BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM VẬT LIỆU HẤP PHỤ THÍCH HỢP ĐỂ SẢN XUẤT ENZYME LIPASE CỐ ĐỊNH ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIODIESEL MÃ SỐ: Đ2015-02-115 Chủ nhiệm đề tài: TS Bùi Xuân Đông Đà Nẵng, 08/2016 NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI TT Họ tên Đơn vị công tác lĩnh vực chun mơn Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng TS Bùi Xuân Đông TS Phạm Thị Mỹ Khoa Sinh – Môi Trường – Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng ThS Nguyễn Thị Hoàng Yến Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng CÁC CHỮ VIẾT TẮT Biodiesel : Nhiên liệu diesel sinh học UI : Đơn vị enzyme quốc tế (đo hoạt lực enzyme) HPLC : Phương pháp sắc ký lỏng cao áp GC : Sắc kí khí TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam ASTM : American Society for Testing and Materials EN : Tiêu chuẩn Châu Âu JIS : Tiêu chuẩn Nhật Bản CSt : Đơn vị đo độ nhớt AV : Acid value – Chỉ số acid dầu E : Enzyme CMC : Carboxylmethyl cellulose CM-dextran : Carboxylmethyl dextran DEAE : Diethylethanolamine FAME : Tập đoàn FAME PVA : Polyvinyl alcohol BSA : Bovine Serum Albumin THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thơng tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu tìm kiếm vật liệu hấp phụ thích hợp để sản xuất enzyme lipase cố định ứng dụng sản xuất biodiesel - Mã số: Đ2015-02-115 - Chủ nhiệm: TS Bùi Xuân Đông - Thành viên tham gia: TS Phạm Thị Mỹ, ThS Nguyễn Thị Hồng Yến - Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng - Thời gian thực hiện: từ 01 tháng 10 năm 2015 đến 30 tháng 09 năm 2016 Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp sản xuất enzyme lipase cố định có hoạt tính xúc tác mạnh tính đặc hiệu chất ổn định Tính sáng tạo: - Chế tạo enzyme cố định phương pháp hấp phụ vật lí, gói gel tạo liên kết enzyme chất mang - Khảo sát khả thực phản ứng transester (phản ứng chuyển vị ester triacylglycerol methanol) enzyme lipase cố định sản xuất biodiesel từ dầu thực vật mỡ động vật Tóm tắt kết nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu chế tạo loại enzyme lipase cố định vật liệu silica gel, gel alginate siêu vi hạt “nano sắt từ chitosan” - Enzyme lipase cố định silica gel alginate có số đặc điểm sau: lượng enzyme cố định chất mang silica gel 1,97 mg/g, thấp so với lượng enzyme cố định gel alginate (3,01 mg/g), nhiên enzyme cố định silica gel có hoạt độ riêng (17 UI/mg) đệm phosphate, cao so với enzyme cố định gel alginate (11,67 UI/mg); enzyme cố định hạt silica gel xác định có hoạt độ ổn định so với enzyme gói gel alginate thay đổi điều kiện nhiệt độ, pH môi trường, xác định nhiệt độ pH tối ưu cho hai loại enzyme cố định tương ứng 370C pH= Kết thử nghiệm cho thấy, sau lần phản ứng (có khuấy đảo) enzyme cố định silica giữ 67,36 % hoạt độ ban đầu, enzyme cố định gel alginate có xu hướng chất mang bị vỡ - Enzyme lipase cố định phương pháp liên kết đồng hóa trị với chất mang phức hợp siêu vi hạt “nano sắt từ - chitosan”, có hiệu suất gắn enzyme đạt 75,1 %, hoạt độ mức 80 % so với enzyme tự Đã xác định thời gian phản ứng tối ưu 3h; nhiệt độ hoạt động tối ưu enzyme 50ᴼC, pH tối ưu 6, hoạt độ đạt 379,24 UI/g Enzyme cố định có khả tái sử dụng chịu nhiệt tốt so với enzyme tự Đồng thời, nhóm nghiên cứu sử dụng enzyme lipase cố định