Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Các nguyên tắc sinh học kỹ thuật chuyển gen Các bước kỹ thuật chuyển gen Một số phương pháp chuyển gen thực vật 3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 3.1.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens 3.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus 3.2.1 Chuyển gen súng bắn gen (gene gun) 3.2.2 Chuyển gen xung điện (electroporation) 3.2.3 Chuyển gen vi tiêm (microinjection) 3.2.4 Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm 3.2.5 Chuyển gen phương pháp hóa học 3.2.6 Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) B NỘI DUNG Các nguyên tắc sinh học kỹ thuật chuyển gen Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến trình chuyển gen sau: - Không phải toàn tế bào thể tính toàn (totipotency) - Các khác có phản ứng không giống với xâm nhập gen ngoại lai - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả biến nạp tái Thủy Hồng Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng sinh Ở tế bào khác có hai trường hợp xảy ra: số tế bào tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng, số khác hoàn toàn khả biến nạp tái sinh - Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan - Thành tế bào ngăn cản xâm nhập ADN ngoại lai Vì thế, chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus bắn gen phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen phương pháp xung điện, siêu âm vi tiêm - Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen - Các ADN (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome - Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào - Trong đó, ADN virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) Các bước kỹ thuật chuyển gen Từ người ta khám phá thí nghiệm chuyển gen thực nhờ loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, nhà khoa học tin Agrobacterium chuyển gen vào tất trồng Nhưng sau kết thực tế cho thấy chuyển gen Agrobacterium thực ngũ cốc (một mầm) mà hàng loạt kỹ thuật chuyển gen khác phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bắn gen vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện Thủy Hồng Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) Đến nay, nhờ cải tiến vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen A tumefaciens thành công ngũ cốc đặc biệt lúa Kỹ thuật trở nên kỹ thuật đầy triển vọng chuyển gen thực vật Quá trình chuyển gen thực qua bước sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm - Phân lập gen (PCR sàng lọc từ thư viện cADN từ thư viện genomic ADN) - Gắn gen vào vector biểu (expression vector) để biến nạp - Biến nạp vào E coli - Tách chiết ADN plasmid - Biến nạp vào mô tế bào thực vật phương pháp khác kể - Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc - Tái sinh biến nạp - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR Southern blot) đánh giá mức độ biểu chúng (Northern blot, Western blot, ELISA thử nghiệm in vivo khác ) Nguyên liệu để thực biến nạp tế bào thực vật riêng rẽ, mô hoàn chỉnh Cản trở lớn tiếp nhận ADN phần lớn sinh vật thành tế bào Muốn làm thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym điều kiện thích hợp người ta tạo tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng Sau biến nạp người ta tách enzym phân giải tế bào phát triển, thành tế bào tạo thành Các tế Thủy Hồng Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng bào biến nạp nuôi cấy môi trường nhân tạo thích hợp với chất kích thích sinh trưởng để tạo thành hoàn chỉnh Sau phương pháp phân tích genome PCR, Southern blot, Northern blot thực để tìm xác biến đổi gen Một số phương pháp chuyển gen thực vật Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu chuyển gen trực tiếp chuyển gen gián tiếp 3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 3.1.