1 T VN t bin gen c xỏc nh l mt nhng nguyờn nhõn gõy nờn nhiu bnh, c bit l cỏc bnh lý di truyn v ri lon chuyn húa Nhng tn thng gen thng xy sm nht Cỏc tn thng ny thụng qua c ch iu hũa gen mi tng tỏc gia cỏc gen vi hoc cỏc gen vi cỏc phõn t ni bo hoc mi tng tỏc t bo - t bo m biu hin thnh cỏc th bnh nng, nh khỏc Cỏc nh khoa hc trờn th gii ó i sõu tỡm hiu c ch gõy t bin v kt qu cho thy: c ch gõy t bin gen rt phc tp, cỏc kiu/dng t bin a dng v phong phỳ tựy thuc vo tng th bnh, mc nng nh v cú hoc khụng c hiu vi chng tc Trong giai on hin chỳng ta cha th s dng cỏc k thut sinh hc phõn t can thip nhm ngn nga s phỏt sinh t bin nhng vi mi mt bnh lý c th cỏc nh khoa hc hon ton cú th xỏc nh c chớnh xỏc cỏc t bin mt cỏch sm nht a nhng gii phỏp can thip kp thi hay cỏc li khuyờn di truyn nhm nõng cao hiu qu iu tr v phũng bnh Bnh to xng bt ton (osteogenesis imperfecta) cũn gi l bnh xng thy tinh hay bnh giũn xng Hn 90% bnh to xng bt ton l di truyn tri trờn nhim sc th thng Bnh bao gm nhiu th lõm sng v cú c im di truyn khỏc vi tn sut mc bnh 1/15.000ữ1/25.000 [1],[2],[3] Nguyờn nhõn ca bnh l t bin gen tng hp collagen týp I dn n thiu ht hoc bt thng cu trỳc ca phõn t collagen týp I gõy nờn giũn xng, gim lng xng v bt thng cỏc mụ liờn kt Collagen týp I l mt loi protein chim u th cht nn khong gian bo ca hu ht cỏc mụ, c tỡm thy xng, mng bc cỏc c quan, giỏc mc, cng mc mt, cõn v dõy chng, mch mỏu, da, mng nóo, l thnh phn chớnh ca ng rng v chim 30% trng lng c th Vỡ vy, b khim khuyt cht c bn ngoi bo, bnh khụng ch biu hin bt thng xng m cũn bt thng cỏc t chc khỏc nh cng mc mt mu xanh, to rng bt ton, gim thớnh lc [4],[5] Bnh to xng bt ton gõy au n, tn ph sut i cho tr c v mt th cht ln tõm thn vi th bnh nh Cũn vi th bnh nng thỡ gõy t l t vong cao Cho n nay, cha cú phng phỏp iu tr c hiu i vi bnh to xng bt ton Ch yu l iu tr triu chng, gim au, gim góy xng tỏi phỏt vi mc ớch gim n mc ti a t l tn tt v suy gim cỏc chc nng, giỳp ci thin cht lng cuc sng cho bnh nhõn [6],[7] Cỏc nh khoa hc ó phỏt hin rng, khong trờn 90% cỏc trng hp bnh to xng bt ton gõy nờn t bin gen COL1A1 v COL1A2 [8] T ú n nay, khong 300 dng t bin khỏc trờn COL1A1 v COL1A2 ó c phỏt hin, ú t bin ph bin nht c mụ t bi Dalgleish v cng s nm 1997 l s thay i cỏc acid amin glycin thnh mt acid amin khỏc Cỏc t bin ny khụng trung vựng trng im (hotspot) m ri rỏc khp chiu di ca gen vỡ vy quỏ trỡnh phõn tớch gen tỡm t bin tng i khú khn [9],[10],[11],[12] Bng k thut phõn tớch gen thỡ kt qu phõn tớch gen l tin quan trng giỳp chn oỏn trc sinh i vi cỏc i tng cú nguy c cao sinh b bnh to xng bt ton a nhng t di truyn giỳp ngn nga v lm gim t l mc bnh [13],[14] Cỏc nghiờn cu bnh to xng bt ton Vit Nam cũn rt ớt, ch yu nghiờn cu v mt lõm sng ti bnh vin Nhi Trung ng nờn s lng nghiờn cu v bnh to xng bt ton cha nhiu, thụng tin cũn hn ch Xut phỏt t thc tin ú, nghiờn cu ny c tin hnh nhm mc tiờu: Xỏc