg 2,8 2,95 ± 0,10h 2,57 ± 0,09f 3,8 2,79 ± 0,12g 2,29 ± 0,12e 9,8 1,74 ± 0,10d 1,34 ± 0,09c 17,8 1,07 ± 0.07b 0,85 ± 0,08a Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác biểu thị khác có nghóa (P < 0,05) 4.2.2.2 Quá trình sử dụng nitơ (nitơ amin nitơ ammonium) Kết khảo sát thay đổi hàm lượng nitơ amin nitơ ammonium suốt trình lên men trình bày hình 4.26 hình 4.27 Error: Reference source not found Trang 94 Chương 4: Kết bàn luận Hình 4.53: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin tự trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 17,8g/L) Cũng tương tự khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường, phần thấy khả sử dụng nitơ bao gồm nitơ hữu nitơ ammonium nấm men cố định tốt so với nấm men tự quy luật biến đổi hàm lượng nitơ gần khác biệt Nitơ ammonium sử dụng gần triệt để, nitơ amin lại phần có xu hướng tăng lên vào cuối giai đoạn lên men Khi hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 3,8g/L khả sử dụng nitơ nấm men tự nấm men cố định không thay đổi đáng kể, hàm lượng tannin tăng đến 9,8 – 17,8g/L khả sử dụng nitơ amin giảm hẳn Còn khả sử dụng nitơ ammonium giảm hẳn hàm lượng tannin 17,8g/L Hiện tượng dễ dàng giải thích vận chuyển chất vào bên tế bào bị ức chế hàm lượng tannin ban đầu cao Tuy nhiên, so với khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường, nhận thấy số điểm khác biệt Khi nấm men tự chịu áp lực thẩm thấu cao tạo hàm lượng đường môi trường lên men 360g/L hàm lượng nitơ amin tối thiểu lại môi trường 74,63mg/L (hình 4.8) Tương tự vậy, chịu ức chế hàm lượng tannin cao 17,8g/L lượng nitơ amin tối thiểu lại môi trường lên men nấm men tự 76,59mg/L (hình 4.26) Hai giá trị gần khác biệt Tuy nhiên, thời gian để đạt hai giá trị tối thiểu lại khác nhiều Trường hợp đầu 84h, trường hợp sau 252h Cũng ứng với hàm lượng đường 360g/L hàm lượng tannin 17,8g/L hàm lượng nitơ amin tối thiểu thời gian để đạt đến giá trị nấm men cố định là: 50,36mg/L; 84h 74,53mg/L; 228h Error: Reference source not found Hình 4.54: Sự thay đổi hàm lượng nitơ ammonium trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 17,8g/L) Cũng tương tự, so sánh khả sử dụng nitơ ammonium nấm men cố định nấm men tự ứng với đường 360g/L tannin 17,8g/L, nhận thấy độ dốc đồ thị nitơ ammonium tannin nhỏ so với đường, nghóa trường hợp tannin, nấm men sử dụng nitơ ammonium chậm Những điều cho thấy rằng, không đường, tannin ức chế mạnh khả sử dụng nitơ amin nấm men, kể nấm men tự lẫn nấm men cố định Đó tannin ức chế mạnh sinh trưởng nấm men, trình bày phần 4.2.1 4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng tannin đến động học trình tạo sản phẩm Trong nghiên cứu này, khảo sát động học trình tạo sản phẩm thông trình sinh tổng hợp cồn trình chuyển hóa acid hữu Trang 95 Chương 4: Kết bàn luận 4.2.3.1 Quá trình sinh tổng hợp cồn Chúng nhận thấy rằng, hàm lượng tannin tăng hàm lượng cồn đạt dịch lên men thay đổi đáng kể (hình 4.28), tốc độ sinh tổng hợp cồn bị ảnh hưởng đáng kể (Hình 4.29 bảng 4.19) Nhìn chung, tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại giảm hàm lượng tannin tăng Nguyên nhân tannin làm ảnh hưởng đến trình vận chuyển chất vào bên tế bào nên đồng thời làm ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp cồn Bên cạnh đó, tannin ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp acid béo không no và/hoặc sterol, có nghóa ảnh hưởng đến màng membrane, nên đồng thời làm ảnh hưởng đến trình vận chuyển cồn khỏi nội bào Error: Reference source not found Hình 4.55: Sự thay đổi hàm lượng cồn trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 17,8g/L) Khi hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 2,8g/L khác biệt tốc độ sinh tổng hợp cồn tế bào nấm men cố định so với tế bào nấm men tự (P < 0,05) Chỉ hàm lượng tannin tăng đến 3,8 – 17,8g/L có khác biệt độ chênh lệch không lớn Đặc biệt, thấy hàm lượng tannin ban đầu 17,8g/L thời gian cần thiết để tốc độ sinh tổng hợp cồn đạt đến giá trị cực đại dài so với hàm lượng tannin ban đầu nhỏ hơn, điều lần cho thấy hàm lượng tannin ban đầu cao ức chế mạnh khả sinh tổng hợp cồn nấm men Hình 4.33 bảng 4.20 cho thấy tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng nấm men cố định luôn cao so với nấm men tự Đặc biệt, giá trị hàm lượng tannin ban đầu thấp (1,8 – 3,8g/L) khác biệt tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng nấm men tự nấm men cố định lớn, hàm lượng tannin ban đầu này, mật độ tế bào nấm men cố định thấp tốc độ sinh tổng hợp cồn lại cao Error: Reference source not found Hình 4.56: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate hàm lượng tannin ban đầu thay đổi khoảng 1,8 – 17,8g/L Bảng 4.34: nh hưởng hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự nấm men cố định gel alginate Hàm lượng tannin ban đầu (g/L) 1,8 2,8 3,8 9,8 17,8 Tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại gPmax (g/L/h) Nấm men cố định Nấm men tự 1,76 ± 0,05h 1,74 ± 0,05h 1,68 ± 0,06gh 1,60 ± 0,05g 1,50 ± 0,04f 1,34 ± 0,05e 1,06 ± 0,05d 0,94 ± 0,04c 0,80 ± 0,03b 0,72 ± 0,02a Caùc giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác biểu thị khác có nghóa (P < 0,05) Error: Reference source not found Hình 4.57: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng trình lên men rượu vang sử Trang 96