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens * Nguyên lý chung Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen thực vật phương pháp hiệu phổ biến nhờ vào khả gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật cách xác ổn định Sự chuyển gen thực vật dùng A tumefaciens dựa nguyên lý hình sau Hình1 Agrobacterium mang plasmid gây khối u thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid chứa gen vir vùng gen cần chuyển (TThủy Hồng Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng DNA) Gen quan tâm chèn vào vùng T-DNA Các tế bào tổn thương thực vật tiết hợp chất bảo vệ, hợp chất kích thích biểu gen vir Agrobacterium Vir protein tạo T-strand từ vùng T-DNA Ti-plasmid Sau vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển Trong tế bào thực vật, protein vir tương tác với T-strand tạo phức hệ (T- complex) Phức hệ vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào gen thực vật biểu gen quan tâm Bộ gen vi khuẩn Ti plasmid Hình Vi khuẩn A.tumefaciens Cụ thể sau: Phương pháp sử dụng Ti plasmid A.tumefaciens Ti plasmid Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào Ti plamid gồm hai thành phần: TDNA vùng Vir T- DNA chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, nhờ mà gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào T- DNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục (auxin, cytokinie), gen tổng hợp chất Opine gen gây khối u Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, đoạn Thủy Hồng Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng vùng xâm nhập vào phân tử ADN thực vật Trong plasmid vị trí T- DNA giới hạn bờ trái bờ phải Vùng Vir phụ trách khả lây nhiễm Chúng gồm nhóm từ VirA đến VirG VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp Để thiết kế vector dùng biến nạp: trước hết cắt gen điều hòa sinh trưởng cục bộ, sau gắn thêm gen thị (kháng thuốc chất diệt cỏ) với đoạn điều khiển phù hợp để chọn thể biến nạp cuối gắn gen cần biến nạp * Các plasmid Agrobacterium sử dụng công nghệ gen thực vật gồm có loại: vector liên hợp vector nhị thể - Vector liên hợp (Cointegrated vector) Vector liên hợp dựa tái tổ hợp plasmid Một vector liên hợp gồm có: vị trí để ghép gen quan tâm, thường vị trí có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E.coli Gen thị kháng sinh giúp cho chọn lọc vi khuẩn E.coli, Agrobacterium gen chọn lọc hoạt động tế bào thực vật Như vector liên hợp hình thành từ plasmid mang trình tự ADN mong muốn plasmid có chứa vùng vir gen vùng bờ lặp lại TADN Sau tái tổ hợp, vector liên hợp tạo dùng cho chuyển gen vào thực vật - Vector nhị thể (Binary vector) Vector nhị thể hệ thống dùng plasmid riêng biệt: cung cấp T-ADN độc tính gây khối u, plasmid Ti plasmid có khả thâm nhập vào tế bào thực vật (mang gen vir) Plasmid thứ mang gen chọn lọc thực vật gen ghép vào gen thực vật Khi plasmid đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, sản phẩm mang gen vir Thủy Hồng Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng đưa T-AND vào tế bào thực vật, T-ADN nằm phân tử ADN khác * Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen thu nhiều kết quả, đặc biệt chuyển gen vào lúa mì lương thực quan trọng