nh t bin gen COL1A1, COL1A2 trờn bnh nhõn mc bnh to xng bt ton Xỏc nh t bin gen COL1A1, COL1A2 b m ca bnh nhõn ó phỏt hin t bin gen COL1A1 hoc COL1A2 Chng TNG QUAN 1.1 Bnh to xng bt ton 1.1.1 Lch s nghiờn cu bnh to xng bt ton trờn th gii Theo nghiờn cu ca Lowenstein E.J Ai Cp thỡ bnh to xng bt ton ó xut hin t 1.000 nm trc cụng nguyờn (hỡnh 1.1), [15] Tuy nhiờn n nm 1788, nhng mụ t khoa hc u tiờn v bnh to xng bt ton mi c Olaus Jakob Ekman a Nm 1833, Lobstein mụ t trng hp bnh u tiờn, ú l mt bnh nhõn n 35 tui n bnh vin New Sussex vỡ bin dng ct sng t 10 tui, c phỏt hin cng mc mt xanh dn ớt nht l 8ữ10 nm, au lng trc ú vi thỏng, ic tai phi v nm sau ú ic tai trỏi Bnh nhõn ny b góy xng cỏnh tay trỏi lỳc 12 tui b ngó trng v sau ú mt thi gian ngn li b góy xng tr trỏi hai ln liờn tip ngó Khi n khỏm, bnh nhõn ch cao 1,5 m; yu t, ic, góy nhiu rng trờn, rng ca hm di nh v mnh, men rng xu, bin dng ct sng, bin dng xng di v hp s, cỏc ngún tay ng quỏ mc Bnh nhõn c chn oỏn bnh osteopsathyrosis, bnh to xng bt ton hay bnh Lobstein [16] Sau Lobstein mụ t trng hp bnh ny, rt nhiu trng hp cú biu hin bnh tng t c bỏo cỏo Nm 1849, bnh c Vrolik mụ t v c gi l hi chng Vrolik hay bnh xng thy tinh Trong th k XX, nhiu nghiờn cu bỏo cỏo nhng bin i lõm sng v mc nng nh khỏc ca bnh to xng bt ton Looser ó tin hnh phõn loi bnh ln u tiờn vo nm 1906 Nm 1963 cú 120 trng hp bnh c bỏo cỏo y vn, sau ú l Silence xut phõn loi bnh thnh bn týp vo nm 1979 [17] Tuy ó c chnh sa nhiu ln nhng cỏch phõn loi ny c ỏp dng Tờn gi bnh to xng bt ton c xỏc nh t nm 1985 v c s dng n ngy [18] Hỡnh 1.1 Phn cũn li ca b xng mt tr b to xng bt ton vi hỡnh nh xng s Tam OShanter, to rng bt ton, xng mng v bin dng [15] 1.1.2 c im cu to v quỏ trỡnh chuyn húa xng 1.1.2.1 Cu to ca xng B xng ngi cú khong 80% xng c (cortical bone) v 20% xng xp (trabecular bone) Tuy nhiờn, b mt ca xng c ch chim khong 1/5 b mt ca xng xp Do ú, trờn phng din chuyn húa, xng xp hot húa (active) hn xng c T l chuyn húa xng (remodeling) ca xng xp khong 20% n 30% ú t l ny cho xng c ch t 3% n 10% Cu to xng gm cú cỏc thnh phn hu c v vụ c Thnh phn hu c chim 35% bao gm cht to keo, glucoprotein, phosphoprotein, mucopolysacarid hoc glycosaminoglycan (GAG) v lipid Thnh phn vụ c chim 65% gm ch yu l cỏc tinh th hydroxyapatit (Ca.10(PO4).6(OH)2) cú tớnh cht vt lý ca gm s v thnh t quan trng nht l calci Ti bt c v trớ no ca xng, quy trỡnh chu chuyn xng (xng b o thi v thay th bng xng mi) xy khong ba nm mt ln Khi xng (bone mass) c tớch ly nhanh tui dy thỡ v t mc ti a vo khong tui 20 n 30 khỏc bit v xng gia cỏc cỏ nhõn dao ng khong 10% n 20% Phn ln khỏc bit v xng cao nht (peak bone mass) l cỏc yu t di truyn quyt nh Vic gim cht xng nh hng n c xng xp v xng c iu ny thay i hon ton cu trỳc ca xng Tuy nhiờn, cỏc thnh phn cu to húa hc ca xng khụng thay i [19],[20],[21],[22],[23] 1.1.2.2 Quỏ trỡnh chuyn húa ca xng Xng khụng