Đang tải... (xem toàn văn)
3.1.2.2. Phương pháp chiết soxhlet Từ 2 g bột vỏ quả bằng n-hexan (TT) và methanol (TT) đ ã chiết đư ợc lần l ư ợt 0, 02 g ch ất chiết rắn, màu vàng (hiệu suất 0,95%) và 0,08 g chất chiết sánh nh ư dầu, m àu vàng sậm (hi ệu suất 4,05%). 3.1.2.3. Phương pháp ngấm kiệt Từ 4 kg bột vỏ quả bằng ethyl acetat đ ã chiết đư ợc 20 g cao ethyl acetat, hi ệu suất 0,5%. Cao n ày đư ợc dùng cho phân lập kế tiếp.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ MINH HIỂN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC Mã số: 62.73.15.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh-Năm 2014 Công trình hoàn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN KHẮC QUỲNH CỨ TS NGUYỄN VĂN THỊ Phản biện 1: GS.TSKH Nguyễn Công Hào Viện Công nghệ Hóa học TP Hồ Chí Minh Phản biện 2: PGS.TS Trịnh Văn Quỳ Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Phản biện 3: PGS.TS Phạm Đình Hùng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP Hồ Chí Minh - Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Hà Minh Hiển, Phạm Ngọc Dung, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị, Võ Thị Bạch Huệ (2009), “Phân lập số hợp chất phenol từ nhựa Mù u dư phẩm”, Tạp chí Dược học, số 395, tr 33-36 Ha Minh Hien, Tran Thi Thuy Tien, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Viet Kinh, “Phenolic compound and other constituents determined from crude ethyl acetate extract of fruit peels of Calophyllum inophyllum L.”, Analytica Vietnam Conference Proceedings 3/2009, Ho Chi Minh City, Vietnam, pp 228-232 Minh Hien Ha, Van Thi Nguyen, Khac Quynh Cu Nguyen, Emily LC Cheah, Paul WS Heng (2009), “Antimicrobial activity of Calophyllum inophyllum crude extracts obtained by Pressurized Liquid Extraction”, Asian Journal of Traditional Medicine, (4), pp 141-146 Ha Minh Hien, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Khac Quynh Cu, Nguyen Van Thi, Francoise NEPVEU, “Antimicrobial and antioxidant activities of methanolic extract obtained from resin of Calophyllum inophyllum L nut oil”, Proceedings of the Sixth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences 12/2009, Hue, Vietnam, pp 64-68 Hà Minh Hiển, Paul WS Heng, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị, Võ Thị Bạch Huệ (2011), “Nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu calophyllolid dùng kiểm nghiệm nghiên cứu dược liệu Mù u Calophyllum inophyllum L.” Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, số 3.2011, tr 1519 Ha Minh Hien, Paul WS Heng, Nguyen Van Thi, Nguyen Khac Quynh Cu, Vo Thi Bach Hue (2011), “Development and Validation of a GC-MS Method for Rapid Determination of Calophyllolide in Calophyllum inophyllum L.: A Quality Control Approach”, Chinese Journal of Natural Medicines, (6), pp 429-434 Hà Minh Hiển, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị, Võ Thị Bạch Huệ, Bùi Thị Thu Thảo (2013), “Nghiên cứu xác định calophyllolid phương pháp HPLC-DAD ứng dụng kiểm nghiệm dung dịch thuốc từ dược liệu có dầu Mù u”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, số 2.2013, tr 14-18 đầu dò PDA SPD-M20A; phần mềm xử lý kiện LCsolution Cột Đặt vấn đề Zorbax 250 mm × 4,6 mm, μm, pha động acetonitril-dung dịch acid Cây Mù u có tên khoa học Calophyllum inophyllum L Clusiaceae, acetic 2% với chế độ rửa giải gradient: acetonitril 20-80%: dung từ lâu dùng phận như: hạt, dầu hạt, nhựa cây, rễ, đ ể dịch acid acetic 2% 80-20% 30 phút Tốc độ dòng ml/phút chữa bệnh ghẻ, nấm tóc, bệnh da, nhiễm trùng xương, o nhiệt độ cột 40 C Phát bước sóng 270 nm Thể tích tiêm bỏng, thấp khớp….Tại Việt Nam, Mù u khai thác cách đập mẫu 10 µl” Hàm lượng calophyllolid (kl/kl) chế phẩm “Dầu bỏ vỏ, lấy hạt để ép dầu Tinh chế dầu thô cách tách loại nhựa Mù u Inopilo” thu 0,47 ± 0,01% (g/100 g) để thu dầu Mù u dược dụng Nhựa loại tinh chế dầu Mù u KIẾN NGHỊ - - - vỏ Mù u Việt nam chưa nghiên cứu để sử dụng Tiếp tục áp dụng phương pháp GC-MS, HPLC-DAD để xác Dầu Mù u dùng riêng phối hợp với dược liệu khác định calophyllolid, 4-hydroxyxanthon thuốc từ dược chế phẩm sử dụng rộng rãi để trị bỏng, viêm loét da, liệu Mù u nhằm nâng cấp tiêu chuẩn sở làm mau lành vết thương…Đề tài: “Nghiên cứu xác định hợp Khảo sát tác dụng sinh học hợp chất N3 (hợp chất tự nhiên chất phenol từ nhựa vỏ Mù u để ứng dụng kiểm mới): kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư nghiệm” thực với mục tiêu nghiên cứu sau: Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn đối chiếu - calophyllolid nhằm cải tiến qui trình chiết xuất, phân lập, tinh mọc Việt Nam số kỹ thuật sắc ký phổ nghiệm để chọn