PHẦN II PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG  1903 nhà bác học Nga Txvet dùng cột nhôm tách thành công picmen xanh thành vùng mầu riêng biệt đặt tên cho phương pháp phương pháp sắc ký ( nghóa ghi mầu) 1931 sau Vinterstin Lederer dùng phương pháp tách caroten thành α ß caroten nhận thấy gía trò phương pháp bắt đầu phương pháp sác ký phát triển nhanh chóng đa dạng PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CÁC ƯU ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ  Phân tích đồng thời lúc  Độ phân giải cao  Độ nhạy cao (ppm-ppb)  Thể tích tiêm mẫu nhỏ (1-100uL) CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ   Các phương pháp sắc ký dựa hấp thụ chọn lọc hợp phần riêng biệt hỗn hợp phân tích chất khác Các phương pháp sử dụng rộng rãi để tách chất hữu cần nghiên cứu khỏi hỗn hợp mẫu Hoặc đònh nghóa Sắc ký: Kỹ thuật tách cấu tử khỏi hỗn hợp dựa lực khác cấu tử : Pha tónh pha động     Đặc điểm chung phương pháp sắc ký : Qúa trình tách dựa chuyển dòch hỗn hợp phân tích qua lớp chất bất động (pha tónh ) chất rắn chất lỏng mang chất rắn giấy chuyển dòch thực chất khí chất lỏng (pha động) Pha động : (mobile phase) làm nhiệm vụ chuyển dòch đưa mẫu phân tích đến bề mặt pha tónh, pha động có nhiệm vụ tiếp nhận phần tử chất phân tích hấp thụ trước bò giải hấp tới tương tác với phần khác bề mặt pha tónh Pha tónh : (stationnary phase) chất rắn chất lỏng mang bề mặt chất rắn có tác dụng giữ mẫu ĐỊNH NGHĨA VÀ PHÂN LỌAI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ   Sắc ký qúa trình tách liên tục vi phân hỗn hợp chất phân bố không đồng chúng pha tónh pha động cho pha động xuyên qua pha tónh Sắc ký qúa trình trao đổi chất phương pháp hóa lý khác : chưng cất, chiết, kết tinh …nhưng khác với phương pháp khác phân chia sắc ký thực qúa trình hấp thụ , giải hấp thụ lặp lặp lại suốt qúa trình tách PHÂN LỌAI SẮC KÝ  1/ Phân lọai theo theo trạng thái liên hợp pha động pha tónh  Theo cách phân lọai tất phương pháp sắc ký phân thành hai nhóm lớn theo pha động :  a/ Sắc ký khí – pha động khí  b/ Sắc ký lỏng – pha độnglà chất lỏng, dung mơi hữu  2/ Phân lọai theo chế qúa trình tách  Phân lọai dựa chất hấp thụ , giải hấp thụ nghóa theo tương tác chất sắc ký với pha tónh pha động Có 04 chế sắc ký sau:  A/ sắc ký hấp phụ :  B/ Sắc ký phân bố  C/ Sắc ký trao đổi ion  D/ Sắc ký rây phân tử A/ sắc ký hấp phụ  Sự tách lực khác chất chất hấp phụ rắn – pha tónh  Đối với chất hấp phụ phân chủ yếu tương tác cực Do nhóm phân cực phân tử kết qủa tách mạnh mạch hydrocabon không phân cực Theo U.S Food and Drug Administration 