B GIO DC V O TO TRNG I HC NễNG NGHIP H NI NGUYN HI NG NGHIấN CU TO DềNG T BO LAI SN XUT KHNG TH N DềNG KHNG PROGESTERON LUN VN THC S NễNG NGHIP Chuyờn ngnh Mó s : CHN NUễI : 60.62.40 Ngi hng dn khoa hc : TS TH THO H NI - 2008 LI CAM OAN Tụi xin cam ủoan cỏc kt qu nghiờn cu ca tụi lun ny l hon ton trung thc, tụi thc hin v cha s dng ủ bo v mt hc v no Cỏc trớch dn lun ủc ghi rừ tờn ti liu trớch dn, tỏc gi v ngun gc ti liu ủú Mi s giỳp ủ ủó ủc cm n Tỏc gi Nguyn Hi ng Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc Nụng nghip i LI CM N! Trong quỏ trỡnh thc hin ủ ti ca lun tt nghip ny, ngoi s c gng n lc ca bn thõn, tụi luụn nhn ủc s quan tõm giỳp ủ nhit tỡnh ca cỏc thy, cụ giỏo khoa Chn nuụi- Thu sn cựng ton th bn bố, s giỳp ủ tn tỡnh ca th cỏn b cụng nhõn viờn Phũng cụng ngh t bo ủng vt - Vin cụng ngh sinh hc Tụi xin gi li cm n sõu sc ti TS Th Tho v PGS TS Khc Hiu, phũng Cụng ngh t bo ủng vt - vin Cụng ngh sinh hc ủó to ủiu kin, hng dn v giỳp ủ tụi sut thi gian thc hin ủ ti ny Nhõn dp ny, tụi xin chõn thnh cm n thy giỏo PGS -TS Nguyn Bỏ Mựi, cỏn b ging dy b mụn sinh hoỏ - sinh lớ ủng vt Khoa Chn nuụi - Thu sn - Trng ủi hc Nụng nghip H Ni ủó hng dn v giỳp ủ tụi tn tỡnh ủ hon thnh lun tt nghip Tụi xin by t lũng bit n ủi vi gia ủỡnh, bn bố v nhng ngi thõn ủó luụn thng xuyờn chia s, ủng viờn tụi sut quỏ trỡnh hc H Ni, ngy 20 thỏng 08 nm 2008 Tỏc gi Nguyn Hi ng Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc Nụng nghip ii MC LC Li cam ủoan i Li cm n ii Mc lc iii Danh mc cỏc ch vt tt v Danh mc cỏc bng .vi Danh mc cỏc hỡnh vii Danh mc cỏc s ủ viii M U 1.1 Tớnh cp thit ca ủ ti 1.2 Mc ủớch ca ủ ti l TNG QUAN TI LIU 2.1 Min dch v ủỏp ng dch 2.2 Hiu bit v hormon sinh dc- Progesteron 28 2.3 Tỡnh hỡnh nghiờn cu v ngoi nc thuc lnh vc ủ ti 33 ễI TNG, Ni DUNG V PHNG PHP NGHIấN CU 36 3.1 I TNG 36 3.2 NI DUNG 37 3.3 PHNG PHP NGHIấN CU 37 KT QU V THO LUN 43 4.1 ỏnh giỏ kt qu gõy ủỏp ng dch bng phng phỏp ELISA 43 4.2 Lai to t bo lai sn xut khỏng th ủn dũng khỏng P3 - Al 48 4.3 Tỏch dũng t bo lai sinh khỏng th ủn dũng khỏng progesteron 51 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc Nụng nghip iii 4.4 Gõy bỏng cho chut 59 4.5 Kim tra hiu giỏ khỏng th 59 KT LUN 63 5.1 KT LUN 63 5.2 NGH 64 TI LIU THAM KHO 65 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc Nụng nghip iv DANH MC CC T VIT TT P3- Al (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim)- Albumin P3- BSA (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim) - BSA BSA (Bovine Serum Albumin) ATCC (American Type Culture Collection) DMEM (Dulbeco s Modified Eagles Medium) DMSO (Dimethyl Sulphoxide) EIA (Enzyme Immuno Assay) ELISA (Enzyme Linking Immuno Sorbent) FBS (Fetal Bovine Serum) FSH (Follicle Stimulating Hormone) FDA (Food and Drug Adminitration) GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone) HPRT (Hypoxanthin - Phospho - Ribosyl- Transferase) HAT (Hypoxanthin - aminopterin- thimidine) medium LH (Luteinizing Hormone) PBS (Photphate