chế xây dựng chất điểm dùng kiểm nghiệm nguyên liệu chế phẩm từ Bổ sung chất chuẩn đối chiếu calophyllolid vào Dược điển Việt dược liệu Mù u Nam xuất lần thứ nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược - liệu có hoạt chất tương ứng dầu Mù u thành tiêu chuẩn quốc dùng cho định lượng số hợp chất phenol phân lập gia - Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù u Nghiên cứu thiết lập 01 chất chuẩn đối chiếu để định tính 01 Ứng dụng chất đối chiếu thiết lập để kiểm nghiệm nguyên liệu chế phẩm từ dược liệu Mù u Tính cấp thiết đề tài Tiêu chuẩn sở dầu Mù u thuốc từ Mù u có chưa đáp ứng với nguyên tắc, tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc sở sản xuất thuốc từ dược liệu tổ chức Y tế giới (GMP-WHO) mà Bộ Y tế đưa lộ trình áp dụng kể từ ngày 01/01/2014 không xác định thành phần hoạt chất chất điểm thiếu chất đối chiếu phương pháp phân tích, kiểm tiêu: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ nghiệm tin cậy Các dược điển: Hoa kỳ 2012, Anh 2013, châu Âu xác, độ thực Đại học Quốc gia Singapore (NUS) 7.0, Nhật 2006, Quốc tế 4, Trung quốc 2010 chưa thấy có chuyên Điều kiện sắc ký: “Máy sắc ký khí GC-2010 ghép đầu dò phổ khối luận phận dùng thuốc từ dược liệu Mù u Tiêu GCMS-QP 2010 Shimadzu; chích mẫu tự động AOC-20i; phần chuẩn quốc gia dầu Mù u theo dược điển Việt Nam chưa có mềm xử lý kiện LabSolutions GCMSSolution phiên 2.5 Cột: tiêu định tính, định lượng chất điểm DB-5MS 25 m x 0,22 mm ID, df = µm Chương trình nhiệt độ: 80 Việc nghiên cứu xác định hợp chất phenol ứng dụng o kiểm nghiệm nhằm mở triển vọng khai thác, tận thu không chia dòng; nhiệt độ đầu dò phổ khối: nguồn ion: 250 oC; giao cách xác định giá trị nhựa vỏ phần diện: 200 oC; ion hóa bắn phá điện tử; tốc độ dòng khí mang: xem dư phẩm trình sản xuất dầu Mù u dược dụng 1,43 ml/phút; khoảng phổ: 50-450 amu Kiểu thu liệu: SCAN Những đóng góp luận án SIM (ion đích: m/z 401; ion tham chiếu: m/z 83,55) Thể tích tiêm Về mặt hóa học: Lần công bố việc phân lập hợp mẫu µl” Hàm lượng calophyllolid (kl/kl) cao methanol chiết chất phenol gồm có: từ nhựa Mù u 0,67 ± 0,01% (g/100 g) Từ nhựa: hợp chất N1 (1,5-dihydroxyxanthon C13H8O4), N2 (4- Từ phương pháp GC-MS thiết lập, tiếp tục xây dựng thẩm định hydroxyxanthon C13H8O3) thuộc nhóm xanthonoid hợp chất N3: phương pháp GC-MS để xác định calophyllolid vỏ Mù u inocalophyllin C (tên đề nghị) C37H48O6 hợp chất tự nhiên Chuẩn bị mẫu thử cách chiết lỏng áp suất (PLE) hoàn toàn (Xác định nhờ phổ MS, NMR X-ray) Điều kiện sắc ký thay đổi : Chương trình nhiệt độ: 80 oC-300 Từ vỏ quả: hợp chất V1 (calophyllolid C26H24O5) thuộc nhóm o neoflavononid Mù u 0,0255 ± 0,0005% (g/100 g) Về mặt thiết lập chất đối chiếu: Lần công bố nghiên cứu Phương pháp HPLC-DAD thiết lập chất đối chiếu: 4-hydroxyxanthon dùng cho định tính; Đã xây dựng phương pháp HPLC-DAD pha đảo thẩm định theo calophyllolid dùng cho định lượng ICH với tiêu: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính Về mặt kiểm nghiệm thuốc: Lần công bố phương pháp tuyến tính, độ xác, độ thực Viện Kiểm nghiệm GC-MS RP-HPLC-DAD xác định calophyllolid (từ nhựa Mù u, thuốc thành phố Hồ Chí Minh để xác định calophyllolid dung vỏ Mù u chế phẩm chứa dầu Mù u) dịch thuốc từ dược liệu có dầu Mù u với điều kiện thực nghiệm C-300 oC/9 phút (40 oC/phút); nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 250 oC, C/12 phút (40 oC/phút) Hàm lượng calophyllolid (kl/kl) vỏ là: “Máy HPLC Shimadzu: kiểm tra hệ thống CBM-20Alite; bơm LC-20AD; chích mẫu tự động SIL-20AC, buồng cột CTO-20AC; - Trong vỏ Mù u: Bố cục luận án Từ kg vỏ Mù u, chiết xuất EtOAc thu 20 g cao, Luận án gồm: 113 trang, mở đầu trang, tổng quan 22 trang, đối từ phân lập 26,0 mg hợp chất V xác định calophyllolid tượng phương pháp nghiên cứu 15 trang, kết nghiên cứu 55 (C26 H24O5) trang, bàn luận 14 trang, kết luận kiến nghị trang Luận án có 32 Thiết lập chất chuẩn đối chiếu bảng, 23 hình, 11 sơ đồ, đồ thị, 123 tài liệu tham khảo (12 tiếng Đã xây dựng liệu nhận dạng chất bao gồm: phổ UV-VIS, Việt, 110 tiếng Anh tiếng Pháp), 16 phụ lục phổ IR, phổ MS, phổ NMR, điểm chảy chất calophyllolid NỘI DUNG LUẬN ÁN 4-hydroxyxanthon Chương 1: TỔNG QUAN Đã xây dựng thẩm định theo ICH quy trình xác định tạp chất hữu Trình bày vấn đề sau: kèm với calophyllolid trình chiết xuất kỹ thuật 1.1 Sơ lược Mù u HPLC-DAD với tiêu: tính phù hợp hệ thống, tính đặc 1.2 Sơ lược hợp chất phenol hiệu, tính tuyến tính, độ xác, giới hạn phát 1.3 Tình hình nghiên cứu hợp chất phenol từ Mù u Lần thiết lập chất đối chiếu calophyllolid (chuẩn chính) 1.4 Một số phương pháp phân tích