phi l vt cht "cht" m trỏi li cú hot ng chuyn húa rt tớch cc gm hai quỏ trỡnh to xng v hy xng vi s tham gia ca t bo to xng gi l to ct bo v t bo hy xng gi l hy ct bo Hai quỏ trỡnh ny din song song v sut cuc i tr em, quỏ trỡnh to xng hot ng mnh hn quỏ trỡnh hy xng Khi trng thnh, iu kin bỡnh thng, hai quỏ trỡnh to xng v hy xng hot ng nhp nhng v b sung cho Khi lng xng o thi luụn luụn bng vi lng xng to t c s quõn bỡnh ny, mt h thng sinh hc gm cỏc hormon v cỏc yu t trung gian phi tng tỏc vi mt mụi trng c iu khin bi hng trm gen Cỏc hormon ny bao gm hormon cn giỏp, vitamin D v cỏc hormon thuc steroid Cỏc yu t trung gian tham gia vo vic kim soỏt quỏ trỡnh to xng v hy xng bao gm cỏc cytokin v cỏc yu t tng trng (hỡnh 1.2), [19],[20],[23],[24],[25] Hỡnh 1.2 Chu k tỏi to xng (ngun: Roche, 1998) Quỏ trỡnh chuyn húa bỡnh thng ca xng giỳp trỡ v n nh cu to ca xng bao gm cỏc khoỏng cht, khung c bn hu c, cỏc t bo v nc Thnh phn khoỏng cht chim khong 2/3 tng trng lng khụ, ch yu l apatit calci Khung c bn hu c chim khong 35% trng lng xng, ú collagen týp I chim khong 90% Phn ln cỏc du n sinh hc ca quỏ trỡnh hy xng l sn phm thoỏi húa ca collagen týp I Cu trỳc collagen týp I gm ba chui polypeptid xon c (hai chui v mt chui 2) Cỏc phõn t collagen ni bi liờn kt chộo pyridinium Prolin c hydroxyl húa mt phn thnh hydroxyprolin Cui cựng, cỏc chui ph cha nit ca prolin v lysin di tỏc dng ca lysyl oxidase hỡnh thnh vũng pyridinium Nh th m hỡnh thnh mt mng li cht ch gia cỏc phõn t collagen týp I (hỡnh 1.3) Nhng bin i thnh phn cu trỳc v chc nng ca collagen týp I s lm ri lon cu to v quỏ trỡnh chuyn hoỏ xng gõy nờn cỏc bnh lý v xng ú l cỏc bnh lý cú th phỏt sinh i sng hoc l bnh di lý truyn qua cỏc th h gõy nờn bi t bin gen Trong ú cỏc t bin gen COL1A1 v COL1A2 gõy s thiu ht hoc bt thng cu trỳc ca phõn t collagen týp I gõy nờn bnh to xng bt ton vi cỏc c im giũn xng, gim lng xng v bt thng cỏc mụ liờn kt, [26] Hỡnh 1.3 Cu trỳc ca collagen trng thnh týp I (ngun: Roche, 1998) Cho n nay, nhiu cụng trỡnh nghiờn cu v bnh to xng bt ton ó c thc hin nhiu quc gia trờn th gii C ch phõn t, c im lõm sng, cn lõm sng ó dn sỏng t Cỏc phng phỏp iu tr, chm súc nhm hn ch s tin trin bnh v nõng cao cht lng cuc sng ca ngi bnh cng ó c hng dn v ph bin mt cỏch rng rói 1.1.3 Lõm sng v phõn loi bnh to xng bt ton Biu hin lõm sng ph thuc vo tng týp ca bnh to xng bt ton Tựy theo tng ngi, bnh to xng bt ton cú th biu hin nh hoc nghiờm trng Xng b giũn, d góy l c im ca nhng ngi mc bnh to xng bt ton Mt s biu hin ca ngi mc bnh to xng bt ton l xng c to bt thng, ngi thp, Khp lng lo Cng mc mt cú mu xanh da tri hoc mu xỏm Khuụn mt cú hỡnh tam giỏc Lng ngc hỡnh thựng Cong vo ct sng Rng b giũn, d góy (to rng bt ton) Gim thớnh lc Bt thng kt cu ca da (da nhn mn v mng) Nhng du hiu c trng khỏc cú th ph bin nhiu týp bnh l chy mỏu cỏc tng (d gõy nờn nhng vt thõm tớm) v suy hụ hp