Nhiều giống lúa chuyển gen có giá trị đặc biệt giống lúa Golden rice có chứa hàm lượng vitamin A cao gấp nhiều lần so với lúa thông thường Nhờ giống lúa giải vấn đề khó khăn thiếu vitamin A nước phát triển, đặc biệt Châu Phi * Ưu điểm - Gen bị đào thải - Số lượng Do tránh tượng ức chế lẫn câm lặng lẫn - Tồn bền vững thể thực vật phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, phương pháp khác gen mục tiêu tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu dễ dàng bị tách sau * Nhược điểm - Có phổ công giới hạn - Gây khối u cho khỏa tự hai mầm lại không gây khối u cho mầm (do mầm thuộc nhóm tiến hoá nhất, tích lũy nhiều chế kháng bệnh hai mầm bị thương tế bào có xu hướng hóa gỗ không phân chia mạnh để tái tạo tiếp hợp chất phenol hai mầm ) 3.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta sử dụng virus làm vector chuyển gen vào trồng Chuyển gen nhờ virus thuận lợi virus dễ xâm nhập lây lan thể thực vật động vật đồng thời virus mang đoạn Thủy Hồng Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng ADN lớn nhiều so với khả plasmid Tuy nhiên, virus làm vector chuyển gen cần phải có tiêu chuẩn sau: - Hệ gen virus phải ADN - Virus có khả di chuyển từ tế bào sang tế bào khác qua lỗ vách tế bào - Có khả mang đoạn ADN (gen) mới, sau chuyển gen vào tế bào thực vật - Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây) - Không gây tác hại đáng kể cho thực vật Đối chiếu tiêu chuẩn trên, có hai loại virus sử dụng làm vector chuyển gen caulimovirus geminivirus Tuy nhiên, việc sử dụng virus để chuyển gen thực vật sử dụng ADN virus khó ghép nối với hệ gen thực vật 3.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 3.2.1 Chuyển gen vi đạn (gene gun) Là phương pháp dùng thiết bị bắn vi đạn mang ADN ngoại lai vào tế bào thực vật Đạn thường làm kim loại nặng: Tungsten, Vàng, Bạc, a Nguyên lý Sử dụng viên đạn có kích thước hiển vi áp lực xung khí để đẩy viên qua lớp tế bào, mô để đưa lớp ADN bọc tiếp cận với máy di truyền tế bào Hiện nay, có loại thiết bị để chuyển gen vi đạn là: Súng bắn gen (gengune) hệ thống dội bom Thủy Hồng Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Súng bắn gen Hệ thống dội bom b Các bước tiến hành Ngâm viên đạn có kích thước cực nhỏ (vi đạn) vàng tungsten với đường kính khoảng 0,5 - 1,5 µm với dung dịch có chứa đoạn ADN ngoại lai sau kết tủa ADN bao quanh viên đạn, vi đạn làm khô đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5 - 0,9 cm Đĩa kim loại gắn vào đầu viên đạn lớn nhựa, vật liệu nhẹ Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen hệ thống dội bom Khi bắn, bùng nổ khí tạo áp suất đẩy viên đạn lớn Thủy Hồng Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Khi viên đạn lớn khỏi đầu nòng súng bị cản lại lưới thép mịn, vi đạn tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới 1300 m/giây đến đối tượng bắn, xuyên qua thành tế bào phóng thích phân tử ADN ngoại lai giúp ADN ngoại lai hợp vào nhiễm sắc thể tế bào thực vật Sau bắn, tiến hành tách lấy mô, tế bào nuôi cấy invitro để tái sinh Các gen cần chuyển tái tổ hợp vào hệ gen cây, từ tạo thành chuyển gen Chỉ có tỷ lệ tế bào mang gen chuyển cần phải chọn lọc Người ta thường dùng khí nén helium áp lực cao để bắn gen Sơ đồ nguyên lý hoạt động hệ thống dội bom Ưu điểm - Thao tác dễ dàng, chuyển gen vào nhiều loại tế bào mô - Các tế bào chuyển gen có tỉ lệ sống sót cao - Cho phép đưa gen vào tế bào vị trí mong muốn Thủy Hồng 10 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Biến