hợp chất phenol từ Mù u loại dùng cho định lượng theo hướng dẫn WHO, ISO với tiêu 1.5 Một số khái niệm chất chuẩn đối chiếu chuẩn chất lượng bao gồm tiêu: cảm quan; định tính: UV-Vis, Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU IR, MS, NMR; điểm chảy; độ tinh khiết: tạp chất hữu cơ, tạp chất vô 2.1 Đối tượng nghiên cứu cơ, tạp chất bay hơi; định lượng Số lượng chất đối chiếu thiết lập Các hợp chất phenol tổng cộng 100 lọ 10 mg với hàm lượng 95,27% 2.2 Nguyên vật liệu Ngoài ra, thiết lập chất đối chiếu 4-hydroxyxanthon dùng cho định tính với số lượng lọ m g với hàm lượng 93,91% màu xanh đậm, mùi đặc trưng Khoa Dược-Đại học Y Dược TP Ứng dụng chất đối chiếu thiết lập để kiểm nghiệm HCM cung cấp năm 2008 calophyllolid từ nhựa, vỏ Mù u chế phẩm từ Mù u Phương pháp GC-MS cấp năm 2008 Đã xây dựng phương pháp nhanh, phù hợp, xác đặc hiệu để xác định calophyllolid từ nhựa Mù u kỹ thuật sắc ký khí & sản xuất dược phẩm Bình Minh mao quản ghép khối phổ (GC-MS) Thẩm định theo ICH với Nhựa tách loại tinh chế dầu thô ép từ hạt Mù u: chất lỏng có Vỏ Mù u công ty Natural Pro thu tỉnh Bến tre cung Chế phẩm dầu Mù u Inopilo công ty TNHH thương mại 2.3 Phương pháp nghiên cứu KẾT LUẬN 2.3.1 Nguyên liệu - Dung môi, hóa chất - Trang thiết bị Đề tài “Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù - Dung môi, hóa chất sử dụng loại kỹ thuật dùng cho chiết xuất, loại phân tích sắc ký (Merck JT Baker) dùng cho kỹ thuật TLC, u để ứng dụng kiểm nghiệm” hoàn thành nội dung nghiên cứu để đạt mục tiêu đề đưa kết luận sau: UV-Vis, IR, GC-MS, LC-MS, ICP-MS, deteuri hóa (Merck) dùng Xác định hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù u cho kỹ thuật NMR,… Bằng số kỹ thuật sắc ký như: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng chân - Các chủng vi khuẩn đối chiếu ATCC cung cấp; đĩa kháng sinh không, sắc ký lỏng (phân tích điều chế), sắc ký khí số kỹ chuẩn hãng Oxoid Ltd (Anh) thuật phổ nghiệm như: phổ UV-Vis, phổ IR, phổ khối lượng, phổ - Thiết bị chiết xuất phân tích đặt Khoa Dược -Đại học Y Dược NMR hai chiều, phổ nhiễu xạ tia X, chiết xuất, phân lập, TP.HCM, Viện Khoa học Công nghệ Việt nam, Viện Kiểm tinh chế xác định cấu trúc số hợp chất phenol sau: nghiệm thuốc TP.HCM, Khoa Hóa-Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Hóa Khoa Dược-Đại học Quốc gia Singapore - Trong nhựa Mù u: Từ kg nhựa Mù u, chiết xuất n -hexan thu 40 g cao, 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu từ phân lập 8,1 mg hợp chất N xác định 1,5- 2.3.2.1 Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa vỏ dihydroxyxanthon (C13H8O4) 105,0 mg hợp chất N xác định 4- Chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa Mù u hydroxyxanthon (C13H8O3) Từ kg nhựa Mù u, chiết xuất hỗn hợp MeOH -nước (9:1) Phương pháp dùng dung môi phân cực có thay đổi pH Kiềm hóa dung dịch kiềm khác natri carbonat (TT), natri hydroxyd (TT), amoniac (TT) đến pH 7-8 8-9 Acid thu 50 g cao, từ phân lập 135,0 mg hợp chất N dề nghị tên inocalophyllin C (C37H48O6) 98,0 mg hợp chất N xác Phương pháp dùng dung môi phân cực không thay đổi pH định calophyllolid (C26 H24O5) Hợp chất N với tên khoa học: ethyl 3-((2R,3R)-4-hydroxy-2,3- Khảo sát tỉ lệ methanol/nước phù hợp phương pháp loại dầu dimethyl-6-(5-methyl-2-(prop-1-en-2-yl)hex-4-enyl)-6-(3- Khảo sát quy trình loại dầu dựa vào độ phân cực: methylbut-2-enyl)-5,7-dioxo-3,5,6,7-tetrahydro-2H-chromen-8- hóa dịch kiềm đến pH 3-4 chiết dung môi phân cực - Chiết lỏng - lỏng dịch chiết MeOH/nước với ether dầu hỏa - Làm giảm nồng độ dung môi có dịch chiết MeOH/nước yl)-3-phenylpropanoat hợp chất tự nhiên mới, chưa công bố nguồn liệu tra cứu thư việ n Đại học Quốc Chiết xuất hợp chất phenol từ vỏ Mù u gia Singapore (NUS): ScienceDirect, Scopus, PubMed, SciFinder Phương pháp chiết lỏng áp suất (PLE) (Chemical Abstracts), Patent Databases GC-MS dùng cột thủy tinh với pha tĩnh OV OV 17 3% tẩm Dung môi chiết n-hexan (TT) methanol (TT); áp suất 1500 psi; Gas Chrom Q Tuy nhiên, tác giả không mô tả điều kiện sắc nhiệt độ 120 oC; thời gian chiết: 15 phút; chu kỳ chiết: 1; thể tích rửa: ký nguồn gốc chất đối chiếu calophyllolid sử dụng 60%; thời gian làm hệ thống nitrogen: 90 giây Phương pháp sắc ký khí mao quản ghép khối phổ (GC-MS) đề xuất Phương pháp chiết soxhlet phương pháp ngoại chuẩn không tìm nội Dung môi chiết methanol (TT); thời gian chiết: chuẩn đồng vị chất có cấu trúc tương tự với calophyllolid Phương pháp ngấm kiệt độ tin cậy chấp nhận sử dụng tiêm mẫu tự động Vỏ Mù u xay thành bột, ngấm kiệt ngược dòng với cồn quy trình chuẩn bị mẫu không phức tạp Kết lần 