Buffered Saline) PEG (Polyethylen glycol) FCA (Freund complex Adjuvant) RIA (Radio immuno assay) CNSH (Cụng ngh sinh hc) MD (ỏp ng dch) KN (Khỏng nguyờn) KTD (Khỏng th ủn dũng) PTL (Phõn t lng) Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc Nụng nghip v DANH MC CC BNG S bng Tờn bng Trang Kt qu ủỏp ng dch ca chut thớ nghim 44 S cú mt ca khỏng th khỏng ủc hiu Progesteron cỏc mu huyt thu t cỏc chut gõy ủỏp ng dch vi P3 Al (n=5) 47 T l ging cú t bo lai trờn tng s ging thc hin dung hp 50 T l ging cú khỏng th khỏng progesteron trờn tng s ging cú t bo lai 53 Kt qu dung hp to t bo lai sinh khỏng th ủn dũng khỏng Progesteron trờn dũng t bo 54 Hiu qu tỏch dũng bng phng phỏp pha loóng ti hn 55 7: Giỏ tr OD ca dch ni ca cỏc ging dng tớnh khỏng progesteron cú dũng t bo 56 Tớnh ủc hiu ca khỏng th ủn dũng dũng t bo to 58 So sỏnh hiu giỏ khỏng th ca dch ni v dch bỏng 60 10 Kt qu tinh sch khỏng th ủn dũng bng (SAS) v Propur Kit 61 11 Kt qu kim tra huyt th thớ nghim 62 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc Nụng nghip vi DANH MC CC HèNH S hỡnh Tờn hỡnh Trang Cu trc ủin hnh ca khng th 11 B mt ca khng th IgG 12 S ủ cc chui ca mt khng th 12 Cc ủc t ca vi khun bn cnh mt t bo c th 14 Cc ủc t trn b trung ho bi khng th 15 Khng th ủn dng lin kt vi mt epitope ủc hiu 19 Cng thc cu to ca progesteron 30 (A) T bo Sp2/0 ủ phỳng ủi 10ỡ20; (B) T boP3X ủ phỳng ủi 10ỡ20 49 (A) T bo lai hybridoma gia dũng Sp2/0-Ag14 vi t bo lympho B khỏng progesteron trờn nn t bo feeder (B) T bo lai hybridoma gia dũng P3X-Ag18 vi t bo lympho B khỏng progesteron trờn nn t bo feeder; 51 (A) Clone t bo lai hybridoma gia dũng Sp2/0-Ag14 vi t bo lympho B khỏng progesteron sau quỏ trỡnh tỏch dũng; (B) Clone t bo lai hybridoma gia dũng P3X-Ag18 vi t bo lympho B khỏng progesteron sau quỏ trỡnh tỏch dũng 53 10 Kim tra hiu giỏ khỏng th ủn dũng cỏc ủ pha loóng khỏc nhau; (A) Dch ni; (B) Dch bỏng pha loóng 20 ln 60 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc Nụng nghip vii DANH MC CC S S s ủ Tờn s ủ Trang Quy trỡnh sn xut khỏng th ủn dũng 21 2a Quỏ trỡnh hỡnh thnh progesteron 30 2b Quỏ trỡnh thỏi bin ca progesteron 30 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc Nụng nghip viii M U 1.1 Tớnh cp thit ca ủ ti Cụng ngh sinh hc l mt bc tin quan trng n lc lõu di chinh phc t nhiờn ủ nõng cao ủiu kin sng ca ngi Th gii cựng chia s nhng kin thc khoa hc, thc hnh v cụng ngh Bờn cnh nhng lnh vc ủang phỏt trin rt cao nh: cụng nghip ủin t, cụng ngh thụng tin, chỳng ta ủang chng kin s gia tng phỏt trin ngy cng ln mnh ca cụng ngh sinh hc (CNSH) Cú nhiu lnh vc CNSH khỏc theo ủi tng ng dng nh CNSH phõn t, CNSH thc vt, CNSH ủng vtCNSH cú ng dng rng rói y dc, lng thc, thc phm, nng lng, húa cht, vt liu mi, nụng lõm ng nghip, bo v mụi sinh v ngy th thao ủnh cao CNSH cng ủc ỏp dng mt cỏch hiu qu Trong CNSH, t bo ủc coi l ủi tng trung tõm vụ cựng quan trng Chỳng cú cu trỳc phc v tinh vi, thc hin quỏ trỡnh trao ủi cht nh mt nh mỏy húa hc vi nhiu u vit Do