1 M U bnh ng rut cho ngi v gia sỳc Nhõn dõn dựng lỏ ti nhai sng, vũ hoc gió nỏt vt ly nc ung cha bnh au bng i ngoi, cha cỏc vt Theo thng kờ s lng cỏc dc phm mi c phộp lu hnh thng nhim trựng, cha viờm loột hnh tỏ trng, au d dy, tr st rột 20 nm va qua ó cho thy, cỏc hp cht thiờn nhiờn ó v c coi l Nhng kt qu nghiờn cu v thnh phn hoỏ hc v th hot tớnh sinh ngun cu trỳc mi to cỏc dc phm mi c bit rừ rng nht l hc ca lỏ cõy Kh sõm ó khng nh tớnh khỏng khun mnh c quyt lnh vc thuc chng ung th cú ti 60%, bnh truyn nhim l nh bi cỏc ent -kauran ditecpen, ng thi ó phỏt hin tớnh gõy c hi rt 70% cú ngun gc t nhiờn mnh i vi mt s dũng t bo ung th ngi v ch phm t cõy Kh sõm í ngha to ln ca nhng hp cht thiờn nhiờn cú hot tớnh sinh hc l ch chỳng khụng ch c s dng trc tip lm thuc cha bnh, m quan cũn cú hot tớnh chng suy gim dch g b nhim virus (gõy suy gim dch) Gumboro cng c trng hn l chỳng cú th l nhng cht mu, cht dn ng phỏt trin Chỳng tụi cho rng cỏc ent -kauran t cõy Kh sõm rt cú trin vng l cỏc thuc mi hoc l cỏc cht dũ sinh hoỏ lm sỏng t cỏc nguyờn lý ca cht dn ng nhiu hn to cỏc thuc chng viờm, chng ung th dc lý hc ngi v chng suy gim dch cú hiu lc Cỏc nh khoa hc Vin nghiờn cu ung th Quc gia Hoa K coi kho gúp phn tỡm hiu v ỏnh giỏ cht lng ngun nguyờn liu phong tng cõy thuc ca Trung Quc l ngun khai thỏc cỏc cht mu, cht dn phỳ ang c s dng rng rói dõn gian, ti: Theo dừi hm lng ng mi nhm khỏm phỏ v phỏt trin cỏc thuc chng ung th v chng hot cht diterpenoit cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis HIV tng lai Nhng nm gn õy cú nhiu cõy thuc c truyn ca y Gagnep.,) h Euphorbiaceae l ni dung chớnh ca lun ny hc Trung Quc l i tng nghiờn cu thc nghim v lõm sng iu tr ung th, qua ú ó v ang phỏt hin hng lot cht mi, nhiu cht rt cú trin vng tr thnh nhng cht dn ng Nhiu ent -kauran ditecpenoit th hin hot tớnh khỏng khun, gõy c hi t bo, chng u v anti -HIV ó cú nhn xột rng, hot cht mt s cõy thuc cú tớnh khỏng khun, chng viờm, chng ung th, h huyt ỏp, li tiu v thng cú mt cỏc ent -kauran ditecpenoit Cõy Kh sõm cho lỏ thuc loi cõy thuc dõn gian Vit Nam Cõy mc hoang di nhiu ni trờn Bc Vit Nam, nhng cng c trng nhiu cỏc trm xỏ ụng y, y t xó v nh dõn, nht l vựng ng bng sụng Hng, vỡ c coi nh ngun thuc ti ch cha cỏc bnh viờm nhim, S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn CHNG TNG QUAN ng [27] Mt s nc vựng ụng Phi (Camrun, Nigeria, Siraleon v.v ) 1.1 Nhng loi cõy thuc chi Croton L., v cụng dng y hc Cỏc thc vt chi Croton L., thuc h Thu du (Euphorbiaceae) cú dựng r v v thõn cõy C zambicus lm thuc nhun trng, tr kit l v chng co git [39] khong 700 loi [26], gp ph bin cỏc vựng nhit i, ớt gp vựng ụn i Thỏi Lan ngi ta dựng v, r cõy cng nh qu ca cõy C v rt him vựng hn i chõu cú khong 50 loi, riờng ụng dng oblongifolius cha bnh ri lon tiờu hoỏ, kit l, loột d dy, tr ung th cú hn 40 loi [35] [44] hoc dựng cõy C sublyratus [33] tr loột hnh tỏ trng Vit Nam, theo Phm Hong H chi Croton L cú 18 loi [1], cũn nc ta cng cú mt vi loi thuc chi Croton L., c dựng y Nguyn Ngha Thỡn [13] ó thng kờ c 41 loi, ú cú ti 21 loi c hc dõn gian Cõy Lptộ (C crassifolium) Tõy Nguyờn c dựng tr hu h thc vt nc ta bnh ng rut [13], cõy Kh sõm cho lỏ (C tonkinensis) tr st rột, bnh Cú nhiu loi cõy thuc chi Croton L c s dng y hc dõn gian nhiu dõn tc, nht l khu vc Trung v Nam M cng nh ụng ng rut [2], [12] Bờn cnh nhng cõy c dựng lm thuc y hc dõn gian, ngi ta cng bit mt s cõy thuc chi Croton L., cú cha c t chõu Phi cú Nam Y hc c truyn Brasil v cỏc dõn tc sinh sng vựng Amazon dựng lỏ, v v r cõy C cajucara [36] cha tr nhiu loi bnh nh l st cao, chng viờm nhim, a chy, viờm loột d dy, gim cholesterol mỏu, cha ung th, h huyt ỏp, dit tr c sờn, xua ui cụn trựng [37] Nc sc r cõy C campestris Brasil c dựng cha bnh giang mai, viờm ng mt, thuc s, tr ung th [26] nhiu Croton spp thuc loi cõy c, c th dõn s dng ỏnh bt cỏ, tm tờn c sn bn nh v cõy C hovarum Madagasca l mt thớ d [34] Vit Nam cú núi n cõy Ba u (C tiglium) [3] l cõy c, dựng lm thuc tr sõu tho mc 1.2 Nhng nghiờn cu hoỏ thc vt v chi Croton L., Cho n cú khong trờn 50 loi thc vt chi Croton L., c nghiờn Equao ngi ta dựng v cõy C eluteria cha bnh cao huyt ỏp, kit cu hoỏ thc vt [28], ó phõn lp v nhn dng c 271 cht, ch yu gm l, st rột, au d dy v cũn cú tỏc dng bi b sc kho [45] Nhõn dõn cỏc cỏc ditecpenoit v ancaloit nc vựng Trung v Nam M nh Peru, Equao dựng nha v v cõy 1.2.1 Cỏc ancaloit C.lechlerii cú tớnh khỏng sinh cha cỏc vt thng, tr ung th [27] Nc Cỏc ancaloit tỡm thy thc vt chi Croton L., u cú cha d vũng sc lỏ cõy C schiedeanus c y hc dõn gian Columbia cha bnh cao huyt c bn l isoquinolin [41], to cỏc b khung proaporphin (1), aporphin (2), ỏp, cú tỏc dng gión mch [29] morphinandienon (3) v rt gn õy l berbin (tetrahydroprotoberberin) (4) R cõy C macrostachys Tanzania c dựng cha bnh tiu S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Cỏc ancaloit khung morphinandienon (3) khỏc bit bi cỏc nhúm 1.2.1.1 Ancaloit khung proaporphin (1) th v trớ 2, 3, 4, 6, 8, 17 v cu hỡnh ca vũng D 1.2.1.4 Ancaloit khung berbin (tetrahydroprotoberberin) (4) NH 6a R2 H 13 12 10 11 R1 O N R3 14 H 13 (1) Cỏc ancaloit