96% thu dịch chiết cồn Cô cách thủy dịch chiết đến cắn sệt công bố tạp chí quốc tế phương pháp GC-MS xác định nhanh sirô Thêm nước vào cắn với tỷ lệ thích hợp chiết với calophyllolid Phương pháp sau làm sở để xác định ethyl acetat Cô dịch chiết ethyl acetat áp suất giảm 40 oC calophyllolid có vỏ Mù u Thử tác dụng kháng khuẩn 4.4.2 Phương pháp HPLC-DAD Dùng phương pháp khuếch tán thạch, tiêu chuẩn CLSI theo Khi xác định calophyllolid chế phẩm có chứa dầu Mù u, khuyến cáo FDA Kháng sinh chuẩn vi khuẩn thử nghiệm: mẫu thử sau xử lý có nước nên không áp dụng phương pháp GC- carbenicilin 100 µg cho Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; MS Nghiên cứu Frederic cộng năm 2008 xác định methicilin µg cho Staphylococcus aureus ATCC 6538 P; coumarin kể calophyllolid cao Mù u kỹ thuật HPLC- streptomycin 10 µg Mycobacterium smegmatis ATCC 14468 o DAD pha thuận dùng cột silica lỗ sốp 120 A , hạt µm, kích thước Phân lập 250 mm x 4,6 mm Chương trình dung môi: i-propanol-i-octan từ 1- Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng chân không (với silica gel 0,040- 20% (tt/tt) 25 phút, từ 20/80 (tt/tt) 25 phút, sau cân 0,063 mm) để tách hợp chất phenol tinh khiết 15 phút Tuy nhiên, sắc ký đồ cho thấy calophyllolid Tinh chế phân giải phương pháp chưa thẩm định Chưa thấy công bố Sử dụng phương pháp kết ti nh lại dung môi thích hợp phương pháp HPLC-DAD pha đảo xác định calophyllolid với độ tin phương pháp sắc ký lỏng điều chế cậy cao sử dụng chất đối chiếu thiết lập Với nghiên cứu Xác định cấu trúc hóa học chúng tôi, tiêu thẩm định đạt yêu cầu Xác định cấu trúc cách đánh giá phối hợp kết phổ: UVVis, IR, MS (EI-MS, HRESI-TOFMS), NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC), X-ray 2.3.2.2 Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu danh pháp Ngoài ra, tìm thấy hợp chất acid Chiết xuất, phân lập, tinh chế brasiliensophyllic C từ Calophyllum brasiliense Cambess Clusiaceae Chất đối chiếu phân lập từ cao hợp chất phenol toàn phần chiết từ có cấu tạo tương tự N ngoại trừ nhóm chức acid thay ester nhựa Mù u Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng chân không, kết tinh mạch nhánh có thêm carbon lại, sắc ký lỏng điều chế để đạt độ tinh khiết cao 4.3 Thiết lập chất chuẩn đối chiếu Định tính Chưa thấy có nhà sản xuất hay phân phối chất chuẩn đối chiếu Đối chiếu phổ UV-Vis; phổ IR; phổ MS; phổ NMR chất ChromaDex, Sigma Aldrich, USP, Cerilliant hai Viện kiểm nghiên cứu với phổ từ tài liệu tham khảo nghiệm thuốc trung ương TP.HCM cung cấp calophyllolid 4- Đánh giá chất điều chế làm chất đối chiếu hydroxyxanthon Hiện chưa có quy định độ tinh khiết chất Điểm chảy: phương pháp theo DĐVN IV đối chiếu hợp chất tự nhiên phân lập từ dược liệu Do Tạp chất vô cơ: phương pháp ICP-MS theo DĐTQ 2010 calophyllolid chất có hoạt tính như: ức chế elastas (IC 50 = 8,4 Tạp chất bay hơi: phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng TGA µM); kháng viêm (LD50 = 2,5 g/kg); độc tính tế bào ( IC50 = 3,5 theo USP µg/ml), kháng khuẩn thành phần nhiều phận dùng Tạp chất hữu cơ: phương pháp HPLC-DAD Thẩm định phương từ Mù u Việt nam giới nên đáp ứng với tiêu chuẩn lựa pháp: theo hướng dẫn ICH ban hành vào tháng 11 năm 2005 chọn làm chất điểm Theo tổng kết FHH (Forum for the Đánh giá đồng lô trình đóng gói chất đối chiếu Harmonization of Herbal Medicine) năm 2005, Dược điển Hàn quốc Lấy mẫu: Sử dụng cách lấy mẫu ngẫu nhiên theo phần mềm Excel, quy định độ tinh khiết phải 95% Đây sở để xây dựng số lọ lấy để kiểm tra g = N +1 lọ, N số lọ đóng mức chất lượng cho tiêu định lượng calophyllolid làm chất chuẩn Xác định độ tinh khiết: Áp dụng phương pháp xác định tạp chất hữu đối chiếu HPLC-DAD xây dựng thẩm định theo ICH 4.4 Các phương pháp ghép nối sắc ký-phổ nghiệm ứng dụng xác Đánh giá độ đồng lọ: Đánh giá kỹ thuật thống kê định calophyllolid nhựa, vỏ chế phẩm từ Mù u ANOVA yếu tố Các lọ đồng Ftn < Ftc (P = 0,05) 4.4.1 Phương pháp GC-MS Đánh giá chất chuẩn đối chiếu thông qua liên phòng thí nghiệm Khi thử hòa tan cao methanol hỗn hợp MeCN -nước với tỷ Tiến hành xác định độ tinh khiết ba phòng thí nghiệm độc lập đạt lệ khác thấy có tượng mẫu bị đục làm ảnh hưởng đến tiêu chuẩn GLP ISO/IEC17025 trình phân tách phát sử dụng phương pháp LC -MS Xác định giá trị ấn định độ không đảm bảo đo HPLC-DAD Năm 1972, Games DE công bố báo định danh hợp chất 4-phenyl coumarin Calophyllum inophyllum nhựa vỏ Mù u Thật vậy, năm 2003, Shen cộng xác Xác định giá trị ấn định độ không đảm bảo đo theo phương định từ hạt Calophyllum inophyllum Đài loan: dẫn suất pháp thống kê dùng cho chương trình thử nghiệm