nạp DNA: gen đặc hiệu tạo dòng plamid sau plasmid đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc chức gen protein - Chuyển plasmid trực tiếp tế bào: tế bào vi khuẩn chứa plasmid ủ với dòng khác không mang plasmid lại có đặc tính mong muốn khác Ðiện áp xung điện tạo lỗ, cho phép số plasmid khỏi tế bào lại vào tế bào khác Sau tế bào mong muốn chọn lọc tính kháng thuốc kháng sinh phương pháp tương tự khác (Withers, 1995) Kiểu chuyển gen thực loài khác Vì vậy, lượng lớn plasmid sinh trưởng khuẩn lạc vi khuẩn nhân lên cách nhanh chóng sau chuyển vào tế bào nấm men kỹ thuật xung điện để nghiên cứu (Gunn, 1995) - Dung hợp tế bào kích thích: tạo thành lỗ thủng màng xảy xung điện chớp nhoáng tạo cho thấy kích thích dung hợp tế bào (Weber Berrg, 1995) - Phân phối thuốc qua da: Chỉ xung điện gây lỗ tạm thời màng sinh chất, lỗ tương tự tạo màng lipid kép lớp da chết phía Các lỗ cho phép thuốc qua da đến mô đích Các bệnh nhân thích phương pháp phương pháp tiêm (không cần kim tiêm) tránh vấn đề phân hủy hấp thu không liệu pháp uống thuốc (oral medication) hệ tiêu hóa (Praustmitz, 1993) - Liệu pháp hóa điện khối u ung thư (cancer tumor electrochemotherapy): nhà khoa học nghiên cứu tiềm kỹ thuật xung điện để tăng tính hiệu liệu pháp hóa học Khi sử dụng kỹ thuật xung điện để biến nạp DNA, xung điện phá vỡ màng tế bào ung thư làm tăng lượng thuốc đến vị trí Một số nghiên cứu cho làm giảm phát triển khối u áp dụng phương pháp cho tế bào ung thư hệ thống mô hình động vật (Maeda, 1998) - Liệu pháp gen: kỹ thuật xung điện cho phép vector mang gen quan tâm biến nạp qua da đến mô đích Khi hợp vào tế bào thể, protein tổng hợp từ gen thay gen sai hỏng điều trị rối loạn di truyền 3.2.3 Chuyển gen vi tiêm (microinjection) Thủy Hồng 16 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Là phương pháp sử dụng thiết bị vi kim tiêm kính hiển vi số thao tác khác để chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần tế bào đơn a Nguyên lý Một lượng nhỏ ADN tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần tế bào nguyên vẹn cách học kính hiển vi Quá trình chuyển gen vi tiêm tiến hành hệ thống thiết bị vi tiêm Hệ thống gồm có hai phận kính hiển vi máy vi thao tác Ðể biến nạp gen vào tế bào phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo kim tiêm kim giữ • Kim tiêm tạo từ ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,11,5 mm có sợi volfram mảnh nhờ hệ thống thiết bị làm kim • Kim giữ chế tạo từ ống capillar có đầu nhẵn bình thường để cố định tế bào trình vi tiêm b Các bước tiến hành Ðể biến nạp gen vào tế bào phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo kim tiêm kim giữ • Kim tiêm tạo từ ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,11,5 mm có sợi volfram mảnh nhờ hệ thống thiết bị làm kim • Kim giữ chế tạo từ ống capillar có đầu nhẵn bình thường để cố định tế bào trình vi tiêm  Chuẩn bị dung dịch gen chuyển: gen chuyển xen vào vector plasmid  Nạp gen chuyển vào kim tiêm cách ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 bơm trực tiếp dung dịch gen vào Thủy Hồng 17 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng  Lắp kim tiêm kim giữ vào máy vi thao tác, đưa protoplast cần tiêm vào đĩa petri có chứa môi trường đặt kính hiển vi, giữ protoplast vào đầu kim giữ lực hút syringe  Điều chỉnh kính hiển vi điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí protoplast Đẩy gen vào cách vặn nhẹ syringe  Khi thấy protoplast phồng to trở nên sáng dừng lại kéo nhanh kim