8/2000 Sản phẩm Thức ăn cho cá, gia cầm, heo, bò, chế biến từ bắp đậu phộng, hạt bông,… Thức ăn cho cá, heo nặng từ 100 pounds trở lên Thức ăn cho bò giống, heo giống, gia cầm giống Thức ăn cho gia súc, gia cầm nhỏ, gia súc nuôi lấy sữa Sữ a Mức cho phép (µg/kg) 300 200 100 20 0.05 Phản ứng dẫn xuất TFA Aflatoxin O O O O O O TFA O O Aflatoxin B1 OCH3 H 2O HO O O OCH3 Thiết bị - Dụng cụ: 1- Thiết bị: - Hệ thống HPLC với đầu dò Fluorescence Máy đo UV-Kon Cân miligram Cân gram Bồn siêu âm Máy ly tâm Hệ thống Solid Phase Extraction 2- Dụng cụ dành cho phân tích vết: - Bình định mức Pipet Erlen, becher Ống nghiệm Phễu lọc Giấy lọc Parafilm 3- Hố chất: - Chuẩn Aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1 - Methanol Acetonitril Isopropanol Trifluoroacetic acid n-Hexan Chloroform Dichloromethan Cột SPE C18 - Nước cất hai lần Khí Nitơ Xử lý chuẩn Aflatoxin B1, B2 ,G1, G2 Cân (mg) Đònh mức CHCl3 Pha loãng Benzen/ACN Đo UV Pha loãng MeOH Dẫn xuất Xử lý chuẩn Aflatoxin M1 Cân (mg) Đònh mức ACN Pha loãng ACN Dẫn xuất SƠ ĐỒ TRÍCH MẪU 25g mẫu Thêm 50 ml MeOH/H2O (80/20) Lọc Pha lỗng dịch lọc Qua cột SPE C18 Rửa cột - ml H2O - ml Hexan Rút khơ cột Rửa giải cột ml CH2Cl2 Dẫn xuất Hoạt hóa cột - ml MeOH - ml MeOH 80% - ml H2O Sơ đồ trích mẫu sữa Mẫu Thêm nước nóng 800C Qua cột SPE C18 Rửa cột -5ml H2O -1ml n-Hexan Rửa giải 2ml CH2Cl2 Dẫn xuất Hoạt hóa cột - ml MeOH - ml H2O Dựng đường chuẩn Dựng đường chuẩn với chuẩn sau: chuấn (ppb) chuấn (ppb) chuấn (ppb) chuấn (ppb) Aflatoxin B1 0,22 2,16 5,41 10,82 Aflatoxin B2 0,19 1,91 4,78 9,56 Aflatoxin G1 0,20 2,01 5,03 10,06 Aflatoxin G2 0,25 2,50 6,24 12,48 Aflatoxin M1 0,0025 0,0125 0,025 0,050 Điều kiện chạy máy Aflatoxin B1, B2, G1, G2: - Mp: ACN / MeOH / H2O (22/52/63) - Cột C18 5µm (250 x 4,6)mm - Cài bước sóng: Ex= 360nm, Em= 440nm - Tốc độ dòng: 0,7ml/ phút - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng Aflatoxin M1: - Mp: ACN / Iso propanol / H2O (80/120/800) - Cột C18 5µm (250 x 4,6)mm - Cài bước sóng: Ex= 360nm, Em= 440nm - Tốc độ dòng: 0,7ml/ phút - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng Recovery mẫu bột cá Hàm lượng lý thuyết (ppb) Hàm l ợng thực tế (ppb) Recovery (%)   Aflatoxin B1 2.16 5.41 10.82 1.595 4.142 8.453 73.86 76.57 78.12 Aflatoxin B2 1.91 4.78 9.56 1.101 2.667 5.307 57.65 55.78 55.51 Aflatoxin G1 2.01 5.03 10.06 1.413 3.704 7.400 70.29 73.63 73.55 Aflatoxin G2 2.50 6.24 12.48 1.146 2.738 5.438 43.84 43.88 43.57 Khỏang dao động Recovery Recovery (%) RSD Aflatoxin B1 75,72 +/- 2,78 3,50 Aflatoxin B2 63,37 +/- 9,63 14,40 Aflatoxin G1 75,07 +/- 3,45 4,37 Aflatoxin G2 57,43 +/- 16,11 26,73 Aflatoxin M1 78,95 +/- 0,69 1,35 Sắc ký đồ chuẩn LOD Sắc ký đồ mẫu bột cá [...]