thành thạo so sánh pyranocoumarin calophyllolid Sau vào năm 2004, Yimdjo lien phòng thí nghiệm ISO 13528 cộng công bố phân lập calophyllolid coumarin khác Định lượng calaustralin, inophyllum C, E từ hạt Mù u Cameroon Gần Hàm lượng % tính nguyên trạng: 100 – (% tạp chất hữu cơ) – (% công trình năm 2009 Leu cộng chưa thấy phân tạp chất bay hơi) – (% tạp chất vô cơ) (theo hướng dẫn WHO) lập 1,5-dihydroxyxanthon 4-hydroxyxanthon nhựa Mù 2.3.2.3 Ứng dụng chất đối chiếu thiết lập để kiểm nghiệm u tách loại tinh chế dầu ép từ hạt Mù u mọc Polynesia thuộc nguyên liệu (nhựa, vỏ quả) chế phẩm từ Mù u Pháp Phương pháp GC-MS Kết xác định hàm lượng calophyllolid từ cao nhựa tách loại chiết Khảo sát chọn nhiệt độ buồng cột: thay đổi nhiệt độ đầu tốc độ với MeOH phương pháp chiết lỏng-lỏng: 0,68 ± 0,01 (g/100g) gia nhiệt, chọn điều kiện thời gian lưu ngắn pic phân giải tốt từ vỏ chiết với MeOH phương pháp PLE: 0,0255 ± Xác định mảnh ion đặc trưng: xác định mảnh ion phù hợp 0,0005 (g/100g) so với hàm lượng calophyllolid 0,47 ± 0,01 (g/100g) với cấu trúc hợp chất chế phẩm Dầu Mù u Inopilo (chỉ định trị bỏng, u nhọt, viêm Thẩm định quy trình loét da, làm mau lành vết thương) với tác dụng kháng S aureus - Tính phù hợp hệ thống M smegmatis sơ cho thấy nhựa loại bỏ tinh chế dầu Yêu cầu: hệ số đối xứng pic 2; hệ số tương quan (r) đường vỏ Mù u đối tượng tiềm sử dụng làm thuốc chuẩn > 0,995; độ lệch cường độ tương đối mảnh ion đặc trưng 4.2 Kết xác định hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù u (%) pic chất đối chiếu pic mẫu thử ± 20% Từ nhựa kg nhựa Mù u, chiết xuất 50 g cao methanol - Tính đặc hiệu: Kiểm tra độ tinh khiết pic mẫu thử phân lập 135 mg hợp chất N phương pháp sắc ký lỏng phần mềm AMDIS 2.69 (NIST) chân không Đây hợp chất tự nhiên hoàn toàn Tham khảo - Tính tuyến tính: r > 0,995 tài liệu chi Calophyllum hợp chất công bố từ - Độ xác: nguồn: ScienceDirect, Scopus, PubMed, SciFinder (Chemical Độ lặp lại: %RSD ≤ 3,0 Abstracts), Patent Databases thư viện Đại học Quốc gia Singapore Độ xác trung gian: Kết ngày khác (NUS) cho thấy: có hợp chất inocalophyllin A dimethylat có phân tử lượng tương đương khác biệt cấu tạo bao gồm: loại ester, vị trí dioxo, vị trí C-4, 1-3-diketon enol, vị trí C-5, vị trí nhóm biệt ý nghĩa thống kê: test F (P = 0,05) - Độ đúng: tỷ lệ phục hồi 98% - 102%; %RSD ≤ 2,0 Phương pháp HPLC-DAD 3.3.2.2 Khảo sát chọn quy trình chuẩn bị mẫu thử Khảo sát chọn chương tr ình dung môi: thay đổi tỷ lệ pha động Chọn nhiệt độ làm ấm: 60 oC; hàm lượng methanol (TT): 90%; thời pH, chọn điều kiện để pic đạt độ phân giải tối thiểu 1,5 gian làm ấm: 10 phút; thời gian siêu âm: 15 phút Khảo sát chọn quy trình chuẩn bị mẫu thử: thiết kế thí nghiệm để 3.3.2.3 Thẩm định quy trình chọn điều kiện chuẩn bị mẫu dựa vào nhiệt độ làm ấm mẫu, hàm Thẩm định quy trình theo tiêu: lượng dung môi, thời gian làm ấ m thời gian siêu âm - Tính phù hợp hệ thống Thẩm định quy trình Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống cho thấy sau lần sắc ký - Tính phù hợp hệ thống thông số nằm giới hạn cho phép Yêu cầu: hệ số đối xứng pic 0,8 As 1,5; %RSD diện tích pic - Tính đặc hiệu: quy trình có tính đặc hiệu 2,0; số đĩa lý thuyết ≥ 2000 - Tính tuyến tính: kết khảo sát tính tuyến tính cho thấy có - Tính đặc hiệu: Sắc ký đồ pha động dung môi pha mẫu không tương quan tuyến tính nồng độ calophyllolid đối chiếu xuất tín hiệu trùng với thời gian lưu chất cần phân tích calophyllolid mẫu diện tích pic tương ứng với hệ số tương mẫu thử mẫu đối chiếu Độ tinh khiết pic chất cần phân tích quan r > 0,995 sắc ký đồ mẫu thử: > 0,99 Độ phân giải pic chất cần phân - Độ xác độ pic liền kề sắc ký đồ mẫu thử: ≥ 1,5 Kết thống kê cho thấy quy trình có tỷ lệ hồi phục nằm - Tính tuyến tính: r > 0,995 giới hạn cho phép tỷ lệ hồi phục lý thuyết 98% - 102%; %RSD: - Độ xác: < 2,0 %RSD < độ lặp lại; %RSD < độ Độ lặp lại: %RSD ≤ 3,0 xác trung gian Độ xác trung gian: Kết ngày khác CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Xác định hợp chất phenol thử tính kháng khuẩn cao chiết từ nhựa vỏ Mù u biệt ý nghĩa thống kê: test F (P = 0,05) - Độ đúng: tỷ lệ phục hồi 98% - 102%; %RSD ≤ 2,0 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Nghiên cứu dùng phương pháp chiết xuất từ nhựa 3.1 Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa, vỏ Mù u Mù u Việt nam n-hexan có thay đổi pH để phân lập 3.1.1 Chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa Mù u hợp chất xanthon kể Đặc biệt, phương pháp chiết với 3.1.1.1 Phương pháp dùng dung môi phân cực, thay đổi pH MeOH, phân lập hợp chất tự nhiên chưa công bố