siêu vi hạt “nano sắt từ - chitosan” để xúc tác phản ứng chuyển vị ester triacylglycerol (mỡ trung tính) methanol để so sánh với phương pháp hóa học (truyền thống) nhằm tiến tới ứng dụng sản xuất biodiesel từ dầu thực vật mỡ động vật (lipit thu hồi từ nước thải surimi) Tên sản phẩm: - Sản phẩm ứng dụng: Quy trình công nghệ chế tạo enzyme lipase cố định - Sản phẩm khoa học: Bài báo quốc tế: Study of immobilization of lipase on magnetic nanoparticles Fe3O4 in the biodiesel production Tác giả: Bui Xuan Dong*, Cao Xuan Huu, Nguyen Thi Hoang Yen Tạp chí: «Актуальная биотехнология» (Russian SCI; DOAJ - Directory of open access journals) Số: N03/2015 tr: 49-51 Năm 2015 Link: http://elibrary.ru/title_about.asp?id=35599 Bài báo nước: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm biodiesel từ lipit thu hồi từ công nghiệp chế biến surimi Tác giả: Phạm Thị Mỹ; Bùi Xuân Đông Kỷ yếu HNKH quốc gia "Báo cáo khoa học nghiên cứu giảng dạy sinh học Việt Nam" Kỷ yếu HNKH Quốc gia lần thứ II Đà Nẵng 2015-2016 Trang: 1132-1140 Năm 2015 Hiệu quả, phƣơng thức chuyển giao kết nghiên cứu khả áp dụng: - Hiệu công tác giảng dậy: Kết nghiên cứu đề tài liệu khoa học đóng góp vào việc giảng dậy học phần: công nghệ enzyme bậc đại học, khia thác sử dụng enzyme bậc cao học ngành công nghệ sinh học Đã hướng dẫn thành công hai sinh viên làm đồ án tốt nghiệp nghiên cứu ngành công nghệ sinh học năm học 2015-2016 là: Nguyễn Thị Mộng Linh (11SH) Nguyễn Thị Hằng (11SH) sở khai thác sử dụng kết nghiên cứu đề tài - Kế hoạch chuyển giao kết nghiên cứu: Quy trình cơng nghệ chế tạo enzyme lipase cố định sau nhiệm thu được đăng tải chợ trực tuyến: Chợ công nghệ thiết bị Việt nam http://www.techmartvietnam.vn nhằm quảng bá thu hút nhà đầu tư ĐẶT VẤN ĐỀ Biodiesel (diesel sinh học) thuật ngữ dùng để loại nhiên liệu dùng cho động diesel sản xuất từ dầu thực vật mỡ động vật Thành phần biodiesel alkyl ester, thông dụng methyl ester Trong năm gần đây, có nhiều nước giới nghiên cứu, sử dụng phát triển sản xuất biodiesel để góp phần giải an ninh lượng, thay phần nguồn nhiên liệu hóa thạch khuyến cáo nên hạn chế khai thác, từ góp phần đa dạng hóa phát triển công nghệ tạo nguồn nhiên liệu Trong trình sản xuất biodiesel từ dầu thực vật mỡ động vật phản transester hóa đóng vai trị quan trọng Để thực phản ứng người ta thường dùng xúc tác kiềm acid với chất nhận nhóm -acyl ethanol methanol dư Phương pháp sản xuất đòi hỏi nguyên liệu lipit phải có độ cao – hàm lượng acid béo tự nguyên liệu vượt mức 0,5% tạo xà phòng, dẫn tới làm giảm hiệu suất tạo biodiesel cần có cơng thêm cơng đoạn làm Cơng nghệ địi hỏi hàm lượng nước nguyên liệu lipit khắt khe – không vượt q 0,05% Ngồi ra, cịn tạo sản phẩm phụ glycerol kiềm dư cần phải tinh trước thi tái tận dụng Trước thực trạng đó, việc thực phản ứng transester hóa enzyme lipase có lợi thế: thứ nhất, yêu cầu độ tinh lipit nguyên liệu không cao; thứ hai, hạn chế tạo thành sản phẩm phụ không mong muốn trình phản ứng Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme lipase tự không đem lại hiệu kinh tế giá thành enzyme đắt đỏ, để sản xuất biodiesel nhà khoa học thường sử dụng enzyme lipase cố định với khả tái sử dụng nhiều lần, làm cho giá thành sản xuất giảm đáng kể Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu cố định enzyme lipase