tiêm Protoplast sau tiêm di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước tiêm vào protoplast  Sau đem protoplast nuôi môi trường nuôi cấy thích hợp Tiếp theo nuôi cấy invitro, tái sinh chọn lọc chuyển gen  Ưu điểm - Quyết định đưa ADN vào loại tế bào - Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào - Có thể đưa cách xác chí vào tận nhân quan sát - Các tế bào có cấu trúc nhỏ hạt phấn tế bào tiền phôi hạn chế số lượng tiêm xác - Có thể nuôi riêng lẻ tế bào vi tiêm biến nạp vào giống  Nhược điểm - Mỗi lần tiêm phát tiêm với tế bào - Thao tác làm đòi hỏi độ xác cao 3.2.4 Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm Là kỹ thuật dùng sóng siêu âm để chuyển gen vào tế bào trần (protoplast) a Nguyên lý: Sóng siêu âm làm cho lớp màng protoplast biến đổi tạo lỗ giúp cho ADN ngoại lai xâm nhập vào tế bào Thủy Hồng 18 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng b Các bước tiến hành Sau tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù Cắm đầu siêu âm máy phát siêu âm ngập hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3mm Cho máy phát siêu âm với tần số 20KHz theo nhịp ngắn, nhịp khoảng 100 mili giây Số nhịp khoảng từ - nhịp với tổng thời gian tác động từ 600 - 900 mili giây Lúc này, sóng siêu âm làm cho lớp màng protoplast biến đổi tạo lỗ giúp cho ADN ngoại lai xâm nhập vào tế bào Sau siêu âm, đem protoplast nuôi môi trường thích hợp, chọn lọc để tách protoplast chuyển gen Nuôi cấy invitro để tái sinh Chọn lọc đưa trồng môi trường  Ưu điểm:  Nhược điểm: 3.2.5 Chuyển gen phương pháp hóa học Chuyển gen phương pháp hóa học phương pháp chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ chất hóa học polyethylen glycol (PEG) Khi có mặt PEG, màng protoplast bị thay đổi protoplast thu nhận ADN ngoại lai vào bên tế bào Phương pháp chuyển gen hóa chất áp dụng với nhiều loài thực vật khả chuyển gen với tần số chuyển gen thấp Tuy nhiên, với khả tạo số lượng lớn protoplast, khắc phục hạn chế phương pháp 3.2.6 Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) (Ray Wu & cộng sự, 1988) Phương pháp chuyển gen qua ống phấn phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô invitro Thủy Hồng 19 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Nguyên tắc phương pháp ADN ngoại lai chuyển vào theo đầu ống phấn, chui vào bầu nhụy Thời gian chuyển gen vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy lúc bắt đầu đưa tinh tử vào thụ tinh, tốt chuyển gen xảy trình thụ tinh noãn cho tế bào hợp tử chưa phân chia Như vậy, chuyển gen xảy tế bào sinh dục tái sinh không hình thành thể khảm - Sau thời gian hoa nở 1- giờ, cắt 2/3 3/4 phần hoa lúa - Sau cắt hoa, dùng ống mao quản nhỏ có đường kính 0,2mm đưa dung dịch ADN tái tổ hợp mang gen mong muốn vào đầu ống nhụy bị cắt (nồng độ ADN tái tổ hợp khoảng 50 µg/ml) - Bao lúa lại, chờ lúa chín thu hái - Phân tích xác định kết chuyển gen hệ sau Lợi ích nguy trồng chuyển gen 4.1 Lợi ích Hiện nay, sản phẩm lương thực- thực phẩm công nghệ sinh học tạo có mặt thị trường Những trồng biến đổi gen giống trồng truyền thống chúng có thêm số đặc điểm cải thiện Chúng có lợi cho nông dân mà cho người tiêu dùng Người nông dân gặt hái vụ mùa bội thu, người tiêu dùng quanh năm lại có nhiều loại sản phẩm để lựa chọn Ngoài ra, giống tạo công nghệ sinh học có tiềm bảo vệ môi trường Trên thị trường nay, có số loại trồng công nghệ sinh học cải thiện tình trạng chất lượng như: - Có khả chống chịu bệnh - Cho phép giảm sử dụng thuốc trừ sâu - Tăng thành phần dinh dưỡng Thủy Hồng 20 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Tăng thời gian bảo quản Nhìn chung, việc sử dụng giống trồng chuyển gen đem lại lợi nhuận đáng kể cho nước phát triển “Thế hệ đầu tiên” giống chứng minh khả tăng suất trồng, giảm giá thành sản phẩm, tăng lợi nhuận nông nghiệp góp phần bảo vệ môi trường Hiện nay, nghiên cứu hướng đến trồng biến đổi gen “thế hệ thứ hai”, tập trung vào việc tăng chất lượng dinh dưỡng khả chế biến Các giống trồng khẳng định giá trị chúng quốc gia có hàng triệu người dân bị thiếu hụt thực phẩm Thực vật với khả tự bảo vệ chống lại côn trùng cỏ dại giúp giảm liều lượng nồng độ thuốc trừ sâu sử dụng Ví dụ: Trung Quốc Bt giảm thuốc diệt côn trùng 40 kg/ha Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước vùng sử dụng thuốc Ví dụ: nước chảy qua cánh đồng Bt Mỹ hoàn toàn không nhiễm thuốc trừ sâu suốt năm nghiên cứu Bộ nông nghiệp Mỹ Thực vật kháng thuốc diệt cỏ làm cho việc sử dụng biện pháp không cày đất, yếu tố quan trọng việc bảo tồn đất đai trở nên phổ biến Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen Canada phải cày cấy so với trồng cải dầu truyền thống Cây chuyển gen tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, với diện tích đất canh tác thu nhiều lương thực Ví dụ: Mỹ, năm 1999, có 66 triệu ruộng ngô tránh sâu đục thân 4.2 Nguy tiềm ẩn * Cây chuyển gen đánh an toàn môi trường? Thủy Hồng 21 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Các chuyển gen đánh giá cẩn thận ảnh hưởng tới môi trường trước đưa thị trường Chúng nhà chức trách đánh giá tuân theo quy tắc chuyên gia môi trường khắp giới đưa (Hội đồng nghiên cứu quốc gia Mỹ năm 1989; Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế năm 1992; phủ Canada năm 1994) Những người đánh giá ảnh hưởng chuyển gen gồn người tạo chúng, quan kiểm soát nhà khoa học Hầu hết quốc gia sử dụng quy trình đánh giá tương tự để xét xem tương tác chuyển gen môi trường Bao gồm thông tin vau trò gen đưa vào, ảnh hưởng vây nhận gen, đồng thời hỏi cụ thể ảnh hưởng không mong muốn như: ảnh hưởng lên sinh vật sinh vật cần diệt môi trường Cây chuyển gen có tồn môi trường lâu bình thường xâm chiếm nơi cư ngụ không? Khả gen phát tán ý muốn từ chuyển gen sang loài khác hậu * Cây chuyển gen, rủi ro Khả xẩy lai chéo xa gen chuyển vào với cỏ họ hàng, khả tạo loại cỏ Lai chéo xa lai không mong muốn trồng với có quan hệ họ hàng Lo ngại ảnh hưởng chuyển gen môi trường khả tạo loài cỏ thông qua lai chéo xa với họ hàng hoang dại đơn giản tồn lâu tự nhiên Khả xảy ra, đánh giá trước trình chuyển gen kiểm soát sau đưa trồng Một nghiên cứu năm 1990 kéo dài 10 năm chứng minh thực vật chuyển gen (như cải dầu, khoai tây, ngô, củ cải đường) không làm tăng nguy xâm chiếm hay tồn lâu dài Thủy Hồng 22 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng môi trường tự nhiên so với không chuyển gen tương ứng Các tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng đồng thời điều tra so với không chuyển gen tương ứng (Crawley cộng sự, 2001) Tuy nhiên, nhà nghiên cứu phát biểu kết nghĩa thay đổi di truyền làm gia tăng tính hoang dại hay khả phát tán trồng mà chúng trồng suất khó tồn lâu dài mà không canh tác Do đó, việc đánh giá chuyển gen theo trường hợp quy định quan trọng * Ảnh hưởng trực tiếp lên sinh vật sinh vật cần diệt Tháng năm 1999, xuất báo cáo hạt phấn từ ngô Bt có ảnh hưởng bất lợi ấu trùng bướm Monarch Báo cáo gây lo lắng nguy tiềm tàng bướm Monarch sinh vật sinh vật cần diệt