t bo cú nhiu u th nờn CNSH ủó s dng t bo lm nh mỏy sn xut v l cụng c th nghim CNSH t bo ngi v ủng vt cú nhiu ng dng trc tip liờn quan ủn ngi nờn phỏt trin rt nhanh, nú ủỏp ng nhiu nhu cu cho phũng v cha tr bnh v nhiu ng dng nụng nghip nht l lnh vc chn nuụic bit, th k XX ủó cú phỏt minh nn tng ca CNSH ủng vt m c th gii phi xụn xao v cụng nhn, ủú l khỏng th ủn dũng, t bo gc, v nhõn bn vụ tớnh ủng vt S ủi ca khỏng th ủn dũng l mt bc tin quan trng, ủc bit l chn ủoỏn v cú trin vng ln sn xut thuc hng mc tiờu Nh vy: T l s ging cho khỏng th ca chut cao hn ca chut 3, ủiu ny cho thy, kt qu t bo lai cú sinh khỏng th ph thuc nhiu vo s ủỏp ng dch ca chut, chut cú hiu giỏ khỏng th cao s cho nhiu ging cú khỏng th hn chut cú hiu giỏ khỏng th thp + Bng phng phỏp ELISA, chỳng tụi cng sng lc ủc nhng ging cú khỏng th khỏng ủc hiu progesteron (ch khụng phi khỏng P3- Al) ủ tin hnh tỏch dũng phc v cho cỏc bc tip theo + Do nhn thy cỏc ủc tớnh t bo lai ca dũng Sp2/0-Ag14 tri hn so vi dũng P3X-Ag18 nờn chỳng tụi la chn ging t bo lai sinh khỏng th khỏng Progesteron cú giỏ tr OD cao nht ca dũng Sp2/0-Ag14 ủ tỏch dũng Bng Kt qu dung hp to t bo lai sinh khỏng th ủn dũng khỏng Progesteron trờn dũng t bo Cỏc ch s thớ nghim Dũng t bo P3X Sp2/0 Tng s ging nuụi t bo 288 288 S ging cú t bo lai 211 241 73,2% 83,6% 18(chut 2) + 22(chut 2) + 15(chut 3) = 33 20(chut 3) = 42 Ging E12/ủa2 (OD=2,707) Ging B3/ủa1 (OD=3,076) BSA (OD= 0,355) BSA (OD= 0,355) 15,64% 17,43% T l % t bo lai so vi tng s ging S ging cú khỏng th khỏng Progesteron T l % s ging cú KT khỏng Progesteron BSA: Bovine Serum Albumin (i chng õm) 54 Sau kim tra kh nng sinh khỏng th khỏng Progesteron ca cỏc ging cú t bo lai bng phng phỏp ELISA, chỳng tụi chn ủc mt ging cú giỏ tr OD cao nht (ging B3/ủa 1/ t bo Sp2/0, OD =3,076) ủ tin hnh tỏch dũng bng phng phỏp pha loóng ti hn cho cú khụng quỏ tb/ging Kt qu tỏch dũng ủc th hin bng sau: Bng Hiu qu tỏch dũng bng phng phỏp pha loóng ti hn S clone/ging clone/ging clone/ging clone/ging a 30/96 50/96 16/96 a 15/96 70/96 11/96 a 42/96 36/96 18/96 Tng s 87/288 156/288 45/288 Hiu qu 30,21% 54,17% 15,63% a TN Nh vy tng s 288 ging khay thỡ cú 156 ging cú mt ủ 1clone/ging, ủt hiu qu tỏch dũng l 54,17% T bo ủc nuụi khong thi gian tun, sau ủú thu dch ni v s dng phng phỏp ELISA ủ kim tra s cú mt ca khỏng th khỏng ủc hiu Pogesteron dch ni ca cỏc ging cú 1clone t bo/ ging sau tỏch dũng Sau kim tra 156 ging cú 1clone/ ging bng phng phỏp ELISA thỡ chỳng tụi ch thu ủc 35 ging cú dch ni cú phn ng dng tớnh vi khỏng nguyờn progesteron Nh vy ch cú 35 clone t bo sn xut khỏng th khỏng li progesteron õy chớnh l khỏng th ủn dũng (01 clone t bo) m chỳng ta mong mun Kt qu tỏch dũng vi 35 ging cú phn ng dng tớnh cho thy s cú mt ca khỏng th khỏng progesteron ủc th hin bng 55 Bng 7: Giỏ tr OD ca dch ni ca cỏc ging dng tớnh khỏng progesteron cú dũng t bo STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Tờn ging A8 A11 C2 C4 D7 E3 E7 E9 F1 F9 G2 G9 H3 H6 B9 C6 E6 F2 F11 