Nghiên cứu tác dụng chống lại số vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đƣờng hô hấp ngƣời dịch lên men táo mèo (Docynia indica) Nguyễn Thị Minh Thƣ Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Ngƣời hƣớng dẫn: TS Bùi Thị Việt Hà Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Trình bày tổng quan bệnh nhiễm khuẩn hô hấp ngƣời, chất kháng sinh, táo mèo dịch chiết từ táo mèo Sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu nhƣ: Phƣơng pháp lên men táo mèo; Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn; Xác định hoạt tính kháng sinh enzym; Bảo quản giống; Xác định sinh khối phƣơng pháp đo mật độ quang học-OD; Xác định yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh trƣởng hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn; Tách chiết hợp chất dịch lên men vi khuẩn giấm táo mèo; Khảo sát sơ thành phần hóa học dịch chiết táo mèo phân đoạn kháng khuẩn để làm rõ khả chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh gây nhiễm đƣờng hô hấp ngƣời dịch lên men táo mèo Trình bày kết đạt đƣợc: hoạt tính kháng dịch lên men táo mèo; tuyển chọn chủng vi sinh; điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trƣởng hoạt tính kháng sinh; tách chiết chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo dịch lên men vi khuẩn Keywords: Vi sinh vật học; Vi khuẩn kháng kháng sinh; Viêm đƣờng hô hấp; Dịch lên men; Táo mèo Content MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp cấp bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu số 10 bệnh lý nhiễm khuẩn nƣớc có thu nhập thấp Chƣơng trình toàn cầu phòng chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp đƣợc WHO phát động, Việt Nam chƣơng trình đƣợc triển khai từ năm 1984 Kiểm soát phòng chống bệnh đƣợc ƣu tiên hàng đầu nƣớc phát triển có Việt Nam, nhƣng chịu tác động bất lợi phát triển lan truyền tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh Bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp cấp gồm nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp dƣới Tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp chiếm phần lớn so với bệnh hô hấp khác, bệnh thƣờng gặp, mắc hàng năm, theo mùa nhƣng gây nhiều biến chứng nặng nhƣ viêm tai giữa, viêm màng não, áp xe não, áp xe sau thành họng Khi mắc viêm đƣờng hô hấp lây nhiễm xuống đƣờng hô hấp dƣới gây viêm khí, phế quản viêm phổi nặng Có thể thấy bệnh gây ảnh hƣởng đáng kể đến sức khỏe đặc biệt với trẻ em, ngƣời già gây thiệt hại kinh tế Moraxella catarrhalis nguyên gây phần lớn trƣờng hợp mắc bệnh nhiễm khuẩn hô hấp, đặc biệt đƣợc coi nhƣ tác nhân gây bệnh viêm tai phổ biến thứ ba sau Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Trong M catarrhalis kháng lại hầu hết chất kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam, nhạy cảm với cephalosporin hệ 2, ciprofloxacin thuộc họ quinolon Thực trạng kháng kháng sinh M catarrhalis nói riêng, vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung đem đến gánh nặng kinh tế, xã hội việc thay kháng sinh hệ cũ kháng sinh hệ đắt tiền Với phát triển ngành công nghệ sinh học đại đem lại triển vọng lớn cho Y học tìm kiếm thêm hợp chất tự nhiên hỗ trợ cho việc phòng điều trị bệnh Các hợp chất góp phần giảm tác dụng phụ không mong