khác Một số nhà khoa học lại cho cần phải thận trọng việc giải thích kết nghiên cứu nghiên cứu phản ánh tình khác với thực trạng môi trường Tác giả nghiên cứu tiến hành phòng thí nghiệm khởi đầu vấn đề quan trọng dựa vào không đủ sở để rút kết luận nguy quần thể bướm Monarch cánh đồng Một báo cáo Ủy ban bảo vệ môi trường Mỹ số liệu chứng minh protein trồng ảnh hưởng bất lợi sinh vật sinh vật cần diệt Thêm vào đó, nghiên cứu trường Đại học Linnois bướm Monarch không bị gây hại hạt phấn Bt điều kiện đồng ruộng thực * Phát triển tính kháng côn trùng Thủy Hồng 23 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Một lo ngại khác thực vật Bt phát triển tính kháng côn trùng Bt Chính phủ, Bộ ngành nhà khoa học đưa kế hoạch quản lý tính kháng côn trùng để giải vấn đề Những kế hoạch bao gồm quy định cánh đồng trồng chuyển gen kháng côn trùng phải có không chuyển gen để côn trùng phát triển mà không bị chọn lọc giống kháng sâu Những biện pháp quản lý tính kháng khác nhà khoa học khắp giới xây dựng Những thành tựu, triển vọng chủ yếu tạo giống trồng chuyển gen Công nghệ chuyển gen vào trồng không vấn đề phải tranh cãi mà trở thành kỹ thuật thông dụng để tạo giống trồng mới, phục vụ trực tiếp cho trồng trọt Những mốc quan trọng phát triển kỹ thuật chuyển gen thực vật là: Năm 1980: Lần thực chuyển ADN ngoại lai vào nhờ Agrobacterium Năm 1983: Tạo marker chọn lọc thị màu sắc, thị kháng với kháng sinh Thiết kế lại plasmid Ti (loại bỏ gen gây khối u, cài gen mong muốn vào plasmid Ti) Năm 1984: Thực chuyển gen trực tiếp gián tiếp vào tế bào protoplast Năm 1985: Tạo giống trồng kháng virus, đưa chuyển gen đồng ruộng Năm 1987: Chuyển gen kháng sâu súng bắn gen Năm 1988: Tạo khoai tây chống nấm, cà chua chín chậm Năm 1990: Chuyển gen bất dục đực cho ngô vào phôi nuôi cấy vô tính Năm 1992: Chuyển gen cho lúa mì Thủy Hồng 24 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Năm 1994: Thương mại hóa cà chua chuyển gen Đây sản phẩm chuyển gen thương mại hóa Năm 1998: Toàn giới có 48 giống trồng chuyển gen thương mại hóa Năm 1999: Chuyển gen tạo giống lúa có giá trị dinh dưỡng hàm lượng vitamin A cao Từ năm 2000 đến nay, trồng chuyển gen không ngừng phát triển Năm 2000, toàn giới có 44,2 triệu trồng chuyển gen đến năm 2003 tăng lên 67,6 triệu Có nước trồng chuyển gen phổ biến là: Mỹ 42,8 triệu ha; Acgentina 13,9 triệu ha; Canada 4,4 triệu ha; Braxin triệu ha; Trung Quốc 2,8 triệu ha; Nam Phi 0,4 triệu Các chuyển gen đậu tương (chiếm 61%), ngô (23%), (11%), đu đủ (21%) Các gen chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ, gen kháng sâu Các hướng tạo trồng chuyển gen 6.1 Chuyển gen kháng sâu Trong 30 năm gần đây, sản xuất nông nghiệp, người ta sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt vi khuẩn Bacillus thuringiensis tạo Vi khuẩn sản xuất protein kết tinh độc ấu trùng côn trùng không gây độc động vật có xương sống Tinh thể protein độc tố vi khuẩn vào côn trùng bị enzym protease phân giải thành đoạn peptit, có đoạn khối lượng khoảng 68.000 dalton chứa khoảng 1200 axit amin làm hỏng ruột côn trùng Các gen mã hóa độc tố nằm plasmid vi khuẩn, gọi chung Cry (crystal) Thủy Hồng 25 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Hình Chuyển gen kháng sâu bệnh 6.