F12 G4 G12 H4 H8 H12 A3 B5 C7 C8 F9 G5 G10 G11 H2 H6 C + C - 56 a TN Giỏ tr OD (n=3) 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 0,927 0,019 0,878 0,018 0,619 0,012 0,509 0,010 0,796 0,016 0,76 0,015 1,983 0,040 0,732 0,015 0,468 0,009 0,680 0,031 0,462 0,015 1,542 0,013 0,764 0,011 0,650 0,010 0,531 0,015 0,502 0,017 0,864 0,010 0,504 0,015 0,742 0,017 0,872 0,018 0,889 0,033 1,673 0,029 1,437 0,040 1,979 0,015 0,745 0,014 0,678 0,012 0,579 0,010 0,491 0,013 0,647 0,012 0,608 0,016 0,648 0,010 0,789 0,012 0,502 0,016 0,613 0,038 0,787 0,019 1,921 0,355 Kt qu cho thy: Trong 35 ging dng tớnh, cỏc ging khỏc cú giỏ tr OD khỏc iu ny chỳng t mi dũng t bo khỏc thỡ kh nng sinh khỏng th cng khỏc Vỡ vy cú th thy cỏc ging cú t bo lai sinh khỏng th cú cht lng cao ph thuc nhiu vo dũng t bo lympho B cú ủỏp ng dch tt vi khỏng nguyờn hay khụng v dũng t bo Myeloma (qua thc nghim ủó chng minh dũng t bo Sp2/0-Ag14 tt hn dũng P3X-Ag18) T kt qu ca bng 7: chỳng tụi chn dũng t bo sinh khỏng th ủn dũng khỏng ủc hiu Progesteron tt nht tng ng vi ging cú giỏ tr OD cao nht l: + Ging E7 vi giỏ tr OD = 1,983 ủt tờn l MCAP1 + Ging G9 vi giỏ tr OD = 1,542 ủt tờn l MCAP2 + Ging G12 vi giỏ tr OD = 1,673 ủt tờn l MCAP3 + Ging H4 vi giỏ tr OD = 1,437 ủt tờn l MCAP4 + Ging H8 vi giỏ tr OD = 1,979 ủt tờn l MCAP5 Vi dũng t bo ủó chn lc, chỳng tụi tin hnh nuụi in vitro ủ cú s lng ln t bo quỏ trỡnh nhõn nuụi ủt kt qu tt, t dũng t bo chn ủc chỳng tụi vo chai nuụi cy cho ủt nng ủ 1ì 105 t bo/ml Cỏc chai nuụi cy ủc b sung mụi trng thớch hp cho cỏc t bo lai phỏt trin tt v nuụi t m 370C, 5% CO2 Mụi trng nuụi cy chỳng tụi s dng gm cỏc thnh phn: DMEM v b sung FBS 10% 4.3.1 Chn lc dũng t bo sinh khỏng th cú tớnh ủc hiu v ủ nhy cao * Tớnh ủc hiu khng ủnh tớnh ủc hiu ca khỏng th ủn dũng khỏng progesteron ca dũng t bo thu ủc trờn, chỳng tụi tin hnh kim tra bng phng phỏp ELISA Kim tra tớnh ủc hiu ca khỏng th ủn dũng sinh l kim tra kh nng kt hp ca khỏng th ủn dũng vi khỏng nguyờn v cỏc cht 57 khỏc cú cu trỳc phõn t tng t nh Progesteron v cú huyt l hormon steroid nh progesteron, estradiol, testosteron, corticosteron v pregnenolon Ngoi progesteron mỏu ủng vt cũn cỏc hormon steroid trờn cú cu to hoỏ hc gn ging vi progesteron Chỳng tụi dựng khỏng th ủn dũng mi thu ủc ln lt th nghim vi ủi din cỏc nhúm khỏng nguyờn cú cu to hoỏ hc gn ging vi Progesteron núi trờn v thu ủc kt qu qua bng nh sau: Bng Tớnh ủc hiu ca khỏng th ủn dũng dũng t bo to S Khỏng nguyờn TT Dũng t bo Progesteron Estradiol Testosteron Corticosteron Pregnenolon MCAP1 + - - - + MCAP2 + - + + - MCAP3 + - - - - MCAP4 + - - - + MCAP5 + - + - - Ghi chỳ: (+): dng tớnh; (-) õm tớnh Kt qu bng cho thy: - Cỏc dũng MCAP1 v MCAP4 ủu cho kt qu dng tớnh vi loi khỏng nguyờn l progesteron v pregnenolon Dũng MCAP2 MCAP5 cho kt qu dng tớnh vi progesteron nhng cng dng tớnh vi c testosteron v corticosteron Nh vy, khỏng th dũng t bo ny sinh cú tớnh ủc hiu khụng cao khụng phõn bit ủc gia progesteron vi cỏc dng hormon