công trình khác Chưa thấy có tác giả công bố xác định 1,5-dihydroxyxanthon 4-hydroxyxanthon từ 3.3.1.2 Thẩm định quy trình Thẩm định quy trình theo tiêu: - Tính phù hợp hệ thống Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống cho thấy sau lần sắc ký thông số nằm giới hạn cho phép - Tính đặc hiệu: quy trình có tính đặc hiệu - Tính tuyến tính: kết khảo sát tính tuyến tính cho thấy có tương quan tuyến tính nồng độ calophyllolid đối chiếu calophyllolid mẫu diện tích pic tương ứng với hệ số tương Sơ đồ chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa Mù u n -hexan quan r > 0,995 3.1.1.2 Phương pháp dùng dung môi phân cực không thay đổi pH - Độ xác độ Kết thống kê cho thấy quy trình có tỷ lệ hồi phục nằm giới hạn cho phép tỷ lệ hồi phục lý thuyết 98% - 102%; %RSD: < 2,0 %RSD < độ lặp lại; %RSD < độ xác trung gian 3.3.2 Xác định calophyllolid chế phẩm có dầu Mù u 3.3.2.1 Khảo sát chọn chương trình dung môi Cột Zorbax 250 mm × 4,6 mm, μm Tốc độ dòng: ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 μl Nhiệt độ cột: 40 oC Bước sóng phát 270 nm Pha động: acetonitril-dung dịch acid acetic 2% với chương trình dung môi sau: Sơ đồ chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa Mù u MeOH-nước Thời gian (phút) 30 35 40 Acetonitril (%) 20 80 20 20 Dung dịch acid acetic 2% (%) 80 20 80 80 3.1.2 Chiết xuất hợp chất phenol từ vỏ Mù u 3.1.2.1 Phương pháp chiết lỏng áp suất (PLE) Từ g bột vỏ n-hexan (TT) methanol (TT) chiết 0,05 g chất chiết sánh dầu, màu vàng, hiệu suất 0,96% 0,5 g chất chiết dầu nhầy, màu nâu đậm , hiệu suất 9,98% Phổ NMR 3.1.2.2 Phương pháp chiết soxhlet 13 0, 02 g chất chiết rắn, màu vàng (hiệu suất 0,95%) 0,08 g 139,9; 144,2; 151,7; 152,0; 155,0; 155,8; 159,4; 194,3 3.1.2.3 Phương pháp ngấm kiệt Từ kg bột vỏ ethyl acetat chiết 20 g cao ethyl acetat, hiệu suất 0,5% Cao dùng cho phân lập 3.1.3 Thử tác dụng kháng khuẩn cao chiết từ nhựa vỏ Bảng 3.2 Kết thử tác dụng kháng khuẩn cao nhựa vỏ Điểm chảy Tạp chất hữu 154-156 oC Tạp chất bay Tạp chất vô Không 1,0 % Định lượng Không 95,0% phận Nhựa Vỏ S aureus Ps aeruginosa M smegmatis ATCC 6538 P ATCC 9027 ATCC 14468 Methicillin µg Carbenicillin 100 µg Streptomycin 10 µg Phương 3.3.1 Xác định calophyllolid nhựa vỏ Mù u 3.3.1.1 Khảo sát nhiệt độ cột xác định mảnh ion đặc trưng Bảng 3.16 Khảo sát chương trình nhiệt độ cột Nhiệt độ buồng cột Tốc độ gia nhiệt o pháp chiết n-Hexan Dung môi 41,0 Âm tính 36,0 Methanol Dung môi 45,3 - 48,4 Methanol PLE 58,1 - 47,0 EtOAc Ngấm kiệt 58,0 - 47,0 n-Hexan PLE 53,8 - 37,5 Methanol Soxhlet 50,0 - 45,5 60-300 C/9 phút ( C/phút) (phút) 15 21,98 ± 0,01 Mảnh ion đặc trưng (m/z) [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, 20 18,5 ± 0,006 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 25 16,43 ± 0,01 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 30 15,06 ± 0,012 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 S aureus M smegmatis, tác dụng Ps aeruginosa 3.1.4 Phân lập hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù u 3.1.4.1 Phân lập hợp chất phenol từ nhựa Từ 40 g cao n -hexan phân lập được: hợp chất N1 = 8,1 mg; hợp Thời gian lưu [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 o Các cao chiết từ nhựa vỏ Mù u có tác dụng kháng khuẩn chất N2 = 105,0 mg Không 20 ppm liệu (nhựa, vỏ Mù u) chế phẩm từ dầu Mù u mẫu thử (100 g/đĩa)/mẫu chuẩn % (n =2) Cao Không 96,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng 3.3 Ứng dụng chất đối chiếu thiết lập để kiểm nghiệm nguyên Đường kính vòng kháng khuẩn Bộ C-NMR (CD3Cl3, 75 MHz): 10,7; 15,2; 26,8 x 2; 63,0; 77,4; 105,6; 110,7; 114,2; 115,0; 115,9; 127,2 x 2; 127,5 x 2; 127,7; 129,0; 139,5; chất chiết sánh dầu, màu vàng sậm (hiệu suất 4,05%) Đĩa kháng sinh chuẩn H-NMR (CD3Cl3, 300 MHz): 7,26 m x 2; 7,40 m x 2; 0,97 s x 2; 1,9 d (6,3); 2,01 s; 5,48 d (9,9); 6,02 s; 6,45 d (9,6), 6,57 q (6,0) Từ g bột vỏ n-hexan (TT) methanol (TT) chiết Chủng vi sinh vật thử nghiệm 40 13,2 ± 0,01 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 o 80-300 C/9 phút 40 12,83 ± 0,006 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 Kết quả: Chọn chương trình nhiệt độ: 80 -300 oC/9 phút, tăng 40 oC/phút 3.2 Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu (ĐC) Chiết xuất, phân lập tinh chế để thu hợp chất đủ tinh khiết làm chất chuẩn đối chiếu Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng với mức chất lượng, tiêu , phương pháp thử theo hướng dẫn WHO ISO Bảng 3.3 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng 4-hydroxyxanthon (ĐC) Sơ đồ phân lập N1, N2 sắc ký lỏng chân không Chỉ tiêu Tính