muốn hợp chất tổng hợp, giảm gánh nặng mặt kinh tế cho ngƣời bệnh xã hội Từ ngàn xƣa, ông cha ta lƣu truyền nhiều thuốc dân gian từ cây, cỏ chữa bệnh đƣờng hô hấp nhiều bệnh khác Hiện táo mèo sản phẩm chế biến từ táo mèo đặc biệt giấm táo mèo đƣợc lan truyền rộng rãi cộng đồng nhƣ thuốc chống béo phì, tăng cƣờng miễn dịch, kháng khuẩn, giảm chứng suy hô hấp Trên giới táo mèo phân bố Trung Quốc, Ấn Độ, Myanma, Việt Nam tập trung tỉnh Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu Lâm Đồng Năm 2010 có nghiên cứu sơ với kết khả quan tác dụng kháng khuẩn, có M catarrhalis gây bệnh hô hấp dịch lên men táo mèo mở hƣớng nghiên cứu nhƣ định hƣớng ứng dụng dịch lên men táo mèo việc hỗ trợ nâng cao thể trạng cho ngƣời Với mục tiêu góp phần chứng minh làm sáng tỏ vai trò chủ đạo tác nhân có dịch lên men táo mèo theo kinh nghiệm dân gian, đặc biệt công dụng kháng vi khuẩn gây viêm đƣờng hô hấp kháng kháng sinh thông dụng, tiến hành thực đề tài: “ Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đƣờng hô hấp ngƣời dịch lên men táo mèo (Docynia indica)” Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƢỜI Nhiễm khuẩn hô hấp tình trạng phận thuộc máy hô hấp bị viêm nhiễm vi khuẩn virut gây 1.2.1 Đặc điểm hình thái nuôi cấy Moraxella catarrhalis lần đƣợc mô tả vào năm 1896, gọi Micrococcus catarrhalis sau đổi thành Neisseria catarrhalis đến năm 1984 đổi Moraxella (Branhamella) catarrhalis thuộc chi Moraxella, họ Moraxellaceae [27] 1.2.2 Vai trò Moraxella catarrhalis bệnh nhiễm khuẩn hô hấp Nhiều nghiên cứu giới nƣớc M catarrhalis tác nhân gây bệnh quan trọng đƣờng hô hấp  Các nghiên cứu giới: Trên giới có nhiều nghiên cứu M catarrhalis nguyên nhân phổ biến gây bệnh viêm đƣờng hô hấp M catarrhalis vi khuẩn cộng sinh phổ biến vòm họng trẻ em [41], nghiên cứu 120 trẻ sơ sinh cho thấy 66% trẻ tuổi mang vi khuẩn, tăng lên đến 77,5% trẻ hai năm tuổi, điều cho thấy trẻ em có nguy cao bị bệnh đƣờng hô hấp, đặc biệt hô hấp [20]  Các nghiên cứu Việt Nam Việt Nam với đặc điểm khí hậu nóng ẩm, năm gần lại chịu tác động mạnh biến đổi khí hậu tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây bệnh phát triển Trên giới, Việt Nam quốc gia có tỷ lệ bệnh nhiễm khuẩn cao nhất, nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp chiếm tỷ lệ cao 1.2.3 Tính kháng kháng sinh Moraxella catarrhalis 1.3 CHẤT KHÁNG SINH 1.3.1 Khái niệm Chất kháng sinh chất hữu có nguồn gốc từ sinh vật (vi sinh vật, thực vật, động vật), có khả diệt kìm hãm phát triển vi sinh vật khác, chất kháng sinh thƣờng có tác dụng mạnh nồng độ thấp đặc hiệu lên vi sinh vật khác [49] 1.3.2 Chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn 1.3.2.1 Khái quát lịch sử nghiên cứu Những năm 1940-1959 đƣợc coi thời kỳ hoàng kim chất kháng sinh, hàng loạt chất đƣợc tách chiết xác định: actonomixin (Waksman, 1940), chloramphenicol (Erhlich, 1947), chlotetracylin (Dugar, 1948), tetracyclin (Lloyd Conover, 1955), nystatin (1957) dùng điều trị bệnh nhiễm nấm Ngày nay, số lƣợng chất kháng sinh đƣợc phát lên tới 10.000 chất, hàng trăm chất đƣợc dùng y học thực tiễn Năm 1981, amoxicillin đời, kháng sinh bán tổng hợp lần đƣợc bán vào năm 1998 dƣới tên thƣơng mại amoxicillin, amoxil trimox 1.3.2.2 Phân loại Chất kháng sinh đƣợc