... TRÊN 2 QUÁ TRÌNH * HẤP PHỤ * GIẢI HẤP PHỤ  XẢY RA LIÊN TỤC GIỮA 2 PHA: * PHA TĨNH : THƯỜNG LÀ RẮN HOẶC LỎNG * PHA ĐỘNG : LÀ KHÍ KHI NỐI VỚI CÁC ĐẦU DÒ (DETECTOR) PHƯƠNG PHÁP CHO PHÉP  ĐỊNH TÍNH : DỰA VÀO THỜI GIAN LƯU  ĐỊNH LƯNG : DỰA VÀO CHIỀU CAO HOẶC DIỆN TÍCH PEAK CHROMATOGRAPHY MOBILE PHASE STATIONARY PHASE INJECTOR DETECTOR Start tM tR1 tR2 tR3 tR4 BỘ PHẬN CHÍNH – GC 1 INJECTO – Tiêm mẫu 2 CỘT... : DÙNG ĐỂ THU THẬP VÀ TÍNH TOÁN CÁC KẾT QUẢ Injector AIR AUTOSAMPLER SEPTUM PURGE INJECTOR Column COMPUTER DETECTOR OVEN H2 SPLIT Carrier gas COLUMN N2(He) MAKE UP LỌC ẨM moisture filter PRINTER LOC HYDROCARBON hydrocarbon filter LỌC OXYGEN oxygen filter Detector Start tM tR1 tR2 tR3 tR4 MÁY SẮC KÝ NHÌN TỪ PHÍA TRƯỚC CỘT NHỒI LÀM BẰNG THỦY TINH LÒ CỘT CỘT MAO QUẢN CỔNG TIÊM MẪU CHO CỘT NHỒI VÀ MAO... xử lý số liệu SƠ ĐỒ KHỐI CỦA MỘT MÁY SẮC KÝ KHÍ (tt) CÁC BỘ PHẬN CƠ BẢN BAO GỒM : 1/ Bình khí : NGUỒN CUNG CẤP KHÍ MANG : THƯỜNG LÀ BÌNH KHÍ HOẶC MÁY SINH KHÍ (1) 2/ Đồng hồ , van khí : HỆ THỐNG ĐIỀU KHIỂN ÁP SUẤT HOẶC TỐC ĐỘ DÒNG KHÍ MANG (2+ 3): ĐIỀU KHIỂN CƠ HOẶC ĐIỆN TỬ 3/ Van khí 4/ Bộ phận tiêm mẫu : BUỒNG BƠM MẪU (4): CÓ NHIỀU LOẠI KHÁC NHAU VỚI MỤC ĐÍCH PHÂN TÍCH KHÁC NHAU : PACKED, WBI, SPL/SPLESS/OCI-PTV,... hiện nay Phương pháp này cho phép đònh tính, đònh lượng chính xác các chất hữu cơ trong thực phẩm, môi trường, dư lượng thuốc trừ sâu… Phạm vi sử dụng : - Phân tích các chất hữu cơ có phân tử lượng nhỏ 20 0 (nhưng cũng tuỳ theo đối tượng và sử dụng dẫn xuất ) - Các hợp chất hữu cơ có nhiệt độ bay hơi nhò hơn 3000C - Khơng phân tích các chất hữu cơ có tính axít sẽ làm hư cột  Ngày nay người ta còn nối... nhất của thiết bò sắc ký khí là: hệ thống cột tách (column) và đầu dò ( detector) Vận hành : Mẫu được trích bằng tay hoặc bằng bộ phận trích mẫu tự động vào bộ phận bơm mẫu có nhiệt độ buồng bơm khỏang 25 00C mẫu được hóa hơi và nhờ có khí mang Nitơ hoặc Heli mẫu sau khi hóa hơi được đẩy vào cột mao quản nằm trong buồng điều nhiệt Tại đây các cấu tử được tách ra theo nhiệt độ bay hơi riêng của từng cấu... lưu của một cấu tử khí trơ đối với pha tónh  Thể tích lưu sẽ là:  VR = Fc tR trong đó  Fc : lưu lượng dòng hiệu chỉnh            Khi mẫu đi vào cột sắc ký , chúng nhanh chóng phân bố giữa 2 pha , pha tónh và pha động Điều đó được mô tả bằng hệ số phân bố K K = CL = (nL/ VL ) = nồng độ của chất tan trong pha tónh nồng độ của chất tan trong pha động = trọng lượng chất tan trong pha tónh