lên vật liệu mang (ở Mỹ, Nga, Latvia, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…) đặc điểm cần quan tâm enzyme lipase cố định vật mang khả enzyme bị hoạt tính, thay đổi độ bền enzyme, pH tối ưu enzyme bị thay đổi, chí tính đặc hiệu chất (enzyme sau gắn lực với chất để xúc tác) Ngoài yếu tố trên, trạng thái vật lí chất – dạng rắn, micelle, dạng nhũ tương, hạt ưa nước ảnh hưởng đến tính đặc hiệu enzyme Chất mang để cố định enzyme thường dùng chất tự nhiên, tổng hợp hay vật liệu vô (hạt silica gel hấp phụ), kim loại Al, Mg, Fe oxit chúng, thép không rỉ, hạt vật liệu hữu xốp không xốp dạng bột có cấu trúc hình cầu với kích thước nano (để giảm áp suất thẩm thấu sử dụng mơi trường có tốc độ dịng chảy dung dịch khí cao) Nguyên liệu dùng để sản xuất biodiesel đa dạng, mỡ động vật, loại dầu thực vật, loại mỡ dầu thải từ nhà hàng, nhà máy chế biến thực phẩm, chí tận dụng dầu mỡ thải từ hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt thành phố…Hiện nay, địa bàn thành phố Đà Nẵng có nhiều nhà máy chế biến sản phẩm surimi từ nguyên liệu cá nhỏ, giá trị thương phẩm không cao thành sản phẩm chả cá giàu protein để phục vụ nhu cầu tiêu dùng nước xuất Trong trình sản xuất chả cá surimi yêu cầu chất lượng sản phẩm nên lipit (dầu cá) phải tách hoàn toàn từ thịt cá sau rửa ép tách nước Vì lượng lipit lớn sau bị loại bỏ từ công đoạn rửa thịt cá vào hệ thống nước thải nhanh chóng bị thủy phân bị hóa, việc tận dụng làm thực phẩm hay thức ăn chăn nuôi gặp nhiều cản trở Một phương hướng khả quan tận dụng lipit nước thải surimi để sản xuất biodiesel, kết hợp ứng dụng enzyme lipase cố định tái sử dụng nhiều lần công nghệ mang lại nhiều lợi mặt kinh tế việc sản xuất nguồn lượng thay Vì thế, mục tiêu đề tài nghiên cứu “nghiên cứu phương pháp sản xuất enzyme lipase cố định có hoạt tính xúc tác mạnh tính đặc hiệu chất định” từ hướng tới sử dụng enzyme lipase cố định để thăm dò sản xuất biodiesel từ lipit thu hồi nước thải công nghiệp sản xuất surimi Chƣơng 1I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lƣợc sử nghiên cứu sử dụng enzyme lipase trongsản xuất biodiesel Nghiên cứu cố định enzyme lipase nguồn gốc động vật, thực vật vi sinh vật lên chất mang nhiều nhà khoa học quan tâm ngiên cứu thời gian gần nhằm ứng dụng nhiều lĩnh vực thực phẩm, hóa dược, cơng nghệ sinh học Nhóm nghiên cứu điểm lại nghiên cứu bật cố định enzyme lipase sản xuất biodiesel khoảng thời gian 15 năm trở lại Từ dẫn chứng khoa học nhà khoa học ngồi nước tới nhận xét rằng, việc sử dụng lipit thu hồi từ nước thải nhà máy chế biến chả cá surimi chưa nghiên cứu Dựa tảng thành tựu nghiên cứu kĩ thuật chế tạo enzyme cố định hồn thành mục tiêu đề tài chế tạo enzyme lipase cố định có hoạt tính xúc tác mạnh tính đặc hiệu chất lipit nước thải surimi 1.2 Một số kĩ thuật chế tạo enzyme cố định Để chế tạo enzyme cố định nhà khoa học sử dụng phương pháp như: hấp phụ, dựa vào tròng mạng lưới gel (bẫy enzyme lỗ nhỏ gel trùng hợp), bọc nang nhỏ (capsule), liên kết hóa trị với giá thể không tan, tạo liên kết chéo phân tử enzyme Điều quan trọng phải lựa chọn điều kiện thích hợp cho gắn nhiều enzyme (tính đơn vị diện tích, đơn vị khối lượng), enzyme bị thơi khỏi chất mang, ảnh hưỏng đến hoạt độ E Nhóm nghiên cứu tới nhận xét: xu sử dụng enzyme lipase cố định sản xuất biodesel có tính