kiu khung proaporphin (1) khỏc bi cỏc nhúm th (4) Cỏc berbin (4) hay tetrahydroprotoberberin ancaloit l nhng ancaloit Cỏc ancaloit khung aporphin (2) thng khỏc bit bi nhúm th mi phỏt hin rt gn õy hai loi thc vt chi Croton L., cỏc ancaloit ny khỏc bi cỏc nhúm th gn vo cỏc v trớ 2, 3, 8, 10, 11 v cu hỡnh cỏc v trớ 1, 2, 6, 9, 10, 11 v cu hỡnh hydro v trớ 6a ca proton v trớ C14 6a 1.2.2 Cỏc hp cht ditecpenoit N6 Cỏc ditecpenoit chim ti 114/271 kiu hp cht ó phõn lp v nhn H dng c t cỏc loi thuc chi Croton [28] Cỏch gi tờn v cu trỳc hoỏ hc 11 10 R5 R6 1.2.1.2 Ancaloit khung aporphin (2) 10 12 cỏc v trớ 1, 2, v cu hỡnh ca hydro v trớ 6a R4 ca chỳng rt a dng, t loi khung khụng vũng cho n khung a vũng giỏp (2) Kiu khụng vũng nh phytan (5) (2,6,10,14-tetrametylhexadecan), loi 1.2.1.3 Ancaloit khung morphinandienon mt vũng ln nh cembran (6) (18,19,20-trimetyl-1-isopropylcyclotridecan) A 12 13 C Kiu hai vũng giỏp nh labdan (7), clerodan (8) Ba vũng giỏp nh 11 B 14 15 pimaran (9), kauran (10), beyeran (11) Kiu vũng giỏp nh atisan 10 D N 17 (12), sarcopetelan (13), phorbol (14) Nm vũng nh trachyloban (15) 16 1.2.2.1 Ditecpen khụng vũng O Phytan thuc loi ditecpen khụng vũng, cú cu trỳc hoỏ hc 2,6,10,14(3) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn tetrametylhexadecan (5) http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.2.2.3.2 Clerodan ditecpen (furanoditecpen) Cỏc hp cht ditecpen khung clerodan gp rt ph bin thiờn nhiờn, ch riờng chi Croton L n ó phõn lp c 42 s 114 (5) Cỏc ditecpen loi ny khỏc bi s lng, v trớ v cu hỡnh cỏc nhúm hydroxy, xeton v olefin ditecpenoit t nhng thc vt ny v trớ 15, 16 ca hu ht cỏc clerodan ditecpen úng vũng epoxy hỡnh thnh vũng furan, nờn cỏc ditecpenoit loi ny cũn c gi l furanoditecpen 1.2.2.2 Ditecpen vũng ln Cembran (6) 12 Cembran thuc loi ditecpenoit mt vũng ln chung cú cu trỳc hoỏ hc 11 4,8,12-trimetyl-1-isopropyl-cyclotridecan khỏc bi s lng, v trớ v 10 (8) 17 15 1.2.2.4 Ditecpen cú vũng dớnh kt (pimaran) 19 18 19 10 13 16 14 17 18 15 16 20 cu hỡnh ca liờn kt olefin 14 13 Cỏc loi thuc chi Croton L c nghiờn cu, mi ch thy kiu khung 11 12 pimaran (9) 20 12 17 15 (6) 1.2.2.3 Ditecpen vũng 1.2.2.3.1 Khung labdan (7) 12 11 18 (9) 1.2.2.5 Ditecpen vũng dớnh kt 19 19 17 10 16 14 15 16 10 13 14 13 20 11 20 Thng gp cỏc kiu khung kauran (10), beyeran (11), atisan (12), 18 sarcopetelan (13) v phorbol (14) ditecpen (7) 1.2.2.5.1 Kauran ditecpen S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 12 1.2.2.5.3 Phorbol ditecpen 13 11 20 17 10 R1O HOOC 16 14 O 15 O (10) OH (10.13) O 16 10 19 19 17 14 18 OR2 15 12 13 11 18 HO 20 CH2OR3 (14) 8,15-seco-kauran 1.2.2.5.2 Cỏc ditecpen kiu khung beyeran (11), atisan (12) v Cỏc phorbol ditecpen cú cu trỳc hoỏ hc 4,9 ,12 ,13 ,20pentahydroxy-1,6-tigliadien-3-one, chỳng ch khỏc v cu hỡnh ca sarcopetelan (13) Cỏc kiu cu trỳc (11) v (12) thng gp nhiu h thc vt, nhng ch rt gn õy mi phỏt hin thy cõy Croton sarcopetalus v nhúm hydroxyl v trớ v cỏc nhúm chc khỏc, cho n mi ch gp nht mt cu hỡnh ca phorbol, cũn hu ht l cu hỡnh cng ng thi khỏm phỏ kiu khung sarcopetelan ditecpen (13) iu ỏng 1.2.2.6 Ditecpen vũng dớnh kt (trachyloban) chỳ ý l r cõy ny cũn tỡm thy cỏc dn xut ca clerodan (8) v Cỏc dn xut ca trachyloban thuc loi vũng dớnh kt pimaran (9) ditecpen 12 12 12 11 17 20 15 16 14 13 14 11 20 10 18 19 18 19 (11) (12) 11 20 10 12 19 15 19 (15) Thng gp mt s hp cht tritecpenoit nh l -acetoxy-14- O 16 taraxeren-28-oic acid (16.a) [32, 34, 36, 41], -O-axetoaxetyl-20(29)-lupeol 15 13 14 (16.b) [28] Cỏc hp cht steroit (17) glucosid nh l , 14 ,15 ,16 - 17 18 17 16 1.2.3 Cỏc hp cht khỏc O 13 14 6 18 10 15 10 1 11 13 20 17 16 (13) tetrahydroxypregnan-20-one glucosid (17.1) v (17.2) cõy C ruizianus [43] S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 12 1.3 Nhng nghiờn cu v thnh phn hoỏ hc v tỏc dng ca cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis Gagnep.,) 1.3.1 Gii thiu cõy kh sõm COOH Cõy Kh sõm cho lỏ cú tờn khoa hc l Croton tonkinensis Gagnep., h Thu du (Euphorbiaceae) [1, 2], thuc loi cõy nh, cao khong 0,7-2,0m, AcO CH3CO-CH2CO mc thnh bi, lỏ mc so le, nhỡn gn nh i nhau, cú mc thnh vũng (16.a) gi cú t n lỏ Lỏ cú hỡnh mi mỏc, c mt u cú lụng úng ỏnh nh lỏ (16.b) cõy nhút mt di lỏ cú gõn to t cung, lỏ cú tuyn hoa nh, trng, O mc thnh chựm k lỏ hay u cnh Hoa n tớnh cựng gc, qu cú mnh OH OH RO v ht hỡnh trng, mu Mựa hoa kt qu khong t thỏng n thỏng 1.3.2 Tỏc dng ca cõy kh sõm OH Cõy Kh sõm cho lỏ mc hoang di nhiu ni trờn Bc Vit H Nam, nờn cú nhiu tờn gi khỏc nh l C sõm, Sõm nam, vựng Tõy (17) Thiờn, Tam o, Vnh Phỳc nhõn dõn gi l cõy k ch Thng gp nhiu cỏc vựng Ninh Bỡnh, Ho Bỡnh, Vnh Phỳc, Thỏi Nguyờn, Bc Giang, Thanh MeO N Hoỏ [6] Hin nay, cõy kh sõm c trng nhiu cỏc trm xỏ ụng y, y t O (Me)2 xó v nh dõn Cõy ny thuc loi cõy thuc dõn gian, cha c mt s O N O O bnh, nht l bnh ng rut cho ngi v gia sỳc Nhõn dõn dựng lỏ ti O O NH O OMe (18) ph n b bnh hu sn, l loột ngi ngoi da, cha cỏc vt thng nhim trựng, cha viờm loột hnh tỏ trng, au d dy, tr st rột Hng Yờn, nhõn (19) dõn dựng cnh, lỏ khụ em vng, sc ly nc ung