chất Định tính Phổ UV -Vis Phổ IR Phổ khối lượng Phổ NMR Mức chất lượng Tinh thể hình kim, không màu , dễ tan aceton, methanol Từ 50 g cao methanol phân lập được: hợp chất N3 = 135,0 mg; hợp chất N4 = 98,0 mg Phải có cực đại hấp thu 231, 248, 278 348 nm Phải có đỉnh có số sóng: 3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729 cm -1 Phải có pic có m/z 212 [M]+ (pic bản), 184, 155, 128, 102, 63 H-NMR (CD3OD, 500 MHz): 7,73 dd (8,0; 2,0); 7,25 t (8,0); 7,31 dd (8,0; 1,5); 7,68 dd (8,5; 0,5); 7,83 dt (8,5; 1,5); 7,44 dt (7,5; 1,0); 8,26 dd (8,0; 2,0) 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 179,2; 157,4; 147,9; 147,1; 136,4; 127,3; 125,3; 125,1; 123,6; 122,5; 121,5; 119,4; 117,1 Điểm chảy Tạp chất hữu 228-230 oC Tạp chất bay Định lượng Không 1,0 % Không 94,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng Không 90,0% Sơ đồ phân lập N 3, N4 sắc ký lỏng chân không 3.1.4.2 Phân lập hợp chất phenol từ vỏ Từ 20 g cao EtOAc phân lập được: hợp chất V1 = 26,0 mg Bảng 3.4 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng calophyllolid (ĐC) Chỉ tiêu Mức chất lượng Tính chất Định tính Tinh thể không màu, dễ tan aceton, benzen, ether ethylic, alcol Phổ UV-Vis Phổ IR Phải có cực đại hấp thu 235, 270 295 nm Phải có đỉnh có số sóng: 1726, 1662, 1579, 1133, 759, 702 cm -1 Phổ khối lượng Phải có pic có m/z 416 [M]+, 401 (pic bản), 83, 55 Sơ đồ phân lập V sắ c ký lỏng chân không 3.1.5 Xác định cấu trúc hợp chất phenol phân lập Các số vật lý liệu phổ N1, N2 tóm tắt bảng sau: 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 12,4; 14,1; 17,8; 18,1; 19,3; 25,5; 25,6; 35,2; 35,6; (C, ppm) 36,8; 40,9; 41,7; 44,6; 60,1; 77,2; 109,7; 113,7; 115,2; 115,6; 117,1; N1 (1,5-dihydroxyxanthon) N2 (4-hydroxyxanthon) 122,4; 125,6; 127,7; 128,1; 132,2; 143,6; 147,4; 163,1; 187,3; 187,4; Mô tả Bột màu vàng, vô định hình Tinh thể hình kim, không màu 195,7; 200,3 Điểm chảy 245-247 oC 228-230 oC UV (MeOH) 248, 315, 370 nm, 235 nm (sh) 231, 248, 348 nm IR (KBr, cm-1) 3421, 1647, 1577, 1279, 792, 724 3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729 EI-MS m/z 228 (100), 212 (1,37), 200 (11,12), (rel int.,%) 171 (11,46), 115 (23,3), 92 (13,75) H-NMR (CD3OD DMSO-d6, 500 MHz): (H, ppm; J, Hz) 4' 2' (CD3OD, 500 MHz): 7,73 dd (8,0; 3''' 2''' 8''' O 4a 9''' 5''' 4''' 11 8a O O 1" 1''' O 6''' 7''' 2" O 1' 12 10 128 (21,91), 102 (9,05), 63 (11,19) 4'' 3" 6' 13 212 (100), 184 (22,76), 155 (7,28), 5'' 5' 3' 10''' 7,72 t (8,0); 6,82 dd (8,0; 1,0); 7,12 2,0); 7,25 t (8,0); 7,31 dd (8,0; 1,5); dd (7,5; 0,5); 7,36 dd (7,5; 2,0); 7,30 7,68 dd (8,5; 0,5); 7,83 dt (8,5; 1,5); t (7,5); 7,74 dd (8,0; 1,5) 7,44 dt (7,5; 1,0); 8,26 dd (8,0; 2,0) C-NMR (CD3OD DMSO-d6, 125 MHz): (CD3OD, 125 MHz): 179,2; 157,4; Công thức cấu tạo N Cấu trúc N3 (nhiễu xạ tia X) Các số vật lý liệu phổ N4 V1 tóm tắt bảng (C, ppm) 183,8; 162,9; 157,5; 147,7; 147,0; 147,9; 147,1; 136,4; 127,3; 125,3; sau: 138,2; 125,3; 122,6; 122,2; 116,5; 125,1; 123,6; 122,5; 121,5; 119,4; 111,2; 109,7; 108,4 117,1 13 IR (KBr, cm ) 1726, 1663, 1580, 1133, 757, 698 1728, 1663, 1580, 1133, 757, 698 98,2-100,5 C EI-MS m/z 416 (15,42), 401 (100), 83 (5,62), 416 (11,65), 401 (100), 83 (1,94), 239, 311 nm (rel int.,%) 55 (30,60) 55 (6,95) (CD3Cl3, 300 MHz): 7,26 m x 2; (CD3Cl3, 500 MHz): 7,19 m x 2; 7,40 m x 2; 0,97 s x 2; 1,9 d (6,3); 7,33 m x 2; 0,90 s x 2; 1,83 d 2,01 s; 5,48 d (9,9); 6,02 s; 6,45 d (7,0); 1,94 s; 5,40 d (10,0); 5,95 s; (9,6), 6,57 q (6,0) 6,38 d (10,0), 6,49 m C-NMR (CD3Cl3, 75 MHz): 10,7; 15,2; 26,8 (CD3OD, 125 MHz): 10,7; 15,1; (C, ppm) x 2; 63,0; 77,4; 105,6; 110,7; 114,2; 26,9; 27,8; 62,9; 77,4; 105,6; (tính toán: 588,3401) 115,0; 115,9; 127,2 x 2; 127,5 x 2; 110,7; 114,3; 115,1; 116,0; 127,3 (CDCl3, 500 MHz): 16,5 s; 7,37 d (7,5) x 2; 7,22 t (7,5) x 2; 7,11 t (7,5); 127,7; 129,0; 139,5; 139,9; 144,2; x 2; 127,5 x 2; 127,8; 129,2; 4,36 s; 4,92 m; 4,95 m; 3,21 dd (11,0; 7,0); 3,32 dd (10,5; 7,0); 1,75 s; 151,7; 152,0; 155,0; 155,8; 159,4; 139,6; 140,0; 143,9; 151,8; 152,0; 1,65 s; 1,5 s; 1,48 s; ,25 d (6,0); 1,3 d (6,0); 1,29 t (3,5); 4,1 q (4,5) 194,3 154,9; 155,9; 159,4; 194,2 IR (KBr, cm ) 3440, 2926, 2855, 1732, 1603, 1447, 1376, 1257, 1031 EI-MS m/z 588 (7,45); 573 (1,77); 519 (10,81); 485 (1,58); 465 (2,65); 452 (11,92); (rel int.,%) -1 H-NMR (H, ppm; J, Hz) 419 (4,49); 411 (7,77); 397 (100); 379 (1,51); 363 (14,88); 323 (14,06); 105 (32,88); 97 (13,43); 69 (70,31); 55 (37,42); 45 (6,43) [M] + H-NMR (H, ppm; J, Hz) 588,3400 o UV (EtOH) 289 (7,51); 267 (9,63); 235 (7,75); 177 (14,47); 135 (37,54); 121 (8,65); HRMS (ESI-TOF) Tinh thể hình phiến, không màu 235, 270, 295, 325 nm (sh) o -1 V1 (calophyllolid) Tinh thể hình lăng trụ, không màu 235, 270, 295, 325 nm (sh) Tinh thể hình phiến, không màu UV (MeOH) N4 (calophyllolid) 155,5 oC N3 (Tên đề nghị: Inocalophyllin C) Điểm chảy Mô tả Điểm chảy 155 C Các số vật lý liệu phổ N3 tóm tắt bảng sau: Mô tả OH 13 [...]