thời thu hút quan tâm nhà khoa học, có nhiều thuận lợi mặt cơng nghệ nguồn enzyme lipase dồi 1.4 VẤN ĐỀ SẢN XUẤT SẢN PHẨM SURIMI VÀ NGUY CƠ Ô NHIỄM MÔI TRƢỜNG Theo số nghiên cứu nhà khoa học nước quốc tế, nguyên tắc tất lồi cá dùng để sản xuất surimi Tuy nhiên, nên chọn loài cá tạp, có chất lượng kém, giá trị cảm quan thấp hiệu sản xuất cao Ở Việt Nam số loài cá thường dùng cá Nhám, cá Mối, cá Chuồn, Nguyên liệu vận chuyển xí nghiệp xe đơng lạnh, xí nghiệp tiến hành nhập nguyên liệu Nếu đủ nguyên liệu đem sản xuất cịn khơng đủ nguyên liệu bảo quản lại Vấn đề môi trường gặp phải công nghệ surimi sử dụng lượng nước lớn, nước thải có chứa lượng protein hịa tan, thịt vụn, khống, đặc biệt lipit với lượng lớn Vì vậy, để sản xuất người ta tiến hành thu hồi lipit để sản xuất sản phẩm từ mỡ, đồng thời góp phần làm giảm nhiễm nước thải Trong nghiên cứu này, sử dụng lipit thu từ cơng nghệ sản xuất surimi để thăm dị sản xuất biodesel 10 Khoảng nhiệt độ chọn khảo sát từ 35-600C, bước nhảy nhiệt 50C, so sánh với giá trị nhiệt độ 370C Kết nghiên cứu cho thấy, enzyme tự enzyme cố định silica gel, gel alginate cho hoạt độ tối ưu 370C [47] Với enzyme tự do, hoạt độ giảm tăng nhiệt, tăng đến 550C hoạt độ giảm 10% so với hoạt độ tối ưu Ở 600C, enzyme bị biến tính hồn tồn hoạt tính, sau 30 phút phản ứng Trong đó, enzyme cố định có hoạt độ ổn định nhiệt độ thay đổi, đặc biệt enzyme gắn hạt silica gel Đối với enzyme cố định cách gói gel alginate 600C hoạt độ giảm nhanh, 41,22% Đồng thời nhiệt độ quan sát bề hạt gel bị nứt vỡ sau 30 phút phản ứng, chứng tỏ enzyme ngồi phần bị ảnh hưởng nhiệt độ làm cho biến tính, dẫn đến hoạt độ giảm 3.1.6 Khảo sát khả tái sử dụng enzyme cố định Khả tái sử dụng enzyme cố định ưu điểm vượt trội so với việc sử dụng enzyme tự Để đánh giá khả tái sử dụng enzyme cố định hạt silica gel enzyme cố định gel alginate, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme sau lần sử dụng Ở đây, giá trị hoạt độ xác định enzyme cố định lần sử dụng (mẻ phản ứng 1) tính 100%, giá trị hoạt độ mẻ phản ứng quy đổi giá trị phần trăm dựa giá trị Kết thể qua đồ thị hình 3.6 3.7 Kết nghiên cứu cho thấy, khả tái sử dụng enzyme lipase cố định silica gel gel natri-alginate tương đương với nhau, enzyme cố định gel natri-alginate có giảm hoạt độ nhanh chệnh lệch không đáng kể Khảo nghiệm sau lần tái sử dụng t=370C, pH=7-8 =24 cho thấy, họat độ enzyme gắn silica gel cịn trì 67,36% Enzyme gói gel natri-alginate đến lần tái sử dụng thứ lại 68,55% hoạt độ, lần tái sử dụng thứ hoạt độ enzyme tăng lên 79,95% Đồng thời lúc quan sát thấy bề mặt hạt gel có đường nứt, hạt gel có dấu hiệu vỡ (kết hình ảnh ghi lại thể hình 3.8) 30 Hình 3.6: Sự thay đổi hoạt độ enzyme gắn silica gel tái sử dụng Hình 3.7: Sự thay đổi hoạt độ enzyme gói gel alginate tái sử dụng Trong trường hợp này, lý giải hạt gel bị nứt vỡ nên enzyme ngồi,làm cho q trình phản ứng diễn tốt hoạt độ enzyme cố 31 định gel lúc tăng lên Hình 3.8: Enzyme cố định gel alginate sau lần tái sử dụng thứ 3.1.7 Khả bảo quản enzyme gói gel Vì enzyme có chất hóa học protein nên dễ bị biến tính trình bảo quản Vì việc khảo cứu khả bảo quản, điều kiện bảo quản thích hợp điều cần thiết Enzyme bảo quản dung dịch đệm phosphate, bổ sung CaCl2 Kết khảo sát khả enzyme bị nhả hấp phụ thời gian bảo quản thể đồ thị 3.9 