Sillence v cng s (1979) ó chia bnh to xng bt ton thnh bn týp [17]: 1.1.3.1 Týp I: l th nh nht v hay gp nht Ngi bnh cú tm vúc bỡnh thng hoc tng i bỡnh thng, cú biu hin yu c, ct sng cú th b cong, cng mc mt cú th cú mu xanh hay mu tớm, góy xng thng xy trc tui dy thỡ 1.1.3.2 Týp II: l th nng nht Bnh nhõn thng cht sau sinh hoc ch sng c mt thi gian ngn ri lon chc nng hụ hp (thiu sn phi, góy xng sn), ngi bnh cú vúc dỏng nh, góy nhiu xng 1.1.3.3 Týp III: l th tng i nng, tr thng sinh ó cú góy xng Cng mc mt thng quỏ trng hoc cú mu xỏm, mu xanh, gim chc nng hụ hp, gim thớnh lc v bt thng v rng 1.1.3.4 Týp IV: l th trung gian gia týp I v III Cỏc bin dng xng mc nh n trung bỡnh Xp theo th t t nh n nng s l týp I, týp IV, týp III, týp II Mt s nghiờn cu mi ó phõn loi bnh to xng bt ton lm 11 týp [7], [27],[28],[29],[30],[31] Th bnh to xng bt ton c phõn loi tựy theo mc nghiờm trng ca bnh t bin mi gp 60% dng bnh nh nht (chim hn mt na cỏc ca bnh to xng bt ton) bao gm: bnh to xng bt ton loi c in- khụng bin dng (classic non deforming) vi cng mc mt mu xanh Hoc bnh to xng bt ton thuc loi bin th ph bin (common variable) vi cng mc mt bỡnh thng Hu ht (100%) bnh to xng bt ton cht chu sinh (perinatally lethal osteogenesis imperfecta) Gn 100% loi bnh to xng bt ton tin trin dng tng dn (progressively deforming osteogenesis imperfecta) l t bin mi Hỡnh 1.4 Hỡnh nh bt thng xng bnh nhõn to xng bt ton Hỡnh nh t bin gen tng hp collagen týp I nh hng lờn cu trỳc xng gõy giũn xng lm xng d góy Hỡnh 1.5 Hỡnh nh cng mc mt mu xanh bnh nhõn to xng bt ton Hỡnh nh t bin gen tng hp collagen týp I nh hng lờn cng mc mt biu hin cng mc mt mu xanh Hỡnh 1.6 Hỡnh nh to rng bt ton bnh nhõn to xng bt ton Hỡnh nh t bin gen tng hp collagen týp I nh hng lờn quỏ trỡnh to rng 10 Bng 1.1 c im ca bnh to xng bt ton [17] Týp I II-A II-B Tri Tri Tri/ln trờn NST trờn NST trờn NST thng thng thng T vong Nghiờm trc sinh trng Khụng Cú Him gp III IV c im Di truyn Mc nghiờm trng Nh Bin dng xng Cng mc mt Tm vúc S dch chuyn khp trờn NST thng trờn NST thng Va Cú Thng xuyờn Him gp Rt nng Nng Nng va Nh va Xanh en en Bỡnh c bit c bit thng nh nh Cú Cú Cú Cú Cha rừ Cha rừ Ph bin Xanh/ xỏm/ trng Rt nh 60% cỏc Mt chc nng nghe Tri/ln Nh va Góy xng bm sinh Tri/ln trng hp Bỡnh thng Nh cú thay i Cú th 42% cỏc trng hp To rng bt ton Cú th Cha rừ Cha rừ Cú Cú th Bin chng hụ hp Khụng Cú Cú Cú Khụng Khụng Cha rừ Cha rừ Cú Khụng Bin chng thn kinh Bng 1.1 trỡnh by s khỏc mt s c im di truyn, mc nghiờm trng ca bnh cng nh mc biu hin khỏc ca mt s triu chng ca bnh to xng bt ton cỏc týp khỏc PH LC Bng Trỡnh t mi khuch i gen COL1A1 STT Exon 5UTR Exon 10 11 Tờn mi Trỡnh t mi 5UTP2_P1 GACGGGAGTTTCTCCTCGGGG 5UTP2_P2 GAGTCTCCGGATCATCCACGT E1_P1 CGAGGTTGGGGTTGAACG E1_P2 CCGGGTCTAAGAGGCACACT Exon E2-5_P1 CAGGTGGGCATGGCTCTC 2-5 E2-5_P2 TCCTGTAGGATTCTTGCAACT Exon E6-9_P1 CACACCAGGAAGTGCATG 6-9 E6-9_P2 