phân loại theo nhiều cách khác nhau, tùy theo mục đích nghiên cứu cách sử dụng chất kháng sinh  Bacteriocin Hiện ngƣời phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh” tình trạng kháng thuốc, xuất chủng vi khuẩn đa kháng thuốc, thiếu hụt nhóm kháng sinh [35] Trong bối cảnh song song với việc phát triển chất kháng sinh phổ rộng việc nghiên cứu bacteriocin vấn đề đáng đƣợc quan tâm 1.3.3 Chất kháng khuẩn thực vật 1.3.3.1 Khái niệm Kháng khuẩn thực vật tên gọi chung hợp chất hữu có thực vật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm phát triển vi sinh vật Các chất kháng khuẩn thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên loài vi sinh vật khác nồng độ thƣờng nhỏ [50] Những tính chất thuộc nhiều cấu trúc hóa học khác nhƣ: ankaloit, tannin, flavonoit, tinh dầu 1.3.4 Cơ chế kháng khuẩn Chất kháng sinh có thành phần cấu trúc hóa học đặc trƣng nên chế tác dụng chung vi sinh vật Đặc tính chế phụ thuộc vào chất hóa học chất, nồng độ cấu trúc vi sinh vật Nhìn chung chất kháng sinh có chế tác dụng nhƣ sau: 1.4 CÂY TÁO MÈO VÀ DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ TÁO MÈO 1.4.1 Đặc điểm thực vật học Cây táo mèo hay gọi chua chát, tên khoa học Docynia indica, thuộc họ hoa hồng (Rosaceae) 1.4.2 Sự phân bố Cây táo mèo ƣa sáng, ƣa khí hậu ẩm mát vùng nhiệt đới núi cao, nhiệt độ trung bình năm 15- 180C, lƣợng mƣa 1.500 – 3.800mm/năm độ ẩm trung bình khoảng 85% 1.4.3 Tác dụng dƣợc lý Quả táo mèo đƣợc dùng phổ biến Đông y, dùng thay hay tƣơng tự nhƣ vị thuốc sơn tra với nhiều tác dụng nhƣ làm thuốc bổ tỳ, vị, kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon, dễ tiêu chống đầy bụng, ợ chua, giúp tăng cƣờng miễm dịch, giảm cholesterol, hạ mỡ máu, đại tiện xuất huyết, chữa toàn thân đau mỏi dƣới dạng thuốc sắc, cao lỏng tán bột uống Điều đáng ý táo mèo có tác dụng hạ huyết áp nhờ làm giãn mạch ngoại vi Mặt khác giúp hạ mỡ máu, chống huyết khối làm giãn động mạch vành, cải thiện sức co bóp tim, phòng chống tích cực biến chứng cao huyết áp gây Ngoài ra, chúng có tác dụng ức chế trực khuẩn: thƣơng hàn, bạch hầu, lị, tụ cầu vàng, giảm chứng suy hô hấp… 1.4.4 Thành phần hóa học Theo nghiên cứu Đinh Thị Kim Chung [5] cho biết khối lƣợng trung bình táo mèo vùng Yên Bái Lào Cai 20,5 ± 0,5 g, nƣớc chiếm tỷ lệ 84,6%, đƣờng 4,81%, axit tổng số 1,47% pH 2,9 Theo kết khảo sát định tính dịch chiết từ táo mèo thấy có đủ nhóm hợp chất nhƣ: Flavonoit, tannin, ankaloit, glycozit có tác dụng kháng khuẩn có hiệu Giấm táo chứa axit malic, axit acetic, hàm lƣợng enzym cao tốt cho tiêu hóa 1.4.5 Tình hình nghiên cứu táo mèo Việt Nam Hiện giới chƣa có nhiều nghiên cứu táo mèo Docynia indica, đặc biệt tác dụng kháng khuẩn táo mèo Tại Việt Nam, nghiên cứu Nguyễn Thị Thanh Loan [15] cho thấy tác dụng chống béo phì giảm trọng luợng dịch chiết Táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne mô hình chuột béo phì thực nghiệm Theo Vũ Thị Hạnh Tâm [20] nghiên cứu ghi nhận vai trò hạ lipit đƣờng huyết dịch chiết táo mèo chuột Hoàng Thị Minh Tân [21] táo mèo có khả chống rối loạn trao đổi gluxit lipit Vũ Thị Huê, Bùi Thị Việt Hà [49] có nghiên cứu sơ ghi nhận tác dụng kháng khuẩn dịch lên men táo mèo Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Nguồn