cha bnh tờ thp Ngoi nhng nhúm cht in hỡnh nờu trờn, cỏc thc vt chi Croton rt thng gp taspin (18), nhng ch xut hin nha cõy tit ti ni b thng tn yu t ngoi lai [38], Julocrotine (19) l nhng ancaloit khỏ c bit v gõy c t bo [40] S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn nhai sng, vũ hoc gió nỏt ly nc ung cha bnh au bng, i ngoi, Gn õy nhng kt qu nghiờn cu v thnh phn hoỏ hc v th hot tớnh sinh hc ca cõy Kh sõm ó khng nh tớnh khỏng khun mnh c quyt nh bi cỏc ent -kauran ditecpen, ng thi ó phỏt hin tớnh gõy c hi rt mnh i vi mt s dũng t bo ung th ngi [4] v ch phm t cõy http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 14 Kh sõm cũn cú hot tớnh chng suy gim dch g b nhim virus (gõy C22H32O5 ent-18a-axetoxy7a,14 dihydroxykaur-16en-15-on C20H30O3 ent-7 ,18dihydroxykaur-16en-15-on C24H34O6 ent-1a,14adiacetoxy-7 hydroxykaur-16-en15-on C24H34O6 ent-1a,7 -diacetoxy14a -hydroxykaur16-en-15-on C22H32O4 ent-18-axetoxy-14ahydroxykaur-16-en15-on C22H32O5 ent-11a -axetoxy7 ,14adihydroxykaur-16en-15-on Crotonkin-5 Crotonkin-6 Crotonkin-7 Crotonkin-8 Crotonkin-9 10 Crotonkin-10 suy gim dch) Gumboro cng c [10] 1.3.3 Nhng nghiờn cu v thnh phn hoỏ hc cõy Kh sõm Nhng nghiờn cu hoỏ hc v cõy kh sõm ó cho bit thnh phn ú rt phong phỳ v a dng bao gm nhiu nhúm cht khỏc nh: steroit, tritecpenoit, flavonoit, ancaloit, v ditecpenoit [4] 1.3.3.1 Cỏc ditecpenoit Cho n ó bit 13 ent -kauran ditecpen phõn lp c t cõy Kh sõm (Croton tonkinensis) hu ht chỳng l cht mi thuc dn xut hydroxy ca b khung ent -kauran-16-ent-15-on Theo qui tc IUPAC, chỳng tụi ngh gi tờn cỏc ent -kauran ny l crotonkin kốm theo th t phõn lp (bng 1.1), cu trỳc hoỏ hc v mt vi c tớnh vt lý ca chỳng (bng 1.2) Bng 1.1: Cỏc ent -kauran phõn lp c t Croton tonkinensis Gagnep., Th Tờn cht t Crotonkin-1 Crotonkin-2 Crotonkin-3 Crotonkin-4 CTPT Tờn khoa hc C22H32O4 ent-18-axetoxy-7 hydroxykaur-16-en15-on C22H32O5 ent-1a-axetoxy7 ,14adihydroxykaur-16en-15-on C22H34O4 ent-16(S)-18axetoxy-7 hydroxykaur-15-on C20H30O3 ent-7 ,14adihydroxykaur-16en-15-on S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn Thi gian cụng b 25/10/1999 13/2/2003 Ti liu 14,16 11 Crotonkin-11 C20H28O3 10/11/2002 28/3/2003 15,18 12 Crotonkin-12 C20H32O 13/02/2003 01/3/2004 16,20 13 Crotonkin-13 C26H36O7 9/7/1998 28/3/2003 17,18 http://www.lrc-tnu.edu.vn 28/03/2003 18 09/9/2003 19 01/03/2004 20 01/03/2004 20 01/03/2004 20 Chem 21,24 Pharm.Bull 2002,50, 808813 29/12/2004 ent-kaur-16-en-15Phytochem 22,24 on-18-oic acid 1973, 12, 2712-2723 29/12/2004 ent-18- hydroxykaur- Phytochem 23,24 16-en 1988, 27, 3209-3212 29/12/2004 ent-1a,7 ,14a2007 triacetoxykaur-16en-15-on S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 15 16 (dehydrocorytenchin) [7], benzyltetrahydroisoquinolin (laudanidin) [7] v R1 aporphin ancaloit (corunnin, oxoglaucin) [9] R5 R4 Bng 1.3: Ancaloit khung berbin R3 O Berbin R2-H2C Bng 1.2: Cu trỳc hoỏ hc v c tớnh vt lý ca cỏc Crotonkin R1 t R2 R3 R4 R Tờn cht H Corytenchin [M+H]+ H3CO t cõy Croton tonkinensis Gagnep., Th TT H3CO M mp( C) R 342 H Rt o R5 N (phỳt) H OAc OH H =CH2 360 142-143 23.9 OAc H OH OH =CH2 376 97-98 21.6 H OAc H OH CH3 362 177-179 22.43 H H OH OH =CH2 318 210-212 22.63 H OAc OH OH =CH2 376 H OH OH H =CH2 318 OAc H OH OAc =CH2 418 22.64 OAc H OAc OH =CH2 418 23.01 21.39 155-156 OCH3 CH3 Corytenchirin 356 OH Bng 1.4: Ancaloit khung protoberberin Protoberberin TT R Tờn cht [M+H]+ H3CO H3CO N+ OH Dehydrocorytenchin 338 OCH3 R H OAc H OH =CH2 360 10 11-OAc H OH OH =CH2 376 11 H COOH H H =CH2 316 12 H OH H H =CH2 288 OAc H OAc OAc =CH2 460 13 Bng 1.5: Ancaloit khung Benzyltetrahydroisoquinolin Benzyltetrahydroisoquinolin H3CO Nhng nghiờn cu v thnh phn ancaloit t cõy Kh sõm cho bit ó phõn lp v nhn dng c ancaloit vi b khung rt phong phỳ ú l cỏc ancaloit (corytenchin, corytenchirin S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn [4], [6], Tờn cht [M+H]+ H3CO 1.3.3.2 Cỏc ancaloit berbin TT N CH3 (+)-laudanidin 344 OH OCH3 protoberberin http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 18 HO OH Bng 1.6: Ancaloit khung Aporphin 3'' 6'' 5'' Aporphin TT R1 R2 Tờn cht R3 [M+H]+ HO 1'' H3CO N R1 HO O- R3 OCH3 CH3 Corunnin OH O O 352 OH OH HO OH HO HO O OH O OH O OH O CH3O OCH3 OCH3 Vitexin hay Isovitexin hay apigenin-8C- -D-glucopyranosid apigenin-6C- -D-glucopyranosid Oxoglaucin 352 R2 1.3.3.4 Cỏc tritecpenoit 1.3.3.3 Cỏc flavonoit Hai hp cht tritecpenoit c phỏt hin t cõy Kh sõm ú l Mt vi flavonoit ó phõn lp c t cõy Kh sõm (C tonkinensis) ú l kaempferol hay 3,4,,5,7-tetrahydroxyflavon, vitexin hay apigenin-8C- -D- - Amyrin axetat (urs-12-en-3 -yl axetat) v Axetyl aleuritolic axit (3 hydroxytaraxer-14-en-28-oic axit) [5] glucopyranosid, v isovitexin hay apigenin -6C- -D-glucopyranosid [4], [8] Kaemperol l mt nhng flavonol gp rt ph bin gii thc vt, cú hot tớnh chng viờm nhim, li tiu, chng oxy hoỏ [28] Trong y hc c COOH truyn Vit nam, ngi ta ó phỏt hin cht gii c chớnh l vitexin [4], v vitexin th hin hot tớnh yu vi nm mc Aspergillius niger ngoi khụng cú hot tớnh no khỏc, cũn isovitexin thỡ khụng cú hot tớnh O 10 4' 1' OH -Amyrin