gn ging vi chỳng - Ch cú dũng MCAP3 cho kt qu õm tớnh vi Estradiol, Testosteron, Corticosteron, Pregnenolon v ch dng tớnh vi progesteron chng t rng khỏng th dũng t bo ny sinh cú tớnh ủc hiu cao Chỳng ủó phõn bit 58 ủc cỏc loi hormon gn ging vi progesteron v ch khỏng ủc hiu progesteron Chỳng ta thy rng khỏng th ủn dũng l khỏng th ch cú kh nng kt hp ủc hiu vi mt loi khỏng nguyờn nht m khụng kt hp vi cỏc loi khỏng nguyờn khỏc cho dự chỳng cú cu to hoỏ hc gn ging vi khỏng nguyờn ủú * Kh nng sinh khỏng th ca cỏc dũng t bo Mt dũng t bo cú cht lng cao ngoi kh nng sinh khỏng th cú tớnh ủc hiu cao cũn cn phi cú sc sng tt, kh nng sinh khỏng th nhiu t ủú mi ủm bo to ủc mt lng ln khỏng th trờn quy mụ cụng nghip, ủ ủ phc v nhu cu sn xut thc t - Da trờn kt qu kim tra tớnh ủc hiu v kh nng phỏt trin ca dũng t bo, chỳng tụi ch chn dũng MCAP3 cú tớnh ủc hiu cao, tip tc nhõn nuụi thu dch ni, lu gi t bo Nit lng v gõy bỏng cho chut nhm thu lng khỏng th cao 4.4 Gõy bỏng cho chut Khỏng th ủn dũng cú th thu nhn t dch ni ca chai nuụi t bo hybridoma Tuy nhiờn theo Karsten v Rudloph (1985) thỡ ta cú th thu nhn ủc khỏng th cao hn t 100 ủn 1000 ln nu tiờm cỏc t bo lai vo xoang bng ca chut ủó ủc tiờm pristane trc ủú tun Sau khong t ủn 12 ngy bng chut cú bỏng to thỡ thu dch bỏng Trong thớ nghim ny, chỳng tụi ủó gõy bỏng thnh cụng ủc chut (s v s 10)/ 10 chut cỏi BALB/c bng dũng MCAP3 v thu ủc khong 5ml/con/ln ủc 3-5 ln/con 4.5 Kim tra hiu giỏ khỏng th Dch bỏng thu ủc lu gi 4C qua ủờm trc ủc chỳng tụi tin hnh tinh sch bng phng phỏp kt ta vi Saturated Amonium Sulphate (SAS) hoc bng Propur Kit ca hóng Nunc 59 i vi dch ni nuụi cy ca dũng MCAP3 chỳng tụi s dng mụi trng nuụi cy ủc bit khụng cú huyt (Hybridoma Medium) ca hóng GIBCO BRL Chỳng tụi nhn thy t bo phỏt trin tt loi mụi trng ny ủt 1x106 t bo/ ngy Sau ngy nuụi cy, dch ni ủc thu gi v ct 4oC qua ủờm trc tinh sch bng phng phỏp SAS hoc bng Propur Kit Trc tin hnh tinh sch, dch ni v dch bỏng ủc chỳng tụi tin hnh kim tra hiu giỏ khỏng th Kt qu ủc trỡnh by bng Bng So sỏnh hiu giỏ khỏng th ca dch ni v dch bỏng STT pha loóng ln 10 ln 50 ln 100 ln 200 ln 500 ln Mu TNo Dch ni +++ ++ ++ + ++++ +++ (nguyờn) +++ ++ ++ + Dch bỏng (pha ++++ +++ loóng 20 ln) (++++): mu rt ủm (++): mu ủm va (-):khụng mu (+++): mu ủm (+): mu nht A 1000 ln B ln ln 10 ln 10 ln 50 ln 50 ln 100 ln 100 ln 200 ln 200 ln 500 ln 500 ln 1000ln 1000ln mtnh mtnh Hình 10 Kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng độ pha loãng khác nhau; (A) Dịch nổi; (B) Dịch báng pha loãng 20 lần 60 - Quan sỏt bng ta thy hiu giỏ khỏng th ca dch ni v dch bỏng th hin l nh nhng hiu giỏ khỏng th ca dch ni l nguyờn bn ủú hiu giỏ khỏng th ca dch bỏng ủó pha loóng 20 ln Nh vy cú ngha l hiu giỏ khỏng th ủn dũng dch bỏng cao gp khong 20 ln so vi dch ni ng thi kt qu thớ nghim cho thy hiu giỏ khỏng th thu ủc l cao (500 ln ca dch ni) v 10.000 ln ca dch bỏng, t ủú cú th phc v cho mc ủớch thng mi Sau thu ủc dch ni v dch bỏng ca dũng t bo MCAP3 chỳng tụi tin