giống Các chủng Vi sinh vật kiểm định lấy từ Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Viện VSV Công Nghệ Sinh học - ĐH Quốc gia Hà Nội, gồm chủng; Shigella flexneri Klebsiella VTCC-B-814;E coli VTCC-B-883; Salmolella typhi VTCC-B-897; Vibrio VTCC-B652, Moraxella catarrhalis ATCC 43617 Chủng Moraxella catarrhalis kháng kháng sinh, Staphylococcus aureus phân lập Bệnh viện Tai – Mũi – Họng Trung ƣơng 2.1.2 Hóa chất thiết bị • Hóa chất - Các thành phần hóa chất dùng làm môi trƣờng - Các hóa chất dùng tách chiết hợp chất thiên nhiên: DMSO, silicagel, florisil 100- 200 U.S.mesh,ethylaxetat, metanol, n-Butanol,… • Thiết bị: tủ ấm, máy lắc ổn nhiệt, máy đo pH, máy ly tâm lạnh, máy cô chân không, thiết bị đông khô, hệ thống chiết pha rắn, cột sắc ký… 2.2 PHƢƠNG PHÁP 2.2.1 Phƣơng pháp lên men táo mèo Sử dụng 1kg táo mèo tƣơi, rửa sạch, cắt thành phần nhỏ, để nguyên hạt, cho vào bình thủy tinh Bổ sung lít nƣớc đun sôi ấm (khoảng 400C), 300 g đƣờng, 30 g muối , đậy kín bình vải Sau tháng thu dịch lên men táo mèo – giấm táo mèo 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Dịch lên men táo mèo thu đƣợc nhỏ vào giếng thạch đĩa petri có chứa sẵn vi khuẩn Moraxalla catarrhalis Để tủ lạnh từ 4-8 giờ, sau để vào tủ ấm Kết sau 72 cho thấy giấm táo mèo có khả ức chế sinh trƣởng vi khuẩn M catarrhalis Vì vậy, tiến hành phân lập vi khuẩn từ dịch lên men táo mèo Pha loãng dịch giấm nƣớc cất khử trùng theo hệ thập phân nồng độ khác từ 10-1 đến 10-6 tran đĩa petri chứa môi trƣờng thạch thƣờng để tìm chủng vi khuẩn có hoạt tính mong muốn 2.2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh enzym 2.2.3.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn phƣơng pháp đục lỗ thạch 2.2.3.2 Xác định hoạt tính enzym 2.2.4 Bảo quản giống Vi khuẩn đƣợc nuôi ống thạch nghiêng thạch thƣờng, nuôi nhiệt độ phòng Sau khoảng 10-14 ngày vi khuẩn mọc tốt cất vào tủ mát nhiệt độ 4-6oC Sau 1-2 tháng cấy truyền lại lần 2.2.5 Xác định sinh khối phƣơng pháp đo mật độ quang học-OD Số lƣợng tế bào VSV dịch nuôi xác định gián tiếp cách đo mật độ quang học Dịch nuôi đƣợc pha loãng lần, đo OD bƣớc sóng 620nm 2.2.6 Xác định yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh trƣởng hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Vi khuẩn đƣợc lên men môi trƣờng dịch thể bình nón dung tích 250ml với thành phần yếu tố liên quan nhƣ sau: • Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp • Ảnh hƣởng pH • Ảnh hƣởng nguồn cacbon • Ảnh hƣởng nguồn nitơ • Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 2.2.7 Tách chiết hợp chất dịch lên men vi khuẩn dịch lên men táo mèo [18] 2.2.7.1 Phƣơng pháp đông khô Đông khô trình mà nƣớc đƣợc lấy khỏi mẫu mẫu trạng thái lạnh sâu Ở mẫu đƣơ ̣c làm l ạnh môi trƣờng chân không Thiết bị đông khô hút nƣớc cuối mẫu đƣợc làm khô đến mức định (mẫu đƣợc hàn kín môi trƣờng chứa mẫu chân không) Đây phƣơng pháp phổ biến có hiệu cao dùng để bảo quản đối tƣợng vi sinh vật khác nhƣ nấm sợi, nấm men, vi khuẩn số virut nhƣng cũng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng để đƣa dich ̣ chiế t thành da ̣ng cao chiế t 2.2.7.2 Phƣơng pháp sắc ký cột 2.2.7.3 Phƣơng pháp kiể m tra phân đoa ̣n bằ ng sắ c ký bản mỏng 2.2.8 Khảo sát sơ thành phần hóa học