Hình 3.9: Ảnh hƣởng thời gian bảo quản lên độ bền enzyme cố định 32 Từ đồ thị 3.9 cho thấy, nồng độ enzyme lipase gel alginate natri giảm trình bảo quản, nồng độ enzyme xác định gián tiếp dịch bảo quản enzyme Nguyên nhân tượng nhả hấp phụ, enzyme từ hạt gel ngồi dung dịch bảo quản, nồng độ protein dung dịch bảo quản tăng lên, từ xác định nồng độ enzyme hạt gel giảm dần Lượng enzyme gói hạt gel lúc h coi 100% qua 24 h giảm nhanh 75,94%, giai đoạn sau lượng protein giảm chậm so với 24 h đầu, đến 96 h cịn lại 54,91% lượng ban đầu Kết nghiên cứu enzyme lipase cố định silica gel, cho thấy sau 96 h nồng độ enzyme dung dịch bảo quản nhỏ Một số kết nghiên cứu tác giả khác, chứng minh hạt gel gắn enzyme sấy khô mang bảo quản nhiệt độ 40C giúp giữ hoạt tính nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu chưa thực thí nghiệm kiểm chứng 3.2 Kết nghiên cứu cố định enzyme lipase phƣơng pháp tạo liên kết đồng hóa trị với chất mang có tính hấp phụ 3.2.1 Đặc tính hạt nano sắt từ Mẫu hạt nano từ tính Fe3O4 chế tạo phương pháp đồng kết tủa chụp ảnh SEM để phân tích, kết hình 3.10 Hình 3.10: Ảnh chụp SEM nano sắt từ Quan sát ảnh SEM mẫu Fe3O4 vị trí khác nhận thấy rằng, kích thước hạt Fe3O4 có dạng hình cầu hạt tạo đồng đều, hạt tạo phân phân tán tốt, bị kết tụ, kích thước hạt từ 10-100 nm 33 Hạt nano dùng để chế tạo enzyme lipase cố định, để tận dụng tính chất từ tính hạt Từ đó, hướng tới phương pháp thu hồi enzyme cố định lực từ từ hỗn hợp phản ứng 3.2.2 Kết chế tạo enzyme lipase cố định Với mục tiêu đảm bảo hiệu suất gắn enzyme lipase lên chất mang cao nhóm nghiên cứu tiến hành phương pháp khuấy từ nhiệt độ 30oC, sau chế tạo enzyme bảo quản mơi trường đệm thích hợp, nhiệt độ 4ᴼC Bảo quản dạng lỏng tạo điều kiện thuận lợi sử dụng bước khảo sát Kết chụp SEM hạt chitosan trước sau gắn enzyme mô tả hình 3.11 Hình 3.11: Ảnh chụp SEM chitosan enzyme lipase cố định Phân tích hình ảnh cho thấy, hình dạng ban đầu chitosan (chưa hịa tan) lớp polimer với kích thước lớn (hình 3.11 – bên trái) Sau hòa tan, chitosan hấp phụ nano sắt từ lên bề mặt gắn enzyme thông qua cầu nối glutaraldehyde có dạng siêu vi cầu (hính 3.11 – bên phải) Ngun lí phương pháp gắn lý giải sau: bước đầu chitosan hấp phụ hạt nano sắt từ tạo siêu vi hạt “chitosan – nano sắt từ”, chitosan enzyme lipase có nhóm amin –NH2 tự do, nên chúng có khả tạo lên kết với –CHO glutaraldehyde Từ chế tạo enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” Thí nghiệm xác định thơng số q trình nhiệt độ 30ᴼC , thực máy khuấy từ với tốc độ 250v/phút 34 3.2.3 Xác định hiệu suất gắn enzyme lipase siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” Để xác định thơng số này, nhóm nghiên cứu tiến hành đo nồng độ enzyme lại dung dịch sau tách enzyme cố định phương pháp tách tuyển từ tính Nồng độ enzyme xác định phương pháp Bradford: - Nồng độ enzyme dung dịch đệm sau gắn 49,82 μg/ml - Nồng độ enzyme dung dịch đệm trước gắn 200 μg/ml Từ tính hiệu suất q trình gắn theo công thức 3.1: (3.1) 3.2.4 Ảnh hưởng pH môi trường lên hoạt độ enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” Độ pH môi trường yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme, enzyme khác có pH tối ưu khác nhau, enzyme tự enzyme cố định loại enzyme có pH tối ưu khác nhau, việc xác định pH tối ưu để điều khiển phản