axetat 2' HO AcO OH Axetyl aleuritolic axit 1.3.3.5 Cỏc steroit 6' OH Nhúm cht steroit tỡm thy cỏc dch chit t cỏc b phn khỏc O ca cõy Kh sõm cho lỏ, ch yu thuc loi sterol C29 vi b khung - Kaempferol S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn AcO ol, http://www.lrc-tnu.edu.vn -pregnan, cú mch nhỏnh vi cu hỡnh v cu dng khỏc ú l cỏc S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 19 -sitosterol, poriferasterol, 20 -sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl, -sitosterol ú l xỏc nh hot cht ton phn hoc tng thnh phn n gin hn c l phng phỏp nh lng xỏc nh vi stigmasterol [4] 21 18 12 Vic phõn tớch cỏc ditecpenoit thnh phn hn hp l nhim v R2 khú khn v phc tp, vỡ chỳng thng l nhng cht ng phõn cú nhiu tớnh 20 17 cht hoỏ lý rt gn Nghiờn cu xỏc nh nh tớnh v nh lng cỏc 19 14 10 hn hp phc nh vy thng phi dựng cỏc phng phỏp sc ký nh l 15 sc ký lp mng, sc ký lng phõn gii cao v c bit gn õy ph bin l cỏc k thut ca sc ký lng ghộp ph (LC/MS) Phng phỏp HPLC - Bng 1.7: Cỏc steroit khung sterol DAD-ESI/MS l mt cụng c phõn tớch nhanh xỏc nh thnh phn húa R1O R1 hc cõy c thc vt Nú c kt hp gia k thut HPLC, c trng R2 29 -sitosterol H 22 24 ph UV, v b phn cung cp thụng tin v lng phõn t (ESI/-MS) c s dng phõn tớch hn hp cỏc cht phc cõy c so sỏnh vi vi cht chun hoc l thi gian lu V cui cựng nhng cụng b v vic s poriferasterol dng k thut HPLC -DAD-ESI/MS ó ỏnh du mt bc phỏt trin H vic phõn tớch thnh phn phc cỏc phõn on dch chit thụ t cõy c thiờn nhiờn [30], [31] Ngi ta thng s dng k thut ny phõn tớch -sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl nhng thnh phn phc cỏc dch chit thu c t thc vt C6H12O5 1.4.1 Nguyờn tc chung ca phng phỏp sc ký lng cao ỏp (HPLC) Sc 1.4 p dng phng phỏp LC /MS phõn tớch cỏc cht Vic s dng cõy c lm thuc úng vai trũ quan trng v cú hiu qu sc khe cng ng ú l nhng ngun gc thiờn nhiờn vi thnh phn hot cht rt nh cõy c thc vt c s dng cú hiu qu cỏc bnh vin y hc c truyn Theo ú m bo tớnh n nh cng nh hiu qu s dng cõy c vic khỏm cha bnh, cn cú h thng ỏnh giỏ cht lng cỏc dc phm Cú nhiu phng phỏp ỏp dng kim tra cht lng S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn ký lng cao ỏp (HPLC - High Performance Liquid Chromatography) l mt k thut phõn tỏch vt lý hai hay nhiu cu t mt hn hp, cú th dựng phõn tớch cỏc phõn t hoc ion hu c Nh vy, tinh khit ca nhiu hp cht hu c cú th c ỏnh giỏ bng phng phỏp HPLC K thut bao gm mt pha rn c nh (pha tnh) c nhi vo mt ct thộp khụng r v mt pha lng di ng (pha ng) chy qua Vic phõn tỏch cỏc cu t dung dch c thc hin l nh s khỏc v t s phõn b ca cỏc cht tan gia hai pha Phng phỏp HPLC, da trờn cỏc c ch ca hp ph, phõn b, trao i ion hoc kớch c (exclusion gel S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 31 32 dung mụi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) v (1:1) Dch H-3 ; 1,25 (1H, dd, J 1,6Hz, 12,3Hz, H-5); 0,82 (3H, s, CH3-19), 1,11 (3H, s, gii thoỏt t ct c thu nhng khong cỏch nh (5 10ml/phõn CH3-20); 1,19 (1H, d, J 8,5Hz, H-9); 0,71 (1H, td, J 0,9Hz, 3,8Hz, 12,9Hz, H- on) Kim tra cn thu c bng sc ký lp mng v hin mu bng thuc ) th vanilin - H2SO4 5% sau ú cỏc phõn on ging c dn li ri em ct loi dung mụi 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3 ); (ppm): 209,8 (s, C-15); 171,2 (s, OCOCH3); 149,1 (s, C-16); 114,9 (t, C-17); 72,2 (t, C-18); 70,7 (d, C-7); 58,3 Ra gii ct bng h dung mụi nR -hexan-etyl axetat (15:1) v (10:1) ó thu c ch?t r? n kt tinh hỡnh kim, khụng mu (s, C-8); 51,7 (d, C-9); 46,2 (d, C-5); 39,6 (s, C-10); 38,8 (t, C-1); 37,5 (d, C13); 36,4 (s, C-4); 35,4 (t, C-3); 32,8 (t, C-12); 27,8 (t, C-14); 27,6 (t, C-6); Tip tc gii ct bng h dung mụi n -hexan-etyl axetat (5:1) ó thu 21,0 (q, CH3CO); 18,1 (q, C-20); 17,9 (t, C-11); 17,5 (q, C-19); 17,5 (t, C-2) c kt tinh hỡnh kim Hn hp ny em tỏch li trờn ct silicagel loi Ph X -Ray ca Crotonkin-1: nh, gii ct bng h dung mụi hexan -etyl axetat (5:1); (3:1) v (1:1) ó thu c cỏc cht ký hiu D1 (Crotonkin-1) v D2 (Crotonkin-3) Kt tinh li axeton cho cht rn vụ nh hỡnh v mt s tinh th hỡnh kim 2.4.1.1.1 Ent-7 -hydroxy-18-axetoxy-16-kauren-15-on (Crotonkin-1) Ra gii ct bng h dung mụi n -hexan - etyl axetat (4:1), thu c cht kt tinh hỡnh kim, R f B=28, núng chy 142-143 C, Rt =23.9 Ph FT -IR max (cm-1): 3482, 2933, 1744, 1717, 1642, 1466, 1253, 1043 Ph EI -MS m/z (%): 360 [M]+ (13); 342 [M-H2O]+ (7); 332 (25); 269 (9); 225 (4); 161 (9); 135 (24); 107 (48); 91 (77); 79 (100); 55(75) Ph H-NMR (400 MHz, CDCl3); (ppm): 5,94 (1H, t, J 1,0Hz, H- 17B); 5,257(1H, t, J 1,0 Hz, H-17A); 4,00 (1H, dd, J 4,5Hz, 11,7Hz, H-7 ); 3,84 (1H, d, J 11,1 Hz, HB-18); 3,62 (1H, d, J 11,1Hz, HA-18); 3,08 (1H, m, H-13); 2,03 (1H, d, J 2,3Hz, H-14); 1,955 (1H, tdd, J 2,7Hz, 6,2Hz, 13,2Hz, H-12); 1,74 (1H, ddd, J 3,2Hz, 3,1Hz, 12,8Hz, H-1 ); 1,67 (1H, ddd, J 1,9Hz, 4,7Hz, 11,8Hz, H-6 ); 1,411 (1H, q, J 12,0Hz, H-6 ); 1,36 (1H, d, J 4,3Hz, S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.4.1.1.2 Ent-1 -axetoxy-7 ,14 -dihydroxy-16-kauren-15-on (Crotonkin2) Tip tc gii ct bng h dung mụi n -hexan-etyl axetat (4:1) ó thu c cht kt tinh hỡnh kim, R fC=70, núng chy 97-98 C, Rt=21.6 