dịch chiết táo mèo phân đoạn kháng khuẩn 2.2.8.1 Thử định tính flavonoit 2.2.8.2 Thử định tính tannin 2.2.8.3 Thử định tính ankaloit 2.2.8.4 Thử định tính glicozit Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 HOẠT TÍNH KHÁNG Moraxella catarrhalis CỦA DỊCH LÊN MEN QUẢ TÁO MÈO Quả táo mèo tƣơi lên men sau tháng xuất lớp màng trắng, dịch có màu vàng trong, mùi thơm, vị chua thanh, pH 4,3 Tiến hành thu dịch, thử hoạt tính kháng M catarrhalis kháng kháng sinh, thấy dung dịch có hoạt tính kháng kháng với kích thƣớc vòng kháng 20mm Dùng nƣớc cất pha loãng dịch lên men táo mèo theo tỷ lệ thể tích (ml) khác nhau: V1: V2= 1: 1, 1:2, 1:3, 1:4 Trong V1 thể tích dịch lên men táo mèo, V2 thể tích nƣớc cất Sau đem kiểm tra hoạt tính kháng M catarrhalis Kết nhƣ sau: 3.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT 3.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật kháng Moraxella catarrhalis Tiến hành phân lập vi khuẩn từ mẫu dịch lên men táo mèo môi trƣờng thạch thƣờng thu đƣợc chủng vi sinh vật, có chủng có hoạt tính kháng khuẩn Moraxella catarrhalis (bảng 3.2) đặc điểm sau: TM2.2: Khuẩn lạc nhỏ, màu vàng, có vành phóng xạ xung quanh, bóng- nhầy, bên đục phía khuẩn lạc TM5.1: Khuẩn lạc nhỏ, màu vàng, bề mặt nhầy – bóng, tròn, lồi có kích thƣớc nhỏ TM5.2: Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng, bề mặt trơn, mép viền, có nhân trắng nhỏ TM5.4: Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng, tròn, bề mặt trơn, không bóng Bảng 3.3: Hoạt tính kháng khuẩn chủng TM5.2 lên chủng vi khuẩn kiểm định E coli VTCC-B-883 897 Staphylococus aureus Salmolella typhi VTCC-B- Shigella flexneri HTKK (D- d mm) 12 10 16 3.2.2 Phân loại chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 3.1 Vị trí phân loại chủng TM5.2 với loài quan hệ họ hàng gần 3.3 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO SINH TRƢỞNG VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG TM5.2 3.3.1 Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp 3.3.2 Nguồn cacbon thích hợp 3.3.3 Nguồn nitơ thích hợp 3.3.4 Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp 3.3.5 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 3.3.6 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ DỊCH LÊN MEN VI KHUẨN 3.4.1 Khảo sát hệ dung môi rửa giải pha rắn hấp phụ 3.4.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn dịch lên men vi khuẩn 3.4.3 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo 3.4.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao dịch chiết táo mèo Dịch táo mèo đƣợc cô quay chân không thành cao sau lấy cao thử hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis mức nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0,1; 1; 10; 100 mg/ml Kết thu nhận đƣợc nhƣ sau: 3.4.3.