... 3.1.2 Chiết xuất các hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u 3.1.2.1 Phương pháp chiết lỏng dưới áp suất (PLE) Từ 5 g bột vỏ quả bằng n-hexan (TT) và methanol (TT) đã chiết được lần lượt 0,05 g chất chiết sánh như d u, m u vàng, hi u suất 0,96% và 0,5 g chất chiết d u nhầy, m u n u đậm , hi u suất 9,98% Phổ NMR 3.1.2.2 Phương pháp chiết soxhlet 13 lần lượt 0, 02 g chất chiết rắn, m u vàng (hi u suất 0,95%) và... định quy trình Thẩm định quy trình theo các chỉ ti u: - Tính phù hợp của hệ thống Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống cho thấy sau 6 lần sắc ký các thông số đ u nằm trong giới hạn cho phép - Tính đặc hi u: các quy trình có tính đặc hi u - Tính tuyến tính: kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ calophyllolid đối chi u cũng như calophyllolid trong m u và... 55 S aureus và M smegmatis, không có tác dụng trên Ps aeruginosa 3.1.4 Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 3.1.4.1 Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa Từ 40 g cao n -hexan đã phân lập được: hợp chất N1 = 8,1 mg; hợp Thời gian l u [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 o Các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u có tác dụng kháng khuẩn trên chất N2 = 105,0 mg Không quá 20 ppm li u (nhựa, vỏ quả Mù u) và... Nghiên c u thiết lập chất chuẩn đối chi u (ĐC) Chiết xuất, phân lập và tinh chế để thu được hợp chất đủ tinh khiết làm chất chuẩn đối chi u Xây dựng ti u chuẩn chất lượng với mức chất lượng, chỉ ti u , phương pháp thử theo hướng dẫn của WHO và ISO Bảng 3.3 Tóm tắt ti u chuẩn chất lượng của 4-hydroxyxanthon (ĐC) Sơ đồ phân lập N1, N2 bằng sắc ký lỏng chân không Chỉ ti u Tính chất Định tính Phổ UV -Vis... d u Mù u m u thử (100 g/đĩa)/m u chuẩn % (n =2) Cao Không ít hơn 96,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng 3.3 Ứng dụng chất đối chi u đã thiết lập để kiểm nghiệm nguyên Đường kính vòng kháng khuẩn Bộ C-NMR (CD3Cl3, 75 MHz): 10,7; 15,2; 26,8 x 2; 63,0; 77,4; 105,6; 110,7; 114,2; 115,0; 115,9; 127,2 x 2; 127,5 x 2; 127,7; 129,0; 139,5; chất chiết sánh như d u, m u vàng sậm (hi u suất 4,05%) Đĩa kháng sinh... bột vỏ quả bằng ethyl acetat đã chiết được 20 g cao ethyl acetat, hi u suất 0,5% Cao này được dùng cho phân lập kế tiếp 3.1.3 Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Bảng 3.2 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của cao nhựa và vỏ quả Điểm chảy Tạp chất h u cơ 154-156 oC Tạp chất bay hơi Tạp chất vô cơ Không quá 1,0 % Định lượng Không ít hơn 95,0% phận Nhựa Vỏ quả S aureus Ps aeruginosa... phẩm có d u Mù u 3.3.2.1 Khảo sát chọn chương trình dung môi Cột Zorbax 250 mm × 4,6 mm, 5 μm Tốc độ dòng: 1 ml/phút Thể tích tiêm m u: 10 μl Nhiệt độ cột: 40 oC Bước sóng phát hiện 270 nm Pha động: acetonitril-dung dịch acid acetic 2% với chương trình dung môi như sau: Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng MeOH-nước Thời gian (phút) 0 30 35 40 Acetonitril (%) 20 80 20 20 Dung dịch... tương Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng n -hexan quan r > 0,995 3.1.1.2 Phương pháp dùng dung môi phân cực không thay đổi pH - Độ chính xác và độ đúng Kết quả thống kê cho thấy các quy trình có tỷ lệ hồi phục nằm trong giới hạn cho phép của tỷ lệ hồi phục lý thuyết 98% - 102%; %RSD: < 2,0 và %RSD < 2 đối với độ lặp lại; %RSD < 3 đối với độ chính xác trung gian 3.3.2 Xác định calophyllolid... 3.3.1 Xác định calophyllolid trong nhựa và vỏ quả Mù u 3.3.1.1 Khảo sát nhiệt độ cột và xác định mảnh ion đặc trưng Bảng 3.16 Khảo sát chương trình nhiệt độ cột Nhiệt độ buồng cột Tốc độ gia nhiệt o pháp chiết n-Hexan Dung môi 41,0 Âm tính 36,0 Methanol Dung môi 45,3 - 48,4 Methanol PLE 58,1 - 47,0 EtOAc Ngấm kiệt 58,0 - 47,0 n-Hexan PLE 53,8 - 37,5 Methanol Soxhlet 50,0 - 45,5 60-300 C/9 phút ( C/phút)... 117,1 Điểm chảy Tạp chất h u cơ 228-230 oC Tạp chất bay hơi Định lượng Không quá 1,0 % Không ít hơn 94,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng Không ít hơn 90,0% Sơ đồ phân lập N 3, N4 bằng sắc ký lỏng chân không 3.1.4.2 Phân lập các hợp chất phenol từ vỏ quả Từ 20 g cao EtOAc đã phân lập được: hợp chất V1 = 26,0 mg Bảng 3.4 Tóm tắt ti u chuẩn chất lượng của calophyllolid (ĐC) Chỉ ti u Mức chất lượng Tính chất