Ph FT -IR (KBr) max (cm-1 ): 3272, 1727, 1651, 1464, 1373, 1243, 1178, 1154, 1118, 1095, 1028, 994, 961 Ph EI -MS m/z(%):377[M+H]+(0.02), 358(0.2), 316[MCH3COOH]+ (4), 299 (4), 298 (10), 284 (2), 283 (9), 255 (1), 245 (2), 229 (3), S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 33 34 227 (4), 145 (2), 121 (4), 117 (5), 107 (11), 105 (17), 79 (13), 69 (14), 55 (26), 43 (100) Ph FT -IR -1 max (cm ): 3489, 2934, 2868, 1732, 1707, 1461, 1380, 1291, 1253, 1056, 934 Ph HREI -MS m/z (%): 376,2248 [M]+ tớnh theo cụng thc C 22H32O5 376,2250 Ph EI -MS m/z (%):362[M]+ (2); 344 [M-18]+ (7); 304 (21); 284 (15); 271 (11); 152 (34); 123 (70); 109 (100); 95 (53); 81 (83); 67 (75); 55 (89) Ph 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) (ppm): 6,04 (d, 1H, J 4,9, OH); Ph 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 ) (ppm): 3,90 (1H, dd, J 3,9, 11,6); 6,16 (s, 1H, OH); 5,92 (s, 1H); 5,38 (s, 1H); 4,73 (s, 1H); 4,68 (m, 1H); 4,00 3,86 (1H, d, J 11,1), 3,64 (1H, d, J 11,1); 2,25 (1H, q, J 7,0 Hz); 2,07 (3H s,); (td, 1H, J 4,9, 12,4 Hz); 1,38 (dt, J 4,1, 14,0 Hz); 2,91 (s, 1H); 1,84 (m, 1H); 1,98 (1H, dd, J 4,2, 10,0 Hz); 1,78 (1H, td, J 13,0, 3,5Hz)); 1,65m; 1,50m; 1,51 (d, 1H, J 8,8Hz); 1,28 (dd, J 5,8, 16,4 Hz); 1,24 (dd, J 1,7; 12,4Hz); 0,90 1,46m; 1,26 (1H, dd, J 3,9, 13,4); 1,28 (1H, d, J 13,2); 1,10 (3H, d, J 7,1q); (s, CH3); 0,83 (s, CH3); 1,06 (s, CH3) 1,12 (3H s,); 0,83 (3H s,) 13 Ph C-NMR (150MHz, DMSO) (ppm): 207,1 (s, C=O); 169,7 (s, Ph 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) (ppm): 223,9 (s); 171,3 (s); 72,3 COCH3); 148,3 (s); 116,8 (t); 72,9 (d); 72,3 (d); 46,8 (d); 46,3 (d); 60,0 (s); (t); 71,3 (d); 58,4 (s); 51,8(d); 48,4 (d); 46,5 (d); 39,3 (s); 38,7 (t); 36,4 (s); 74,4 9d); 45,7 (d); 42,1 (s); 34,7 (t); 32,6 (s); 33,1 (q); 30,6 (t); 28,6 (t); 22,3 35,8 (t); 34, (d); 28,5 (t); 28,4 (t); 25,3 (t); 21,1 (q); 18,3 (q); 17,9 (t); 17,6 (t); 21,3 (q); 21,0 (q); 18,0 (q); 16,5 (t) (t); 17,5 (q); 10,0 (q) Ph X -Ray ca Crotonkin-2: Ph X -Ray ca Crotonkin-3: 2.4.1.1.3 Ent-(16S)-7 -hydroxy-18-axetoxy-kauran-15-on (Crotonkin-3) Tip tc gii ct bng hn hp hexan -etylaxetat (3:1) ó thu c cht kt tinh, khụng mu, khụng mựi, R f C= 63, núng chy 177-179 C, Rt = 2.4.1.2 Cỏc dch chit CHCl ca cnh cõy Kh sõm (F1C1) Lm tng t nh mc 2.4.1.1 t 6.0g cn F1C1 em tỏch trờn ct silicagel, gii ct bng h dung mụi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) v (1:1) Dch gii thoỏt t ct c thu nhng 22.4 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 35 36 khong cỏch nh (5 10ml/phõn on) Kim tra cn thu c bng sc ký lp CHNG THO LUN KT QU NGHIấN CU mng v hin mu bng thuc th vanilin - H2SO4 5% sau ú cỏc phõn on ging c dn li ri em ct loi dung mụi 3.1 Tip tc gii ct bng h dung mụi nT -hexan-etyl axetat (5:1) ó thu c cht kt tinh hỡnh kim nh: CT4 (crotonkin-4), cht D1 (Crotonkin1) Thc nghim v cỏc kt qu t c Cho n ó bit 13 ent -kauran ditecpen t cõy Kh sõm (Croton tonkinensis) hu ht chỳng l cht mi thuc dn xut hydroxy ca b khung ent -kauran-16-ent-15-on Tip tc gii ct bng h dung mụi n -hexan-etyl axetat (3:1) ó thu c cht kt tinh Crotonkin -3 dng hỡnh kim Theo qui tc IUPAC, chỳng tụi ngh gi tờn cỏc ent -kauran ny l crotonkin kốm theo th t phõn lp (bng 3.1), cu trỳc hoỏ hc v mt vi 2.4.2 Cỏc dch chit CHCl ca lỏ cõy Kh sõm thu vo thỏng 3/2008 Cng tng t nh trờn ly 19.7g cn F1L3 em tỏch trờn ct silicagel, gii ct bng h dung mụi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) v (1:1) Khi gii ct bng h dung mụi n -hexan-etyl axetat (5:1) ó thu c tớnh vt lý ca chỳng (bng 3.2) Bng 3.1: Cỏc ent -kauran phõn lp c t Croton tonkinensis Gagnep., Th Tờn cht t Crotonkin-1 CTPT C22H32O4 c hn hp kt tinh vụ nh hỡnh Sau ú em tỏch trờn ct silicagel loi nh, ri gii ct bng h dung mụi hexan -etyl axetat bt u t (10:1); (5:1); (3:1) thu c Crotonkin -5, Crotonkin-3, S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn Crotonkin-2 C22H32O5 Crotonkin-3 C22H34O4 Crotonkin-4 C20H30O3 Crotonkin-5 C22H32O5 Crotonkin-6 C20H30O3 Crotonkin-7 C24H34O6 Crotonkin-1, Crotonkin-2, http://www.lrc-tnu.edu.vn Thi gian Ti cụng b liu ent-18-axetoxy-7 25/10/1999 14,16 hydroxykaur-16-en-15- 13/2/2003 on ent-1a-axetoxy-7 ,14a- 10/11/2002 15,18 dihydroxykaur-16-en- 28/3/2003 15-on ent-16(S)-18-axetoxy- 13/02/2003 16,20 -hydroxykaur-15-on 01/3/2004 ent-7 ,14a9/7/1998 17,18 dihydroxykaur-16-en- 28/3/2003 15-on ent-18a-axetoxy28/03/2003 18 7a,14 -dihydroxykaur16-en-15-on ent-7 ,1809/9/2003 19 dihydroxykaur-16-en15-on ent-1a,14a-diacetoxy01/03/2004 20 -hydroxykaur-16-en- S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn Tờn khoa hc http://www.lrc-tnu.edu.vn 37 Crotonkin-8 Crotonkin-9 10 11 12 13 Crotonkin-10 Crotonkin-11 Crotonkin-12 Crotonkin-13 38 15-on C24H34O6 ent-1a,7 -diacetoxy14a -hydroxykaur-16en-15-on C22H32O4 ent-18-axetoxy-14ahydroxykaur-16-en-15on C22H32O5 ent-11a -axetoxy7 ,14a-dihydroxykaur16-en-15-on C20H28O3 ent-kaur-16-en-15-on18-oic acid C20H32O ent-18- hydroxykaur16-en C26H36O7 ent-1a,7 ,14atriacetoxykaur-16-en15-on 01/03/2004 20 Bng 3.2: Cu trỳc hoỏ hc v c tớnh vt lý ca cỏc crotonkin t cõy