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo Sau khẳng định cao dịch chiết táo mèo có hoạt tính kháng khuẩn, tiến hành đƣa cao lên cột sắc ký tách phân đoạn với chất hấp phụ hệ dung môi rửa giải nhƣ lựa chọn Các phân đoạn thu đƣợc ống nghiệm đem tiến hành kiểm tra sắc ký mỏng để thu gom phân đoạn có kết triển khai tƣơng tự hệ dung môi có kết giống Thu đƣợc 15 phân đoạn, cất chân không riêng phân đoạn 400C để đuổi dung môi phần lại đƣợc lấy đem thử hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis Cuối thu đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis ký hiệu : PĐ1, PĐ2, PĐ3 3.4.4 Sắc ký mỏng phân đoạn kháng khuẩn dịch lên men chủng TM5.2 dịch chiết táo mèo 3.5 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN KẾT LUẬN Sau tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn Moraxella catarrhalis kháng kháng sinh gây viêm đƣờng hô hấp dịch lên men táo mèo, thu đƣợc số kết sau: Dịch lên men táo mèo có khả kháng M catarrhalis kháng kháng sinh pH nồng độ chất dịch ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng M catarrhalis Phân lập, tuyển chọn đƣợc chủng TM5.2 từ dịch lên men táo mèo có hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis mạnh ổn định Chủng TM5.2 thuộc loài Bacillus subtilis, chi Bacillus, có khả sinh trƣởng tốt môi trƣờng LB, nguồn cacbon tinh bột, nguồn nitơ cao nấm men, pH 7, nhiệt độ 300C, thời gian lên men thích hợp 48- 72 Tách chiết đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng M catarrhalis từ dịch lên men chủng TM5.2 Từ dịch chiết táo mèo tách chiết đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis Các phân đoạn có hoạt tính kháng M catarrhalis từ dịch lên men chủng TM5.2 dịch chiết táo mèo chứa nhiều chất khác 6 Quả táo mèo, phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết táo mèo có đầy đủ nhóm chất nhƣ flavonoit, tannin, ankaloit, glycozit Hoạt tính kháng khuẩn chủng M catarrhalis phân đoạn kháng khuẩn thu đƣợc từ dịch chiết táo mèo liên quan đến hàm lƣợng có mặt số chất thuộc nhóm nhóm flavonoit ankaloit KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn khác dịch lên men táo mèo có khả kháng M catarrhalis kháng kháng sinh Nghiên cứu chất hóa học chất kháng M catarrhalis kháng kháng sinh thu đƣợc từ dịch lên men chủng TM5.2 từ dịch chiết táo mèo References I TÀI LIỆU VIỆT NAM Nguyễn Văn Bản (1996), Phân tích sàng lọc hóa thực vật, Tập II, tr 132-169 Nguyễn Đình Bảng (1992), “Vấn đề kháng sinh Tai Mũi Họng” , Chuyên đề Tai Mũi Họng, tr 20-24 Nguyễn Thị Ngọc Bích (2007), Nghiên cứu giá trị phƣơng pháp cấy đờm tìm vi khuẩn chẩn đoán nguyên nhân nhiễm khuẩn hô hấp, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ chuyên khoa II, Học viên Quân y Phạm Văn Ca (2005), “Tần suất bắt gặp Moraxella catarrhalis vi khuẩn gây bệnh mức độ kháng thuốc Việt Nam”, Tạp chí Y học dự phòng, 15(1), tr 55 – 59 Đinh Thị Kim Chung (2007), “Ảnh hƣởng số yếu tố tới trình lên men vang tóa mèo (Docynia indica)”, Tạp chí KH&CN, 45(2), tr 87 – 92 Danh lục loài Thực vật (2006), Tập II Bùi Xuân Đồng (2000), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Đào Đình Đức, Lê Đăng Hà, Phạm Văn Ca (1996), Tình hình nhiễm khuẩn kháng kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh bệnh viện Bạch Mai năm (1990-1994), Một số công trình nghiên cứu độ nhạy cảm vi khuẩn với thuốc khánh sinh (1994-1995), tr 30-32 9 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sỹ sinh học 10 Nguyễn Minh Hải, Nguyễn Tiền (2007), “ Nghiên cứu nguyên vi khuẩn đờm tính nhạy cảm kháng sinh chúng đợt bùng phát COPD”, Tạp chí y học lâm sàng, 108 11 Trần Thị Thu Hằng (2009), Thuốc sử dụng hóa trị liệu, Dƣợc lực học, Nxb Phƣơng Đông, tr 681 – 685 12 Phạm Thị Hóa, Lê Kim