hnh tinh sch bng SAS v Propur Kit Kt qu tinh sch ủc trỡnh by bng 10 Nhỡn vo bng 10, ta thy tng lng khỏng th ủn dũng khỏng Progesteron tinh sch ủc bng SAS l 1,808mg Trong ủú tinh sch bng Propur Kit l 2,55mg Bng 10 Kt qu tinh sch khỏng th ủn dũng bng (SAS) v Propur Kit Dch Dũng t ni bo (100ml) MCAP 0,43 àg/ml x 100 ml (43àg) S dng SAS S dng Propur Kit Dch bỏng Dch bỏng Tng Tng Dch pha loóng pha loóng lng lng ni 10 ln 10 ln MoAb thu (100ml) MoAb thu (50ml) (50ml) ủc ủc 35,3 àg/ml x 50 ml (1,765mg) 1,808 mg 0,45 àg/mlx 100 ml (45àg) 50,1àg/ml x 50 ml (2,505mg) 2,55 mg Tng lng KTD khỏng Progesteron thu ủc l 4,358 mg Nh vy cú s khỏc rừ rt tinh sch bng SAS v s dng Propur Kit S dng Propur Kit ủ tinh sch khỏng th s thu ủc lng khỏng th cao hn so vi phng phỏp SAS Lng khỏng th ủn dũng thu ủc trờn ủc chỳng tụi lu gi bng ủm PBS nng ủ 1mg/ml v ct -80oC 61 Vi mc ủớch l s dng khỏng th ủn dũng thc tin sn xut vớ d phỏt hin ủng vt cú cha nờn chỳng tụi ủó s dng khỏng th ủn dũng thu ủc trờn ủ kim tra huyt ca th thớ nghim bng phng phỏp ELISA Kt qu ủc trỡnh by bng 11 Kt qu t bng 11 cho thy khỏng th ủn dũng m chỳng tụi thu ủc ủó phn ng ủc hiu v phỏt hin ủc Progesteron huyt ca th thớ nghim Khụng nhng th th khụng cha thỡ mỏu tn ti progesteron nờn khỏng th ủn dũng dch ni v dch bỏng cng nh khỏng th ủn dũng tinh sch phỏt hin ủc vy cú phn ng dng tớnh Tuy nhiờn th khụng cha thỡ hm lng prgesteron thp hn nhiu so vi th cha Do vy cỏc dch ni, dch bỏng v khỏng th ủn dũng tinh sch b pha loóng ủó khụng th hin phn ng dng tớnh vi th khụng cha th hin dng tớnh vi cỏc th cha Bng 11 Kt qu kim tra huyt th thớ nghim ng vt TN Dch khỏng th Dch ni Dch bỏng Khỏng th tinh sch Th cha C1 C2 C3 Th khụng cha K1 K2 K3 Khụng pha + + + + + + Pha loóng 10 ln + + + - - - Pha loóng 10 ln + + + + + + Pha loóng 50 ln + + + - - - + + + + + + + + + - - - Pha loóng 100 ln (10 àg/ml) Pha loóng 500 ln (2 àg/ml) iu ny cho phộp chỳng tụi kt lun rng khỏng th ủn dũng chỳng tụi thu ủc cú phn ng ủc hiu vi progesteron v phõn bit ủc ủng vt cú cha v ủng vt khụng cú cha t l pha loóng phự hp (500X) 62 KT LUN 5.1 KT LUN Qua quỏ trỡnh lm vic nghiờm tỳc vi cỏc ni dung: gõy ủỏp ng dch cho chut, dung hp to t bo lai, tỏch dũng t bo lai sinh khỏng th ủn dũng khỏng ủc hiu progesteron, chn lc dũng t bo lai theo mong mun, tinh sch khỏng th, dựng khỏng th ủn dũng ủó sn xut ủ kim chng phỏt hin ủng vt cú cha, chỳng tụi rỳt mt s kt lun sau: Tin hnh gõy dch vi liu lng khỏng nguyờn P3 - Al bng 200àg/con/ln tiờm s cho ủỏp ng dch tt nht ỏp ng dch ca c th khụng nhng ph thuc vo liu lng khỏng nguyờn gõy dch m cũn ph thuc vo cỏ th ủng vt Sau dung hp v tỏch dũng chỳng tụi, ủó chn ủc 05 dũng t bo cú kh nng sinh khỏng th ủn dũng khỏng progesteron nh mong mun Trong quỏ trỡnh nhõn nuụi v dung hp t bo, chỳng tụi nhn thy t bo lai gia t bo lympho B vi t bo Sp2/0-Ag14 cú sc sng mnh hn, t bo sinh sn nhanh hn so vi dũng t bo P3X-Ag18 ủiu kin bỡnh thng vi c hai loi mụi trng nuụi cy l DMEM v RPMI 1640 Trong dũng t bo lai sinh