Croton tonkinensis Gagnep., 01/03/2004 20 Th R1 t H Chem Pharm.Bull 2002,50, 808-813 29/12/2004 Phytochem 1973, 12, 2712-2723 29/12/2004 Phytochem 1988, 27, 3209-3212 29/12/2004 2007 21,24 22,24 23,24 13,15 R2 R3 OAc OH R5 M mp(oC) H =CH2 360 142-143 Rt (phỳt) 23.9 R4 OAc H OH OH =CH2 376 97-98 21.6 H OAc H OH CH3 362 177-179 22.43 H H OH OH =CH2 318 210-212 22.63 H OAc OH OH =CH2 376 H OH OH H =CH2 318 OAc H OH OAc =CH2 418 22.64 OAc H OAc OH =CH2 418 23.01 OAc H OH =CH2 360 OH OH =CH2 376 H 10 11-OAc H 11 H COOH H H =CH2 316 12 H OH H H =CH2 288 13 OAc H OAc OAc =CH2 460 21.39 155-156 R1 R4 R5 R3 O R2-H2C S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 39 40 3.2 Chit tỏch, phõn lp cỏc hot cht chớnh ent -kauran t cõy Kh sõm Vi nhim v phõn lp mt s ent -kauran l thnh phn chớnh ca cõy Kh sõm v dch chit ca lỏ, cnh Mu cõy em phõn loi riờng cnh v lỏ Nguyờn liu ó xy khụ, nghin nh v c ngõm chit theo s 2.1 T mu cõy thu vo thỏng 1/2008 ti Tõn Yờn Bc Giang ó phõn lp c mt s hp cht sau: 3.2.2 3.2.1 Ent-7 -hydroxy-18-axetoxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-1) (Crotonkin-2) Ent-1a-axetoxy-7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on T lỏ v cnh cõy ny chỳng ó thu c cht crotonkin -1 [4] Hin Cht ny c phõn lp t b phn cnh v lỏ ent -kauran ny d tan mu trờn SKLM vi thuc th vanilin -H2SO4 cho mu tớm , vi thuc th cỏc dung mụi hu c, ớt tan ete du ho, cho phn ng mu da Dragendorf cho mu vng cam xn, sau ú chuyn sang mu nõu, di ỏnh cam ti vi thuc th Dragendorff, mu tớm en vi thuc th vanilin - sỏng t ngoi (254 nm) khụng cho hunh quang Khi kt tinh li hn H2SO4 5% Kt tinh li axeton cho cht rn vụ nh hỡnh núng chy hp etylaxetat -n-hexan cho tinh th hỡnh kim, núng chy 1420-1430C Vic 107-1080C v mt s tinh th hỡnh kim núng chy 97-980C Kt tinh li so sỏnh i chiu cỏc dn liu ph FT -IR ,MS, 1H- v 13C-NMR a cu hn hp etylaxetat -n-hexan cho tinh th hỡnh kim, núng chy 97- trỳc ent -7 -hydroxy-18-axetoxykaur-16-en-15-on (crotonkin-1) hon ton 980C So sỏnh cỏc c trng vt lý vi cht chun v cỏc d liu ph FT -IR phự hp vi [4] Nhng tinh th hỡnh kim ca cht ny cho ph nhiu x tia ,MS, 1H- v X rừ rng v phi cnh khụng gian ca nú nờu hỡnh 3.1 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-2) Nhng tinh th hỡnh kim 13 C-NMR hon ton phự hp vi cu trỳc ent -1a-axetoxy- ca cht ny cho ph nhiu x tia X rừ rng v phi cnh khụng gian ca nú Phi cnh khụng gian ca crotonkin -1 nờu hỡnh 3.2 Phi cnh khụng gian ca crotonkin -2 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 41 42 3.2.3 Ent-16(S)-18-axetoxy-7 -hydroxykaur-15-on (Crotonkin-3) ent-kauran ditecpen ny c phõn lp t cnh cõy C.tonkinensis Crotonkin-3 hin mu trờn SKLM vi thuc th vanilin -H2SO4 cho mu tớm 3.2.4 Ent-7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on(Crotonkin-4) T lỏ cõy C tonkinensis ó phõn lp c cht Crotonkin -4 Cỏc c trng vt lý nh giỏ tr Rf, im núng chy 210-212oC cỏc phộp ghi ph thu , khụng cho hunh quang di ỏnh sỏng t ngoi (254 nm) v cng khụng c so vi cỏc d liu ph chun [16], [17] cho phộp xỏc nh l ent -7 ,14 cú phn ng mu vi thuc th Dragendorff Kt tinh li hn hp a -dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-4) etylaxetat -hexan cho nhng tinh th hỡnh kim, núng chy 177C-179 C Cỏc 3.2.5 c trng vt lý nh giỏ tr Rf, im núng chy v cỏc d liu ph thu c (Crotonkin-5) 13 FT -IR, MS, H- v C-NMR hon ton phự hp vi cu trỳc ent -16(S)-18- Ent-18a-axetoxy-7a,14 -dihydroxykaur-16-en-15-on T cnh kh sõm thu vo thỏng ó phõn lp c Crotonkin -5 axetoxy-7 -hydroxykaur-15-on (Crotonkin-3) Nhng tinh th hỡnh kim ca Nhng s liu phõn tớch lỏ v cnh cõy kh sõm trờn mỏy LC -MS cho cht ny cho ph nhiu x tia X v phi cnh khụng gian ca nú nờu bit, lỏ thng cú cỏc ent -kauran ch yu l crotonkin -1, -2, -7, v -8, hỡnh 3.3 cnh cng cú cỏc thnh phn tng t, riờng crotonkin -3 thng tri hn, cũn crotonkin -7 v -8 li thp hn rt nhiu Sau x lý lng lỏ v cnh núi trờn ó thu c cỏc ent -kauran nh sau: Phi cnh khụng gian ca Crotonkin -3 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn Tờn cht http://www.lrc-tnu.edu.vn Khi lng Tờn cht Khi lng Crotonkin-1 30mg Crotonkin-4 20mg Crotonkin-2 18mg Crotonkin-5 10mg Crotonkin-3 15mg Crotonkin-7 v -8 7,8mg S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 44 3.3 Xõy dng phng phỏp nh lng mt s thnh phn chớnh ca hn v 0,5mg/ml hp ent -kauran Cỏc cht Crotonkin -1, Crotonkin-2, Crotonkin-3 tinh khit mụ t mc S liu phõn tớch nh tớnh cỏc dch chit t cõy Kh sõm cho bit cỏc 3.2 l nhng ent -kauran ch yu ca cõy Kh sõm cho lỏ, chỳng c dựng ent -kauran lỏ v cnh ca Croton tonkinensis thng cú cha 3-4 thnh lm mu chun xõy dng ng chun phõn tớch nh lng theo phn chớnh, tu thuc vo b phn dựng (lỏ, cnh), thi im thu hỏi v ni phng phỏp LC -MS sinh trng 3.3.1 Xỏc nh ng chun v cỏc tham s phng trỡnh tng quan cú th xỏc nh mt cỏch ng thi hm lng cỏc ent -kauran chớnh ca Crotonkin -1 nguyờn liu, chỳng tụi dựng phng phỏp LC -MS l phng phỏp Dựng 50mg Crotonkin -1 chun b dung dch gc v to dung ny ỏp ng c cỏc yờu cu nhanh, nhy, cú tớnh chn lc cao v dch vi nng khỏc nhau, bm l vo ct v chy 30phỳt/ 1ln o Cỏc cựng mt mu phõn tớch nng cht chun crotonkin -1 c o