CTGAGTATCGTTCCCAAATGT Exon E10-14_P1 CTGACCTGCAACAATCC 10-14 E10-14_P2 CCCGTTAAGTCCACTGAGCAC Exon E15-18_P1 GATCCCTGAGCTCTGGAAGGG 15-18 E15-18_P2 CTCCTCTTCCTTTCCGGATTTC Exon E19-23_P1 TAAGTATCCTGCCAGGCTTCA 19-23 E19-23_P2 TAGGGAGGCAGAGAGGTATGA Exon E24-25_P1 GTCTGGGATGAGGCGTTCTGG 24-25 E24-25_P2 TAGGGAGGCTGAGGTCCAGAA Exon E26-29_P1 AGGGCCCAGCAAGAAGCACCT 26-29 E26-29_P2 TGGCTGTCTGATTAGCTAGGA Exon E30-32_P1 CAGACCCCAGGAGGAAGGACC E30-32 E30-32_P2 GATTCAAAGCAGGCAAGAATG Exon E33-38_P1 CCTCTCAGGAAACCCAGACAC 33-38 E33-38_P2 GACATAGGAACAGTCAGAGG Kớch thc (bp) 320 1227 283 968 1124 1326 1248 491 818 794 1268 12 13 14 15 16 Exon E39-41_P1 GAGTATCACCCGCCTCTCTGT 39-41 E39-41_P2 CCTGCCTGGGTGAAGTCCGAC Exon E42-45_P1 GCGGAGCCAAGGAGAACAGAT 42-45 E42-45_P2 TCGCCCTGTTCGCCTCTTCTCA Exon E46_P1 GTCCTGTCGGCCCTGTT 46 E46_P2 CAGAGAGGGAAGAGAGTGGG Exon E47-49_P1 GCTGGGGTTGCGGGCT 47-49 E47-49_P2 CATGTCCCTTCTGAGCACTGG Exon E50-51_P1 GGACCCTGGACAGGGAGGCC 50-51 E50-51_P2 CAGTTTGGGTTGCTTGTCTGT 1421 1174 1203 927 679 Bng Trỡnh t mi khuch i gen COL1A2 Kớch STT Exon Tờn mi Trỡnh t mi thc (bp) Exon CATTGTAGTTACATCAGTCTTACC E4_P2 GCTTCTTCTGCAGTGCATTACCT E5_P1 TCCACCCTACTTGCACATAGAAAGG E5_P2 GACAGGGCTCACAAAGAGAATGCG E6_P1 GGGAAGTTCTCCATTTCAAAGAGGTGT E6_P2 GCTAAATAAATGGCGTGGTAAAATGTGA Exon E7-9_P1 GTCTGACCCCAGCCAACACCAT 7-9 E7-9_P2 CCACGGATTTGAAAGTCAGTATATGT Exon 10 11 ATGGGTGCCATACTTTTGACCTGC E4_P1 Exon CTGAGAGTCTGCCCTCCAAGTGTA CAAGTCTTTTTTTTTCCTTTTGTATGTA E1_P2 E2-3_P2 Exon CCCCCATTCGCTCCCTCCT Exon 2- E2-3_P1 E1_P1 Exon E10-12_P1 CAGCAAGCATACCATAAGCAAC 10-12 E10-12_P2 GAGGTCATGCGGAATTTCAATCA Exon E13-16_P1 GAATCTAAGGGAGAAATTGGGGAGGA 13-16 E13-16_P2 AACACAGTTCCAATCTTTCACATCACA Exon E17-19_P1 TGCAGATAAAGAGATAATTACGAAACA 17-19 E17-19_P2 TGTTGAAACTCTCTTGCAGACAA Exon E20-23_P1 CTTGAGCTTCTCTTTACCTTGAC 20-23 E20-23_P2 TAAAGAAGGAAGTAATGCCAGGTGTGA Exon E24-26_P1 AAAAAGTCGGGGGAAAAGGTGCCTT 24-26 E24-26_P2 AGTGTGGTTCTTAGATGAATGCTATGTGA 491 1088 294 385 374 1346 833 1316 1304 1073 1229 12 13 14 15 16 Exon E27-29_P1 CTTTGAGACATCTTAAACTACCTGCTT 27-29 E27-29_P2 TGGCTCATTCTCTCCATCAGCAC Exon E30-31_P1 TGCACTCATGTAGATACTGCCAGGT 30-31 E30-31_P2 GGTCCACTGGAATCGGATTGCTGTT Exon E32-33_P1 TCTCCCTCCTTTCAATAGCCCAGCC 32-33 E32-33_P2 TTGACACTAGGAAGTTAGAAAATTCGGAT Exon E34-37_P1 FFAFTACCCTCCTTCTGAGAGTGGC 34-37 E34-37_P2 ACCACCCTTATGAGGTTATCAG Exon E38-39_P1 TGCGGGAATGATCCACTTGAAGAAA 38-39 E38-39_P2 GAAAAGCTGACTTCAGACCAGGAG Exon E40_P1 CATAAAGGAAGACAGGAGTTGC 40 E40_P2 CATCAACAAATAGATGCCACTTG 815 1557 1221 1475 1167 17 18 19 20 21 22 448 Exon E41-42_P1 CTCACAATCTTCAAGCCAACCTGTG 41-42 E41-42_P2 AAAGCCCATTCTTTGGCCTAAGCAA Exon E43-45_P1 AGGGTTCGTTACTGAGCATG 43-45 E43-45_P2 TGAAAATCCTTCTGAGCTGAAGGCC Exon E46-48_P1 GCAGATTACCAGCAGAGGTGAGAGC 46-48 E46-48_P2 TGGGGCTAACTTTAATGGGGTTGTC Exon E49-50_P1 GAACATGCTTCCGTGTGAAGCTC 49-50 E49-50_P2 GTCCAATCAATCCATCTTCTAATGTG Exon