ứng việc quan trọng Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát mức pH điều chỉnh đệm phosphate mức 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7; 7,5; 8,0 nhiệt độ 37ᴼC, thời gian 1h Hình 3.12: Ảnh hƣởng pH mơi trƣờng lên hoạt độ enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan-Fe3O4” 35 Kết xác định phụ thuộc hoạt độ enzyme lipase cố định vào pH mơi trường trình bày hình 3.12 Phân tích đồ thị hình 3.12 cho thấy, enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” có hoạt độ mạnh 199,6 UI/g pH=6, nhóm nghiên cứu xác định pH tối ưu enzyme cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” Ở giá trị pH khác hoạt độ enzyme xác định thấp pH tối ưu cho enzyme tự vùng pH tối ưu pH=7,5-8,0, hoạt độ đạt 249,5 UI/g Như vậy, sau gắn enzyme lên siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” pH tối ưu enzyme chuyển dịch mạnh vùng pH acid Điều phù hợp với nghiên cứu trước tác giả Shad S Gupta M.N (2007) [45] 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian phản ứng lên hoạt độ enzyme lipase cố định cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” Hình 3.13: Ảnh hƣởng thời gian phản ứng lên hoạt động enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” Theo phương pháp chuẩn độ Ota-Yamada, enzyme tự thời gian phản ứng tối ưu 10 phút nhiệt độ 370C Nhưng với enzyme cố định thông số thường thay đổi Nên việc xác định thời gian phản ứng tối ưu cho enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” mục tiêu quan trọng Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng lên hoạt độ enzyme cố định với thông số pH = 6,0 nhiệt độ phản ứng enzyme 37ᴼC, 36 hoạt độ enzyme đo mức thời gian: 1h; 2h; 3h; 4h; 5h; 6h; 7h Kết khảo sát trình bày đồ thị 3.13 Từ đồ thị 3.13 xác định thời gian phản ứng tối ưu Từ mốc đến hoạt độ enzyme tăng dần Nhưng sau phản ứng hoạt độ enzyme giảm dần, nồng độ sản phẩm phản ứng tăng, dẫn tới ức chế hoạt động enzyme (cơ chất khó tiếp xúc với trung tâm hoạt động enzyme) 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ môi trường lên hoạt độ enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” Trong phản ứng enzyme, nhiệt độ thông số quan trọng quan trọng định tốc độ phản ứng, nhiệt độ làm biến tính protein, biến dạng cấu trúc tự nhiên enzyme Cho nên xác định nhiệt độ tối ưu cho phản ứng enzyme cần thiết Nhóm nghiên cứu tiến hành cố định thông số thời gian t=3h, pH=6 tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme mức nhiệt độ: 30ᴼC; 37ᴼC; 400C; 45ᴼC; 50ᴼC; 55ᴼC; 60ᴼC Nguyên nhân chọn khảo sát mức nhiệt độ khoảng nhiệt độ hoạt động enzyme lipse tự từ 30-60ᴼC Kết thu trình bày hình 3.14 Hình 3.14: Ảnh hƣờng nhiệt độ lên hoạt độ enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” Phân tích liệu đồ thị 3.14 nhận thấy, hoạt độ enzyme cao đạt 37 50ᴼC, giảm dần sau Nhận thấy khác biệt nhiệt độ hoạt động enzyme cố định cao so với enzyme tự (tối ưu 37ᴼC) Khảo sát chứng minh, enzyme cố định có độ bền nhiệt vượt trội so với enzyme tự do, cụ thể mức nhiệt độ 60ᴼC hoạt độ enzyme tự giảm 90% (từ 249,5 xuống 19,96 UI/g) điều kiện phản ứng Có thể giải thích nguyên nhân tác dụng nhiệt độ cao cấu trúc không gian (bậc 4) enzyme bị phá vỡ dẫn tới tượng biến tính Trong đó, enzyme cố định che chắn chất mang “hiệu ứng bảo vệ” chất mang nên giữ cẫu trúc mức