lp li ln trờn thit b LC -MS thc hin phng phỏp ny, chỳng tụi ó la chn cỏc thụng s k ly giỏ tr trung bỡnh Cỏc s liu tng quan gia nng vi din tớch tớch thut ỏp ng ch ti u cho h thng LC -MS gm: ct phõn tớch Zorbax phõn cỏc nng khỏc ghi bng 3.3 SB-C18, RP (3.0 Bng 3.3 : Tng quan gia nng v din tớch tớch phõn cỏc nng 150mm), detector DAD ( = 254nm) v MS (ESI- Electron spray ionisation), h dung mụi MeOH -H2O (gradien 10 :90), tc khỏc ca crotonkin -1 dũng 0,4ml/phỳt, thi gian ghi 30 phỳt tớch tớch phõn trờn sc ký s xỏc nh cỏc tham s ca phng trỡnh hi qui 0.001 46.01477 133.97966 23.9 Khi lng phõn t [M]+ 360 dng y = ax + b 0.005 93.43894 162.4191 23.9 360 0.01 108.5686 197.9684 23.9 360 0.05 448.9195 482.3628 23.9 360 0.1 886.9082 837.8558 23.9 360 t cỏc tr s quan sỏt c t mu yi so vi tr s lý thuyt ca phng trỡnh 0.2 1939.755 1548.8418 23.9 360 hi qui l nh nht [11] 0.5 3521.622 3681.7998 23.9 360 Vic xõy dng ng chun cho mu phõn tớch c thc hin vi Nng Stt nng khỏc T cỏc s liu v s tng quan gia nng vi din Nguyờn tc chung ca phng phỏp ny l t ỏm mõy im thc nghim chn ng hi qui lý thuyt cho tng bỡnh phng cỏc hiu sai Din tớch thc nghim Din tớch lý thuyt Thi gian (phỳt) Mu chun c cõn chớnh xỏc 50mg cho vo bỡnh nh mc 50ml, sau ú thờm MeOH cho n vch chun s c dung dch gc Pha loóng dung Cỏc s liu bng 3.3 ch tớnh n nh cao v giỏ tr tớch phõn (S), dch gc thnh cỏc dung dch cú nng 0,001 ; 0,005 ; 0,01 ; 0,05 ; 0,1 ; 0, S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 45 46 lng phõn t (M) v thi gian lu (Rt = 23, phỳt) ca Crotonkin -1 Dựng phng phỏp bỡnh phng ti thiu v t cỏc s liu bng 3.3 Bng 3.4 : Tng quan gia nng v din tớch tớch phõn cỏc nng khỏc ca Crotonkin -2 ó xỏc nh c cỏc h s phng trỡnh hi qui ca Crotonkin -1 cú: a = 7109,8596 ; b = 126, 8697 v h s tng quan R = 0,989908 Thi Din tớch STT Nng thc nghim Vy phng trỡnh tng quan ca Crotonkin -1 l: Din tớch lý thuyt gian (phỳt) Khi lng phõn t [M]+ y = 7109,8596 XCT-1 + 126,8697 0.001 40.21345 22.143177 21.1 376 y: Din tớch pic thu c trờn ph LC -MS 0.005 42.04944 48.772285 21.6 376 XCT-1: Hm lng (mg/ml) ca Crotonkin -1 0.01 69.21092 82.05867 21.6 376 0.05 363.3754 348.34975 21.6 376 0.1 677.5821 681.2136 21.6 376 3500 0.2 1331.266 1346.9413 21.6 376 3000 0.5 3349.907 3344.1244 21.6 376 Đ-ờng chuẩn D1 Diện tích 4000 2500 Da vo phng phỏp bỡnh phng ti thiu v cỏc s liu bng 3.4 2000 ó thu c cỏc h s phng trỡnh hi qui ca Crotonkin -2 cú 1500 1000 a = 6657,277 ; 500 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ (mg/ml) 0.5 0.6 Dien Tich LT b = 15, 48592 v h s tng quan R = 0,9999391 Vy phng trỡnh tng quan ca Crotonkin -2 l: Y = 6657,277 XCT-2 + 15,48592 Hỡnh 3.1 : ng chun Crotonkin -1 Đ-ờng chuẩn CT1 3.3.2 Xỏc nh ng chun v cỏc tham s phng trỡnh tng quan 4000 3500 ca Crotonkin -2 Dựng 50mg Crotonkin -2 v lm tng t nh trờn, cỏc s liu thu c ghi bng 3.4 Dien tich 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ (mg/ml) 0.5 0.6 Dien tich LT Hỡnh 3.2: ng chun Crotonkin - S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 48 Tớnh n nh cao cỏc ln o lp li cng nh s tng quan cht Đ-ờng chuẩn D2 ch gia cỏc nng cht chun v din tớch thu c c trờn ph LC -MS 450 400 c phn ỏnh bi h s tng quan R phng trỡnh tng quan ca 350 Diện tích píc Crotonkin -1 (0,989968) v ca Crotonkin -2 (0,999939) l rt cao Nh vy phộp nh lng mi cht hn hp bng phng phỏp 300 250 200 150 LC -MS l u vit, ỏp ng cỏc yờu cu nhanh, nhy v chn lc ỏnh giỏ 100 cht lng nguyờn liu bỏn thnh phm cng nh thnh phm quỏ trỡnh 50 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Nồng độ nghiờn cu v sn xut Hỡnh 3.3: ng chun Crotonkin - 3.3.3 Xỏc nh ng chun v cỏc tham s phng trỡnh tng quan ca Crotonkin -3 Dựng 50mg Crotonkin -3 v lm tng t nh trờn, cỏc s liu thu D Da vo phng phỏp bỡnh phng ti thiu v cỏc s liu bng 3.5 ó thu c cỏc h s phng trỡnh hi qui ca Crotonkin -3 cú a = 567,63 ; c ghi bng 3.5 b = 29, 16 v h s tng quan R = 0,9740 Vy phng trỡnh tng quan ca Crotonkin -3 l: Bng 3.5 : Tng quan gia nng v din tớch tớch phõn cỏc nng Y = 567,63 XD-2 + 29,16 khỏc ca Crotonkin -3 Thi gian Pớc phõn t Stt Nng Din tớch pic (phỳt) [M+H-H2O]+ 0.1 27.603 24,01 345 Cng nh Crotonkin -1 v Crotonkin -2 tớnh n nh cao cỏc ln 0.2 84.366 24,01 345 o Crotonkin -3 lp li cng nh s tng quan cht ch gia cỏc nng 0.4 197.892 24,01 345 cht chun v din tớch thu c trờn ph LC -MS c phn ỏnh bi h s 0.5 254.655 24,01 345 tng quan R phng trỡnh tng quan ca Crotonkin -3 (0,9740) l rt 0.8 424.944 24,01 345 cao y: Din tớch pic thu c trờn ph LC -MS XD-2 : Hm lng (mg/ml) ca Crotonkin -3 3.3.4 Xỏc nh hm lng Crotonkin -1 v Crotonkin -2 cõy Kh sõm Cõn ly mt lng nguyờn liu (M) ngõm chit v thu cn chit giu ent -kauran (m) Cõn chớnh xỏc 1mg cn chit v ghi trờn mỏy LC -MS T phng trỡnh tng quan (y = ax + b) v din tớch tớch phõn LC -MS S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 50 3.3.4.1 Xỏc nh hm lng ca crotonkin lỏ v cnh Kh sõm ca mi cht s tớnh c lng ca cht ú 1mg cn chit (m) v hm lng (%)ca Crotonkin nguyờn liu tớnh theo cụng thcc: % crotonkin = yCT - b x a m M theo cỏc thi im khỏc Theo dừi s bin ng hm lng cỏc Crotonkin -1 v Crotonkin -2 x 100 (3.1) Trong