E51-52_P1 CCCTTTTCCTAAGCTTGGATCTGAG 51-52 E51-52_P2 TTGCCCACAATTTAAGCAAGTAG 1142 1098 1121 1472 782 B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI BI TH HNG CHU XáC ĐịNH Đột biến gen col1a1, col1a2 gây bệnh tạo x-ơng bất toàn (osteogenesis imperfecta) Chuyờn ngnh: Húa sinh Mó s: 62720112 LUN N TIN S Y HC Ng-ời h-ớng dẫn khoa học: GS.TS T Thnh Vn H NI - 2015 LI CM N Li u tiờn cho phộp tụi xin by t lũng tri õn sõu sc ti GS.TS T Thnh Vn, Phú Hiu Trng Trng i hc Y H Ni, Trng B mụn Húa sinh Trng i hc Y H Ni, Giỏm c Trung tõm Nghiờn cu Gen- Protein Trng i hc Y H Ni l ngi hng dn khoa hc, ngi thy ó tn tỡnh truyn t nhng kin thc v kinh nghim quý bỏu tụi cú th hon thnh c lun ỏn ny Tụi xin by t lũng bit n sõu sc n PGS.TS Trn Võn Khỏnh, Phú Giỏm c Trung tõm Nghiờn cu Gen- Protein Trng i hc Y H Ni, ngi thy ó nh hng, giỳp , ng viờn tụi sut quỏ trỡnh hc tp, to mi thun li cho tụi quỏ trỡnh thc hin ti v hon thnh lun ỏn ngy hụm Tụi xin by t lũng bit n sõu sc n PGS.TS Nguyn Th H, ngi thy ó giỳp , ng viờn tụi sut quỏ trỡnh hc v hon thnh lun ỏn Tụi xin by t lũng bit n chõn thnh n: PGS.TS Phm Thin Ngc, nguyờn Trng B mụn Húa sinh Trng i hc Y H Ni ó to mi iu kin, giỳp tụi quỏ trỡnh hc v hon thnh lun ỏn Cỏc CBVC Trung tõm nghiờn cu Gen-Protein trng i hc Y H Ni ó giỳp , to iu kin, chia s nhng kinh nghim quý bỏu tụi thc hin cỏc k thut nghiờn cu v hon thnh ti ny Tụi xin gi li cm n chõn thnh n: - Ban Giỏm hiu, Phũng o to Sau i hc, B mụn Húa sinh Trng i hc Y H Ni - Ban Giỏm hiu, cỏc Phũng ban chc nng, cỏc CBVC B mụn Húa sinh, i hc Y Dc Thnh ph H Chớ Minh ó to iu kin cho tụi sut quỏ trỡnh hc v nghiờn cu - Xin c gi li cm n n cỏc gia ỡnh bnh nhõn to xng bt ton ó giỳp tụi cú c s liu lun ỏn ny - Xin cm n bn bố, ng nghip ó giỳp , ng viờn tụi rt nhiu quỏ trỡnh hc Cui cựng, tụi xin ghi nh cụng n sinh thnh, nuụi dng v tỡnh yờu thng ca cha m tụi, cha m chng cựng s ng h, giỳp , ng viờn ca chng, hai v cỏc anh ch em gia ỡnh, nhng ngi ó luụn bờn tụi, l ch da vng chc tụi yờn tõm hc v hon thnh lun ỏn H Ni, ngy thỏng nm 2015 NCS Bựi Th Hng Chõu LI CAM OAN Tụi l Bựi Th Hng Chõu, nghiờn cu sinh khúa 30 Trng i hc Y H Ni, chuyờn ngnh Húa sinh, xin cam oan: õy l lun ỏn bn thõn tụi trc tip thc hin di s hng dn ca GS.TS T Thnh Vn Cụng trỡnh ny khụng trựng lp vi bt k nghiờn cu no khỏc ó c cụng b ti Vit Nam Cỏc s liu v thụng tin nghiờn cu l hon ton chớnh xỏc, trung thc v khỏch quan, ó c xỏc nhn v chp thun ca c s ni nghiờn cu Tụi xin hon ton chu trỏch nhim trc phỏp lut v nhng cam kt ny H Ni, ngy thỏng nm 2015 Ngi vit cam oan Bựi Th Hng Chõu DANH MC CC CH VIT TT OI Osteogenesis imperfecta (to xng bt ton) COL1A1 Collagen týp I alpha COL1A2 Collagen týp I alpha DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid mRNA Messenger ribonucleic acid (RNA thụng tin) NST Nhim sc th Kb Kilo base bp Base pair dNTP deoxyribonucleotide triphosphate ddNTP