Phụng, Lƣơng Lệ Nhi (2010), Hợp chất thiên nhiên thuốc y học cổ truyền, Dƣợc học cổ truyền, Bộ môn dƣợc học cổ truyền, tr 11 – 24 13 Nguyễn Hồng Lâm, (2009), Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn Moraxella catarrhalis khả măng gây bệnh chúng bệnh viện Tai Mũi Họng Trung Ƣơng từ tháng năm 2007 đến tháng năm 2008, Khóa luận tốt nghiệp, trƣờng Đại hoc Khoa Học Tự nhiên 14 Phạm Thùy Linh (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nicin enterocin) dùng bảo quản nông sản thực phẩm, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 15 Nguyễn Thị Thanh Loan cộng (2011), “ Tác dụng chống béo phì giảm trọng lƣợng dịch chiết táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne mô hình chuột béo phì thực nghiệm”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, 27, tr 125 – 133 16 Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học 17 Vũ Văn Ngũ (1987), Các tác nhân gây viêm cấp tính đƣờng hô hấp dƣới trẻ em dƣới tuổi, Nxb Y học, tr 3-7 18 Nguyễn Phi Kim Phụng (2007), Phƣơng pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh 19 Đỗ Quyết (2010), “Nguyên nhân vi khuẩn giai đoạn đầu sau đợt bùng phát bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính”, Tạp chí y – dƣợc học quân sự, 20 Vũ Thị Hạnh Tâm (2011), Nghiên cứu tác dụng hạ lipid đƣờng huyết dịch chiết táo mèo (Docynia indica (Wall.) Dene) mô hình chuột thực nghiệm, Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội 21 Hoàng Thị Minh Tân (2009), Nghiên cứu tách chiết số hợp chất tự nhiên từ táo mèo có tác dụng chống rối loạn trao đổi gluxit, lipid, Luận văn thạc sỹ sinh học 22 WHO (2008), Gánh nặng bệnh tật toàn cầu: cập nhật 2004 II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 23 Akinjogunla, O.J and Eghafona, N.O (2011), “Prevalence, Haemolytic activities and flouroquinolones susceptibility profiles of Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae associated with acut otitis media”, Nature and Science, 9(6), pp 85 – 92 24 Austria R (1981), “Pneumococcus: The first one hundred years”, Rev Infect, 3, pp – 183 25 Borris, R.P (1996), “ Natural products research: perspective from a major pharmaceutical company”, J Ethnopharmacol, 51, pp 29 – 38 26 Catlin BW (1990), “Branhamella catarrhalis: an organism gaining respect as a pathogen”, Clinical Microbiology Reviews, 3, pp 293 – 320 27 Cees M Verduin, Cees Hol, Andre Fleer, Hans van Dijk, and Alexvan Belkum (2002), “ Moraxella catarrhalis: from Emerging to Established pathogen”, Clinical Microbiology Reviews, 15(1), pp 125 – 144 28 Chen H., Hoover D.G (2003), “Bacteriocins and their food application”, Compre Rev in Foood Scien Food Safety, 2(3), pp 82-100 29 Cleveland J., Montville T J., Nes I F., Chikindas M L (2001), “Bacteriocins: Safe, natural antimicrobials for food preservation”, Int J Food Microbiol, 71, pp 1-20 30 Critchley et al (2002), “Antimicrobial resistance among respiratory pathogens collected in Thailand during 1999- 2000”, J Chemother, 14, pp 147- 154 31 Dask., R.K.S Tiwari and D.K.Shrivastava (2010), “ Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: Curent methods and future trends”, Journal of Medicinal Plants Research, (2), pp 104-111 32 Ejlertsen T, Thisted E, Ebbesen F, Olesen