nhiệt độ cao so với enzyme tự 3.2.7 Khảo sát mức độ tái sử dụng enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” Hình 3.15: Sự thay đổi hoạt độ enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan-Fe3O4” sau lần tái sử dụng Mục tiêu đặt nghiên cứu chế tạo enzyme cố định có khả tái sử dụng nhiều lần, thí nghiệm khảo sát khả tái sử dụng enzyme quan trọng, điều định khả ứng dụng enzyme vào thực tiễn sản biodiesel 38 Nhóm nghiên cứu tiến hành xác định khả tái sử dụng enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan – Fe3O4” sau lần phản ứng pH=6, thời gian phản ứng 3h, mức nhiệt độ 50ᴼC, kết hợp khuấy đảo Phân tích liệu đồ thị 3.15 nhận thấy, enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan-Fe3O4” sau lần tái sử dụng giữ hoạt độ cao 90% (315 UI/g) điều kiện khuấy đảo Điều chứng minh, enzyme lipase cố định, liên kết enzyme chất mang vững Ngồi ra, nhóm nghiên cứu khảo sát hoạt độ enzyme sau thời gian bảo quản tháng đệm phosphate điều kiện 4ᴼC enzyme cố định đảm bảo hoạt độ mức 80% so với hoạt độ ban đầu, mức 312 UI/g 3.3 Kết thử nghiệm điều chế biodesel từ lipit thu hồi từ nƣớc thải surimi 3.3.1 Kết xác định trị số hóa lý nguyên liệu lipid surimi Kết xác định trị số hóa lý nguồn nguyên liệu lipid thu hồi từ nhà máy sản xuất surimi tổng hợp bảng 3.4 Bảng 3.4: Kết xác định trị số lipid surimi TT Chỉ tiêu Trị số acid (Ax) Trị số xà phòng (Xp) Trị số ester (Es) Trị số iot (Iv) pH Đơn vị mg KOH/g mg KOH/g mg KOH/g g/100g - Kết 12,5 21,04 8,51 30,32 6,3 Theo kết nghiên cứu (bảng 3.4) cho thấy trị số acid lipid cá 12,53 mgKOH/g Sự thay đổi trị số acid phụ thuộc vào nhiều yếu tố thời gian cách bảo quản lipid dễ bị oxi hóa trình thủy phân xảy diện phân tử nước [47] Khi sản xuất biodiesel phương pháp hóa học, trị số acid cao phản ứng transester hóa hiệu suất khơng cao acid béo tự phản ứng với kiềm hình thành xà phịng, gây nên khó khăn việc phân tách pha [48] Để sản xuất biodiesel từ lipit chứa acid béo tự cao phương pháp hóa học trước thực phản ứng 39 transester hóa cần thực bước trung hịa lipit đến pH trung tính NaOH Nhưng phương pháp enzyme bỏ qua bước trung hòa 3.3.2 Kết nghiên cứu đánh giá chất lượng biodiesel điều chế từ lipit surimi Kết so sánh tiêu biodiesel từ lipid surimi với tiêu biodiesel Châu Âu Mỹ (EN 14214 ASTM – D6751) Việt Nam (TCVN 7717:2007) tổng hợp bảng 3.5 Bảng 3.5: So sánh tính chất biodiesel từ lipit surimi với tiêu biodiesel gốc (B100) tiêu chuẩn quốc tế TCVN Chỉ tiêu Biodiesel EN14214 Biodie- TCVN sel 7717 : ASTM 2007 – Biodiesel D6751 gốc (B 100) Biodiesel điều chế xúc tác hóa học Biodiesel điều chế enzyme cố định Màu vàng, 97 885 Màu vàng nâu, 120 - Trạng thái vật lý Hàm lượng este, % Khối lượng riêng 15ºC, kg/m3 Điểm chớp cháy (cốc kín), ºC Độ nhớt động học 40ºC, mm2/s Lưu huỳnh, mg/kg Trị số xetan, Trị số iot, g/100g Trị số acid (mg KOH/g) - - - 96,5 860900 - 96,5 860 – 900 120 130 130 - 1,9 – 6,0 4,3 4,4 15 45 - 47 120 - 51 124,4 0,6 110 0,4 3,5 – 5,0 10 51 - - 94 880 Phân tích kết bảng 3.5 nhận thấy, biodiesel sản xuất từ lipid cá phương pháp hóa học đáp ứng yêu cầu kỹ thuật theo tiêu chuẩn quốc tế tiêu chuẩn Việt Nam Còn biodiesel sản xuất phương pháp enzyme đáp ứng yêu cầu kĩ thuật chưa xác định điểm chớp cháy trị số xetan, thời gian thực đề tài hạn chế Một số hạn chế nhận thấy mẫu