dideoxyribonucleotide triphosphate PCR Polymerase chain reaction RT-PCR Reverse transcription PCR (PCR mó ngc) EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TE Tris - EDTA TBE Tris borate EDTA Ala: alanin Gly: glycin Pro: prolin Arg: arginin His: histidin Ser: serin Asn: asparagin Ile: isoleucin Stop: mó kt thỳc Asp:aspartic Leu: leucin Thr: threonin Cys: cystein Lys: lysin Trp: tryptophan Gln: glutamin Met: methionin Tyr: tyrorin Glu: acid glutamic Phe: phenylalanin Val: valin MC LC T VN Chng 1: TNG QUAN 1.1 Bnh to xng bt ton 1.1.1 Lch s nghiờn cu bnh to xng bt ton trờn th gii 1.1.2 c im cu to v quỏ trỡnh chuyn húa xng 1.1.3 Lõm sng v phõn loi bnh to xng bt ton 1.1.4 Cn lõm sng 11 1.1.5 Tn sut mc bnh to xng bt ton 14 1.1.6 Di truyn hc bnh to xng bt ton 14 1.1.7 Chn oỏn 16 1.1.8 iu tr bnh to xng bt ton 17 1.2 C ch phõn t bnh to xng bt ton 20 1.2.1 Cu trỳc, chc nng ca protein collagen týp I 20 1.2.2 V trớ, cu trỳc, chc nng ca gen COL1A1, COL1A2 23 1.3 Phng phỏp phỏt hin t bin gen COL1A1, COL1A2 30 1.3.1 Phng phỏp PCR 30 1.3.2 Phng phỏp gii trỡnh t gen 31 1.3.3 K thut SSCP 33 1.4 Tỡnh hỡnh nghiờn cu trờn th gii v ti Vit Nam 33 1.4.1 Trờn th gii 33 1.4.2 Vit Nam 34 Chng 2: I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 35 2.1 i tng nghiờn cu 35 2.1.1 Nhúm bnh 35 2.1.2 Nhúm chng 36 2.2 Trang thit b, dng c v húa cht 36 2.2.1 Trang thit b nghiờn cu 36 2.2.2 Dng c nghiờn cu 37 2.2.3 Húa cht nghiờn cu 37 2.3 Phng phỏp nghiờn cu 40 2.3.1 Thit k nghiờn cu 40 2.3.2 Ni dung nghiờn cu 41 2.3.3 a im nghiờn cu 41 2.3.4 Quy trỡnh v cỏc k thut s dng nghiờn cu 41 2.4 Vn o c nghiờn cu 49 Chng 3: KT QU NGHIấN CU 50 3.1 Kt qu tỏch chit DNA 50 3.2 Kt qu xỏc nh t bin gen COL1A1, COL1A2 trờn nhúm bnh nhõn to xng bt ton 52 3.2.1 Kt qu xỏc nh t bin gen COL1A1 52 3.2.2 Kt qu xỏc nh t bin gen COL1A2 61 3.2.3 Kt qu t bin trờn gen COL1A1, COL1A2 63 3.2.4 Kt qu cỏc im t bin ti vựng exon, intron trờn gen COL1A1, COL1A2 64 3.3 Kt qu xỏc nh t bin gen COL1A1, COL1A2 trờn b m ca bnh nhõn to xng bt ton ó phỏt hin t bin gen COL1A1 hoc COL1A2 67 Chng 4: BN LUN 80 Kt qu tỏch chit DNA 80 Kt qu xỏc nh t bin gen COL1A1, COL1A2 trờn nhúm bnh nhõn to xng bt ton 81 Kt qu xỏc nh t bin ca b m bnh nhõn to xng bt ton ó phỏt hin t bin gen COL1A1 hoc COL1A2 96 KT LUN 108 CC CễNG TRèNH NGHIấN CU C CễNG B Cể LIấN QUAN N NI DUNG LUN N TI LIU THAM KHO PH LC DANH MC BNG Bng 1.1 c im ca bnh to xng bt ton 10 Bng 1.2 t bin gen COL1A1, COL1A2 trờn bnh nhõn to xng bt ton 29 Bng 3.1 Kt qu o nng v tinh sch ca cỏc mu DNA tỏch chit t mỏu ngoi vi ca bnh nhõn 51 Bng 3.2 t bin ca gen COL1A1 v gen COL1A2 63 Bng 3.3 T l t bin exon v intron trờn gen COL1A1, COL1A2 64 Bng 3.4 Cỏc im t bin vựng exon gen COL1A1, COL1A2 65 Bng 3.5 Vựng intron xy t bin v trớ ni gen COL1A1, COL1A2 66 Bng 3.6 Kt qu xỏc nh cỏc v trớ t bin trờn gen COL1A1, COL1A2 67 Bng 3.7 t