B, Renneberg J (1994), “ Branhamella catarrhalis in children and adults A study of prevalence, time of coloisation, and association with upper and lower respiratory tract infections”, J Infect, 29, pp 23- 31 33 Fang G., Fine M., Orloff J., et al (1990), “New and emerging etilogies for community – acquired pneumonia with implications for therapy”, Medicine, 69, pp 307 – 316 34 FAO yearbook (2008), pp 35 – 37 35 Frances M.Boyle, Paul R Georghiou, martyn H Tilse & Joseph G McCormack (1991), " Branhamella (Moraxella) catarrhalis: pathogenic significance in respiratory infection", The Medical Journal of Australia, 154, pp 592-596 36 Hongli Qiu, Wakako Kumita, Kenya Sato , Shinichi Nakajima, Hiroyuki Nishiyama , Ryoichi Saito, Etsuko Sawabe, Emi Ono, Toshio Chida and Noboru Okamura (2009), “uspA1 of Moraxella catarrhalis Clinical Isolates in Japan and its Relationship with Adherence to HEp-2 Cells”, Med Dent Sci, 56, pp 61-67 37 Jacobs MR (1996), “ Increaing importance f antibiotic – resistant Streptococcus pneumoniae in acute otitis media”, Pediatric Infect Dis J 15, pp 940 – 943 38 Karalus, R., and A.Campagnan (2000), “Moraxella catarrhalis, a review of an important human mucosal pathogen”, Microbes Infect, 2, pp 547 – 559 39 Klaenhammer T.R (1993), “Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria”, FEMS Microbiol Rev, 12, pp 39-85 40 Krystal, Reval, LauraA.Dobbs, Sungeeta Narr, Janak A.Patel, Jame J.Grady, Tasnee Chonmaitree (2007), “Incidence of Acute Otiris Media and Sinusitis complicating Upper Respiratory Tract Infection: The effect of age”, Pediatric, 119(6), pp 1408- 1412 41 M.C.Enright, H.Mc Kenzie (1997), “Moraxella (Branhamella) catarrhalis – clinical and molecular aspects of a redicovered pathogen”, J.Med Microbiol, 46, pp 360371 42 Marjorie Murphy Cowan (1999), “ Plant products as antimicrobial agents”, Clinical Microbiology Reviews, 12(4), pp 564- 582 43 Meyer GA, Shope TR, Waecker NJ, Lanningham FH (1995), “ Moraxella (Branhamella) catarrhalis bacteremia in children A report of two patients and review of literature”, Clin Pediatr, 34, pp 146- 150 44 Moerman, D.E (1996), “ An analysis of the food plants and drug plants of native North America”, I.Ethopharmacol, 58, pp 85- 88 45 Riley M.A., Wertz J.E (2002), “Bacteriocins: evolution, ecology, and application”, Annual Review of Microbiology, 56, pp 117-137 46 Rohani et al (1999), “Antimicrobial resistance among respiratory pathogens collected in Malaysia”, Int Med Res J, 3, pp 57 47 Timothy F Murphy, G Iyer Parameswaran, (2009), “Moraxella catarrhalis, a Human Respiratory Tract Pathogen”, Clinical Infectious Diseases, 49, pp 124–31 48 Vaneechoutte M, Verschraegen G, Clayeys G, Weise B, Van den Abeele (1990), “Respiratory tract carrier rates of Moraxella (Branhamella) catarrhalis in adults and children and interpretation of the isolation of M.catarrhalis from sputum”, J Clin Microbiol, 28, pp 2674 – 2680 49 Vu Thi Hue, Bui Thi Viet Ha (2010), “ Study on antibacterial activity toward bacteria causing upper respiratory (Moraxella catarrhalis) of Bacillus sp TM1.2 isolated from vinegar Docynia fruit (Docynia indica (Wall.) Decne)”, J Scien anh Technol, 26(4), pp 537-542 CÁC WEBSITE 50 http://www.duoclieu.org