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ Thuốc diệt cỏ glyphosat thuốc có tác dụng diệt cỏ tốt, dễ tự phân hủy gây ô nhiễm môi trường Cơ chế diệt cỏ thuốc kìm hãm hoạt động enzym có tên enol pyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS) Enzym EPSPS có chức chuyển hóa sản phẩm quang hợp thành axit mang mạch vòng có tên axit sikimic Axit sikimic không hình thành làm rối loạn toàn trình trao đổi chất cỏ làm cỏ chết Cây trồng tạo có hàm lượng hoạt tính enzym EPSPS cao gấp lần so với trồng bình thường hoàn toàn chống chịu với thuốc diệt cỏ glyphosat 6.3 Chuyển gen tạo kháng virus gây bệnh Có nhiều cách tạo kháng virus, chuyển gen mã hóa protein vỏ virus, chuyển gen tạo enzym phân giải virus (ví dụ enzym ribozyme), chuyển gen có trình tự đối (antisens) với ARN virus Các đối khóa lại chép phiên mã ARN virus Kỹ thuật chuyển gen mã hóa vỏ protein virus thường sử dụng phổ biến Virus có cấu tạo phần: phần lõi axit nucleic (ADN ARN) phần vỏ protein Khi có mặt gen mã hóa protein vỏ virus tế bào gây hiệu ứng kìm hãm tổng hợp protein vỏ gen tạo vỏ virus Do virus không nhân lên Thủy Hồng 26 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Nhiều loại trồng chuyển gen tạo vỏ nhiều loại virus nên kháng virus gây bệnh như: đu đủ kháng với virus gây bệnh đốm vòng; thuốc kháng với virus khảm dưa chuột; thuốc kháng với virus khảm alfa; khoai tây kháng với virus X, virus Y; khoai tây kháng với virus xoăn lá; cam, quýt kháng bệnh virus gây tàn lụi tristeza … Hình Cây thuốc chuyển gen kháng virus CMV đối chứng Hình Lá đu đủ chuyển gen kháng PRSV đối chứng (PRSV: Papaya ringspor virus, gây bệnh đốm vòng) 6.4 Chuyển gen tạo sản xuất protein động vật Các nhà khoa học tìm cách giải trình tự gen mã hóa cho protein động vật, thiết kế lại, sau chuyển gen vào thực vật, biến thực vật thành thể sản xuất protein động vật Thủy Hồng 27 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Ví dụ: gen tổng hợp lactoferrin protein có sữa người, chuyển vào khoai tây, lúa thu khoai tây, lúa có khả tổng hợp lactoferrin Một hướng quan trọng khác sản xuất “thực phẩm chức năng” Điều có nghĩa cần chuyển nhiêu gen tổng hợp protein có tác dụng kháng nguyên vào đối tượng trồng rau, đậu, ăn Do tạo vacxin Nhờ ăn rau, đậu, hoa, trồng chuyển gen tạo vacxin để thay cho việc tiêm vacxin phòng bệnh Hình Thực phẩm chức 6.5 Chuyển gen thay đổi hàm lượng chất lượng chất dinh dưỡng Đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein chứa nhiều methionin vào đậu tương ngô, kết làm tăng loại protein giàu methionin lên 8% tổng số protein có hạt Người ta chuyển thành công gen mã hóa cho việc tổng hợp chất thaumatin (chất có độ gấp hàng nghìn lần so với đường mía) vào khoai tây Kết toàn thân, lá, rễ củ khoai tây Thủy Hồng 28 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Hình Hạt gạo vàng Người ta chuyển nhóm gen mã hóa cho enzym chuyển hóa pyrophosphat thành β- caroten Gạo có hàm lượng β- caroten giải vấn đề thiếu vitamin A cho người 6.6 Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc Hình 10 Đa dạng màu hoa Màu sắc hoa, đặc biệt hoa có màu xanh, nhung đen có giá trị Trong mô cánh hoa, tế bào biểu bì thường chứa sắc tố tạo màu sắc hoa Có nhóm anthocyanin phát dẫn xuất chất pelargonidin, cyanidin delphinidin Thủy Hồng 29 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Các sắc tố dẫn xuất pelargonidin thường có màu da cam, hồng đỏ; cyanidin có màu đỏ màu hoa cà; delphinidin có màu tía, màu xanh màu xanh đen Sự phối hợp nhóm anthocyanin tạo phổ màu sắc hoa rộng Trên sở biết gen mã hóa cho enzym tham gia vào biến đổi sắc tố, người ta chuyển gen mã hóa, gen ức chế hoạt động enzym nhằm điều khiển hướng chuyển hóa sắc tố, từ tạo hoa có màu sắc khác Thủy Hồng 30