khỏng th ủn dũng ủc chn lc dũng t bo MCAP3 cú kh nng sinh sn tt, khỏng th cú tớnh ủc hiu v hiu giỏ khỏng th cao ủ nhõn nuụi, gõy bỏng trờn chut v bo qun nit lng Cú s khỏc rừ rt tinh sch bng hai phng phỏp SAS v s dng Propur Kit S dng Propur Kit tinh sch khỏng th s cho hiu sut cao hn so vi SAS Khỏng th ủn dũng chỳng tụi thu ủc cú phn ng ủc hiu vi progesteron v s dng ELISA ủó phõn bit ủc ủng vt cú cha v ủng vt khụng cú cha 63 5.2 NGH Quy trỡnh sn xut khỏng th ủn dũng gm nhiu giai ủon khỏc nhau, quỏ trỡnh ủú vic s dng phng phỏp ELISA ủ sng lc, kim tra v ủỏnh giỏ khỏng th ủn dũng l cn thit v thc s ủó ủem li hiu qu Tuy nhiờn ủ hon thnh cỏc bc ca quy trỡnh v cú ủc khỏng th ủn dũng cht lng cao hn ủỏp ng ủc vic to kớt ủnh lng progesteron thỡ cn phi nghiờn cu sõu hn na c bit, vic phõn tớch cỏc ủc tớnh quan trng ca khỏng th ủn dũng thu ủc nh xỏc ủnh isotope ủc hiu, xỏc ủnh ỏi lc khỏng nguyờn - khỏng th vv ti ca chỳng tụi mi ch cú ủc nhng kt qu bc ủu, to ủc nhng dũng t bo lai sn xut khỏng th ủn dũng khỏng progesteron nng sut cao, cht lng tt Chỳng tụi mong mun ủc tip tc nghiờn cu theo hng ny ủ to ủc sn phm cui cựng l b kớt chun ủ ủnh lng progesteron dch sinh hc (mỏu, nc tiu ) phc v cho nghnh chn nuụi nc nh 64 TI LIU THAM KHO Ting Vit V Triu An, Lờ c C, Vn ỡnh Hoa, Nguyn Ngc Lanh, Trung Phn, Phm Hong Phit (1981), Nhng k thut c bn dựng dch hc, NXB y dc hc.Tr5-284 V Triu An, Jean Claude Homber (1998), Min dch hc, NXB Y hc H Ni Tr 7- 277 Nguyn Tn Anh (1998), Sinh lớ sinh sn gia sỳc, NXB Nụng nghip, H Ni Lờ Trn Bỡnh, Phan Vn Chi, Nụng Vn Hi, Trng Nam Hi, Lờ Quang Hun (2003), p dng cỏc cỏc k thut phõn t nghiờn cu ti nguyờn sinh vt Vit Nam, NXB KHKT H Ni Trn Tin Dng, Dng ỡnh Long, Nguyn Vn Thanh (2002), Sinh sn gia sỳc, NXB Nụng nghip, H Ni Tr: 65, 107, 227- 231 Trn Tin Dng (2003), nh lng mt s hormon sinh sn v s dng hormon tng hp Estrumate khc phc hin tng ri lon sinh sn trõu, Tp KHKT thỳ y, Hi thỳ y Vit Nam.Tr: 71- 74 Nguyn Th H (2001), Húa sinh hormone, NXB Y hc H Ni Tr: 527 Lờ Vn Hựng (2002), Min dch hc thỳ y, NXB Nụng nghip Tr7189 Phan Vn Kim, Nguyn Quý, Qunh Hoa (2003), Kt qu nghiờn cu hm lng progesteron bũ lai hng sa bng k thut dch enzyme, Hi ngh Cụng ngh Sinh hc ton quc, H Ni Tr: 607- 610 65 10 Phan Vn Kim, Trnh Quang Phong, Nguyn Quý, Qunh Hoa, Tng Xuõn Lu (2003), ng dng kt qu nghiờn cu hm lng progesteron ủ chn ủoỏn v ủiu tr ri lon sinh sn bũ sa, Hi ngh Cụng ngh Sinh hc ton quc, H Ni Tr: 708-711 11 Vừ Thng Lan (2002), Sinh hc phõn t, NXB i Hc Quc Gia H Ni 12 Phng Liờn (1999), Min dch hc c s, NXB i Hc Quc Gia H Ni 13 Nguyn Quyờn (2004), Mt s yu t nh hng ủn quỏ trỡnh sn xut khỏng th ủn dũng, Lun ỏn tin khoa hc s y dc 14 Nguyn Xuõn Tnh, Tit Hng Ngõn, Nguyn Bỏ Mựi, Lờ Mng Loan (1996), Sinh lớ hc gia sỳc, NXB Nụng Nghip Tr: 63- 68 15 Nguyn Quang Thch, Nguyn Th Lý Anh, Nguyn Th Phng Tho (2004), Giỏo trỡnh cụng ngh sinh hc nụng nghip Tr: 112116 16 Nguyn Nh Thanh (1997), Min dch hc Thỳ y, NXB Nụng nghip Tr: - 10, 40- 45 Ting Anh 17 