bin gen COL1A1, COL1A2 b m bnh nhõn to xng bt ton 79 DANH MC BIU Biu 1.1 T l cỏc t bin trờn gen COL1A1 gõy bnh to xng bt ton 26 Biu 3.1 Phõn b t bin ca gen COL1A1 v gen COL1A2 64 Biu 3.2 Phõn b im t bin vựng exon ca gen COL1A1 v COL1A2 65 DANH MC HèNH NH Hỡnh 1.1 Phn cũn li ca b xng mt tr b to xng bt ton vi hỡnh nh xng s Tam OShanter, to rng bt ton, xng mng v bin dng Hỡnh 1.2 Chu k tỏi to xng Hỡnh 1.3 Cu trỳc ca collagen trng thnh týp I Hỡnh 1.4 Hỡnh nh bt thng xng bnh nhõn to xng bt ton Hỡnh 1.5 Hỡnh nh cng mc mt mu xanh bnh nhõn to xng bt ton Hỡnh 1.6 Hỡnh nh to rng bt ton bnh nhõn to xng bt ton Hỡnh 1.7 Hỡnh nh mụ bnh hc ca to xng bt ton 12 Hỡnh 1.8 S phõn chia bố xng c quan sỏt di ỏnh sỏng phõn cc 13 Hỡnh 1.9 S di truyn tri bnh to xng bt ton 15 Hỡnh 1.10 Hỡnh nh siờu õm thai 20 tun 17 Hỡnh 1.11 Cu trỳc phõn t collagen bỡnh thng v bt thng 21 Hỡnh 1.12 V trớ ca gen COL1A1 trờn cỏnh di nhim sc th 17 23 Hỡnh 1.13 V trớ ca gen COL1A2 trờn cỏnh di nhim sc th 24 Hỡnh 1.14 Cu trỳc ca gen COL1A1 24 Hỡnh 1.15 T l t bin trờn cỏc gen gõy bnh to xng bt ton 25 Hỡnh 1.16 Vai trũ ca protein hnRNPs v SR quỏ trỡnh hon thin mRNA 28 Hỡnh 1.17 Hỡnh nh cỏc t bin gen COL1A1 30 Hỡnh 1.18 Cỏc bc c bn ca phn ng PCR 31 Hỡnh 2.1 S thit k nghiờn cu Error! Bookmark not defined Hỡnh 3.1 Kt qu xỏc nh nng v tinh sch DNA ca bnh nhõn to xng bt ton mó s OI32 trờn mỏy Nano-Drop 50 Hỡnh 3.2 Hỡnh nh sn phm PCR on gen t exon 39 n exon 41 ca gen COL1A1 52 Hỡnh 3.3 Hỡnh nh t bin thay th nucleotid G thnh nucleotid T 54 Hỡnh 3.4 Hỡnh nh t bin thay th nucleotid G thnh nucleotid A 55 Hỡnh 3.5 Hỡnh nh t bin to mó kt thỳc sm 57 Hỡnh 3.6 Hỡnh nh t bin mt nucleotid 58 Hỡnh 3.7 Hỡnh nh t bin ti v trớ ni ca bnh nhõn mó s OI20 59 Hỡnh 3.8 Hỡnh nh t bin ti v trớ ni ca bnh nhõn mó s OI43 60 Hỡnh 3.9 Hỡnh nh t bin ti v trớ ni ca bnh nhõn mó s OI46 60 Hỡnh 3.10 Hỡnh nh sn phm PCR on gen t exon 46 n exon 48 ca gen COL1A2 61 Hỡnh 3.11 Hỡnh nh t bin thay th nucleotid C thnh nucleotid T 62 Hỡnh 3.12 S gia ỡnh bnh nhõn mó s OI04, OI08 (trc phõn tớch gen) 68 Hỡnh 3.13 Hỡnh nh gii trỡnh t gen COL1A1 ca b m gia ỡnh bnh nhõn mó s OI04, OI08 69 Hỡnh 3.14 S gia ỡnh bnh nhõn mó s OI04, OI08 (sau phõn tớch gen) 70 Hỡnh 3.15 S gia ỡnh mó s OI20 (trc phõn tớch gen) 71 Hỡnh 3.16 Hỡnh nh gii trỡnh t gen COL1A1 ca b m bnh nhõn mó s OI20 72 Hỡnh 3.17 S gia ỡnh mó s OI20 (sau phõn tớch gen) 73 Hỡnh 3.18 S gia ỡnh mó s OI43 (trc phõn tớch gen) 74 Hỡnh 3.19 Hỡnh nh gii trỡnh t gen COL1A1 ca b m bnh nhõn mó s OI43 75 Hỡnh 3.20 S gia ỡnh mó s OI43 (sau phõn tớch gen) 76 Hỡnh 3.21 S gia ỡnh mó s OI03 (trc phõn tớch gen) 77 Hỡnh 3.22 Hỡnh nh gii trỡnh t gen COL1A1 ca b m bnh nhõn mó s OI03 78 Hỡnh 3.23 S gia ỡnh mó s OI03 (sau phõn tớch gen) 79 4,6,7,9,12,13,15,17,21,23-26,28,30,31,40,50,52-62,64,65,68-79 1-3,5,8,10,11,14,16,18-20,22,27,29,32-39,41-49,51,63,66,67,80138 - 43