biodesel từ lipit cá số acid cao 0,4 mgKOH/g phương pháp điều chế enzyme, mức 0,6 mgKOH/g 40 phương pháp hóa học Điều chứng minh, biodiesel acid béo tự do, q trình chuyển vị ester chưa xảy hồn toàn Mẫu biodiesel điều chế phương pháp sử dụng enzyme lipase cố định phương pháp hóa học (mẫu đối chứng) thể hình 3.16 Hình 3.16: Mẫu biodiesel điều chế xúc tác: hóa học (a) lipase (b) Các mẫu biodiesel có màu vàng nâu, độ suốt không bị vẩn đục bảo quản 3.4 Đề xuất quy trình cơng nghệ chế tạo enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan-Fe3O4” Từ kết thu chúng tơi đề xuất quy trình công nghệ chế tạo enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan- Fe3O4” hình 3.17 Enzyme chế tạo theo quy trình có số đặc điểm sau: - Chất mang phức “chitosan- Fe3O4” có đặc tính thuận từ, sử dụng nam châm vĩnh cửu để hút thu hồi - Cầu nối enzyme chất mang glutaraldehyde - Enzyme cố định hiệu enzyme lipase tách chiết từ tụy lợn, hãng Novozyme - Một số thông số lưu ý sử dụng enzyme cố định với chất dầu oliu sau: thời gian phản ứng tối ưu 3h; nhiệt độ hoạt động tối ưu enzyme 50ᴼC, pH tối ưu 6, hoạt độ đạt 379,24 UI/g 41 Hình 3.17: Quy trình cơng nghệ chế tạo enzyme lipase cố định 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu được, nhóm nghiên cứu rút kết luận sau đây: Lựa chọn ba loại vật liệu hấp phụ có khả dùng để chế tạo enzyme lipase là: silica gel, gel alginate natri chitosan Bước đầu thăm dò biến đổi hoạt tính enzyme lipase cố định so với enzyme lipase tự Đã chế tạo loại enzyme lipase cố định vật liệu hấp phụ silica gel, gel alginate natri siêu vi hạt “Chitosan-Fe3O4”: - Enzyme lipase cố định silica có số đặc điểm sau: lượng protein (enzyme) cố định chất mang silica gel 1,97 mg/g chất mang; hoạt độ riêng 17 UI/mg đệm phosphate; pH tối ưu = 7; nhiệt độ tối ưu 370C; sau lần phản ứng (có khuấy đảo) enzyme cố định silica giữ 67,36 % hoạt độ ban đầu - Lipase gói gel alginate natri có số đặc điểm sau: lượng protein (enzyme) cố định gel alginate 3,01 mg/g chất mang; hoạt độ riêng 11,67 UI/mg đệm phosphate; pH tối ưu = 7; nhiệt độ tối ưu 370C; sau lần phản ứng (có khuấy đảo) enzyme cố định có xu hướng chất mang bị vỡ - Enzyme lipase cố định phương pháp liên kết đồng hóa trị với chất mang phức hợp siêu vi hạt “Chitosan-Fe3O4” có hiệu suất gắn enzyme đạt 75,1 %, hoạt độ mức 80% so với enzyme tự (11,47UI/mg) Đã xác định thời gian phản ứng tối ưu 3h; nhiệt độ hoạt động tối ưu enzyme 50ᴼC, pH tối ưu 6, hoạt độ đạt 379,24 UI/g Enzyme cố định có khả tái sử dụng chịu nhiệt tốt so với enzyme tự Đã sử dụng enzyme lipase cố định siêu vi hạt “nano sắt từ - chitosan” để xúc tác phản ứng chuyển vị ester triacylglycerol (mỡ thu hồi từ nước thải surimi) methanol để so sánh với phương pháp hóa học Kết phân tích mẫu biodiesel cho thấy, biodiesel đáp ứng yêu cầu kỹ thuật theo tiêu chuẩn quốc tế tiêu chuẩn Việt Nam Đã đề xuất quy trình cơng nghệ chế tạo enzyme lipase cố định siêu vi hạt “chitosan-Fe3O4” 43 KIẾN NGHỊ - Kết nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất biodiesel khắc phục số hạn chế như: địi hỏi khắt khe độ tinh nguyên liệu lipit, giảm nhiệt lượng hóa chất - Trong nghiên cứu nhóm nghiên cứu tập chung vào hướng thiết kế thiết bị phản ứng tối ưu phản ứng chuyển vị ester sử dụng xúc tác lipase cố định silica gel gel alginate natri 44