Anil TM, Shankar TM, Mohan CV (2002) "Monoclonal Antibodies developed for sensitive detection and comparision of white spot syndrome virus isolates in India" Di Aquat Organ, 51(1)pp 67-75 18 Ariana Celis, Kurt Dejgaard and Julio E.Celis(1994), Production of moucse monoclonae antibodies cell biology V.2, pp 269-275 19 Christopher Daen, Philip Shepkerd (2000)."Monoclonal Antibodies" Cell biology (10-12, 26-28, 118) 66 20 Cole S.P.C, Kozbor D and Roder J.C.C (1985), Hybrodoma technology-Bioscicsees and midicine, Springer- New York, pp.258266 21 Engvall E, PerlmanP (1971), Enzyme Linked Iimunosorbent Assay (ELISA).Quantitative assay of immunoglobulin G , Immunochemistry, Sep; 8(9):871-874PMID:5135623 22 Galjre G,Howe S.C, Milstein C, (1977), "Antibodies to major histology compability antigens producced by hybrid cell line Nature (550-532) 23 Galjre G, and Milstein C, (1981), Preparation of monoclonal antibodies strategies and procedures, Method enzymeol, pp 34- 36 24 Gefter.M.L et al (1977) "Simple method for PEG promoted hybridization of mouse myeloma cell" Somat cell Genet (231-236) 25 Goncalves S.C, Horta A.E.M (1999), The efect of blocking progesterone in superovulated ewes, Colectanea da EZN 26 Huang, C, X.Zhang, Q.Lin, X.Xu, Z.H.Hu, and, C.L.Hew (2002), ''proteomic analysic of shrimp white spot sydrome viral proteins and characterization of a noval envolope protein VP 466" Mol Cell Prot.1, pp 223-231 27 Hunter.R (1972), Ovaries response of the pig to gonadotropin infeted at diference stage of oestrus cycle, Animal Sience, pp 457 28 J Eryl Liddell and A Cryer (2002), A practical guide to Monoclonal Antibody, pp 25- 27 29 John Wiley and Sons (2000), Immunology (11.4.2-11.8.2) 30 Juan S, Bonifacino at al (2000), "Currennt protocols, Cell Biology (1.1.1-16.1.0,16.1.0-16.9.9A) 67 31 Maurice J Sauner, John A Foulkes and Alan D Cookson (1981), Direct enzyme immunoassay of progesteron in bovine milk, Steroids, volume 38, number UK, pp 45- 52 Nakao T, Sugihashi A, Saga N, Tsunda N and Kawata K (1983), An improved Enzyme immunoassay of progesterone applied to bovine milk, Br Veterinary Japan, pp 109- 117 31 Oliver JP.Leger v Jose.Wsaldanha (2000), Monocnonal Antibodies, Cell Feeder (10-30, 150) 32 Philip Shepker, Chiristopher Dean (2000), Monoclonal Antibodies, Cell 0biology, pp 10- 12, 26- 28, 118 33 Shuman M, Wild.c.d and Kohler G (1978), A better cell line for marking hybridoma seereting specific antibodies, Nature c 276, pp 269- 270 34 Van De Weil D.F.M and Koops W (1986), Development and validation of an Enzyme immunoassay for progesterone in bovine milk or blood plasma, Annimal Reproduction Sience, pp 201- 203 35 Wu L.S, Guo I.C, Lin J.H (1997), Pregnancy diagnosis on sows by using an on farm blood progesterone test, Asia- Australasian journal of Animal Science, pp 603- 608 36 .http://www.Chemicon.com 37 http://www.biology.arizona.edu 38 http://www.accessexcellence.org 39 (http://vi.wikipedia.org/wiki/khangthe) 68