ú yCT : din tớch tớch phõn trờn ph LC -MS ng vi Rt ca cnh v lỏ cõy Kh sõm trng Súc Sn - H Ni cho kt qu ghi bng 3.6 Bng 3.6: Hm lng Crotonkin ch yu ca lỏ v cnh Kh sõm thu Crotonkin a, b: Cỏc h s phng trỡnh tng quan ca crotonkin Súc Sn - H Ni theo mt s thi im nm Crotonkin-1 cú a = 7109,85, b = 126,87 STT Crotonkin-2 cú a = 6657,28, b = 15,48 m: cn chit giu ent -kauran thu c t lng M M: lng nguyờn liu em phõn tớch Vớ d cỏch tớnh: 200g (M) lỏ khụ nghin nh thu hi thỏng 5/2007 Súc Sn - H Ni c ngõm chit kit, lm giu ent -kauran thu c 23, 4g cn thụ Cõn chớnh xỏc 1mg cn chit v a phõn tớch trờn mỏy LC-MS thu c sc ký ký hiu M107 vi Rt ca Crotonkin nh sau: yCT Rt Crotonkin-1 388,463 23,96 Crotonkin-2 196,815 21,60 Thay bng s vo cụng thc (3.1) ta cú: 388,463-126,87 x 7109,86 % crotonkin-2 = 4/2007 5/2007 11/2007 B phn Lỏ Cnh Lỏ Cnh Lỏ Cnh Hm lng (%) Crotonkin-1 Crotonkin-2 0,335 0,062 0,430 0,360 0,520 0,530 0,192 0,048 0,320 0,350 0,560 0,530 3.3.4.2 Xỏc nh hm lng ca Crotonkin ch yu ca lỏ Kh sõm cỏc vựng sinh trng khỏc Trờn sc ký M107 cho bit din tớch tớch phõn LC -MS tng ng % crotonkin-1 = Thi gian ly mu 196,815-15,48 6657,28 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn 23,4 x 100 = 0,43 200 x 23,4 x 100 = 0,32 200 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bng 3.7: Hm lng mt s ent -kauran ch yu ca lỏ Kh sõm thu mt s vựng khỏc B phn Thi gian Hm lng (%) Hm lng (%) a im cõy thu mu Crotonkin-1 Crotonkin-2 Lỏ Súc Sn 5/2007 0,43 0,32 Lỏ Ninh Bỡnh 5/2006 0,74 0,50 Lỏ Phỳ Th 0,73 0,78 9/2007 Lỏ Ninh Bỡnh 0,80 0,70 Lỏ Súc Sn 0,52 0,56 11/2007 Lỏ Hng Yờn 0,75 0,50 T cn chit giu ent -kauran ca cỏc mu Kh sõm theo cỏc ph LC - S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 52 MS (xem ph lc) Sau x lý s liu ó thu kt qu phõn tớch hm lng KT LUN Crotonkin -1 v Crotonkin -2 theo cỏc thi im nm (bng 3.6) v theo vựng nguyờn liu (bng 3.7) ỏnh giỏ cỏc s liu bng ny ó quan sỏt thy hm lng cỏc Crotonkin ch yu ca cõy Kh sõm cú s bin ng rừ rt: ó xỏc nh c cỏc iu kin thớch hp i vi phng phỏp LC /MS phõn tớch mt s ent -kauran ditecpen chớnh lm c s cho vic nh lng ng thi cỏc ditecpen ton phn cú hn hp nghiờn cu Hm lng ca cỏc Crotonkin cõy tng dn t xuõn hố v t ó xõy dng phng phỏp nh lng Crotonkin -1, Crotonkin-2, mc cao nht vo thu hng nm Hm lng Crotonkin -1 Crotonkin-3 ỏp ng cỏc yờu cu nhanh, nhy, chn lc v cho phộp xuõn hố luụn cao hn Crotonkin -2 t 1, 74 n 1, 34 ln l ỏ, v t 1, 29 n nh lng ng thi hm lng Crotonkin -1 v Crotonkin -2 1, 03 ln cnh, nhng sang thu thỡ chờnh lch khụng ỏng k hn hp Nhng s liu phõn tớch ban u cho thy: lỏ cõy kh sõm thu cỏc vựng trung du (Bc Giang, Phỳ Th, Ninh Bỡnh) cú hm lng ent -kauran luụn cao hn nhng cõy trng Súc Sn - H Ni p dng phng phỏp LC /MS phõn tớch 18 mu nguyờn liu cú cha ent -kauran ditecpen chớnh l Crotonkin -1 v Crotonkin -2 Cỏc s liu phõn tớch thnh phn Crotokin -1 v Crotonkin -2 thu c T nhng kt qu nghiờn cu s b v s bin ng hm lng hot cht ca cõy Kh sõm ó cú c s núi rng: nguyờn liu tt nht chit mt s thi im khỏc cho bit nguyờn liu tt nht chit xut l dựng nguyờn liu thu hỏi vo thu hng nm xut Crotonkin -1 v Crotonkin -2 l dựng lỏ cõy Kh sõm vựng trung du thu hỏi vo thu hng nm ó xõy dng c phộp nh lng ng thi hm lng Crotonkin-1 Crotonkin-2 hỗn hợp Xác định đ-ợc thời điểm thu nguyên liệu để chiết xuất hoạt chất S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 54 TI LIU THAM KHO DANH MC CC CễNG TRèNH CễNG B Vừ Vn Chi (1997), T in cõy thuc VN trang 622-623, Nh xut bn Phm Hong H (1991), "Cõy c Vit Nam", Mekong Printing Tt Li (1999), "Nhng cõy thuc v v thuc Vit Nam", (in ln th Y hc TP H Chớ Minh LIấN QUAN N LUN VN Pham Thi Hong Minh a, Nguyen Quyet Tien a , Nguyen Ngoc Tuana, Pham Hoang Ngoc a, Ngo Van Quanga, Nguyen Xuan Hoangb Quantitative Determination of two diterpenoids in Croton tonkinensis Gagnep., by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Diode Array Detector and Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry International scientific conference on Chemistry for development and intergration 30th Anniversary of the Institute of Chemistry Vietnam Academy of Science and Technology Setember 12-14, 2008 Hanoi, Vietnam 8), trang 907-908, Nh xut bn Y hc, H Ni Phm Th Hng Minh V thnh phn hoỏ hc v cỏc hot cht ca cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis Gagnep.,) h Euphorbiaceae Lun ỏn tin s hoỏ hc, H Ni 12/2003 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc (2002), "Phõn lp v nhn dng cỏc triterpen acetat cõy Croton tonkinensis", Tp Dc hc, 2002, 12, 8-9 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc, Trn Quang Hng, Chu ỡnh Kớnh (2003), "Phỏt hin cỏc berbin alcaloit cõy kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis", Tp Phõn tớch lý, hoỏ, sinh, 2004, (1), 38-41 Phm Th Hng Minh, Lu Th Hu, Phm Hong Ngc, Phm Hu in (2006), Gúp phn nghiờn cu thnh phn ancaloit cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis) Tõy Thiờn -Tam o Tp khoa hc Trng HSP H Ni, cỏc KHTN 2006, trang 110-114 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc, Chu ỡnh Kớnh (2004), "Phõn lp v nhn dng mt s flavonoit -C-glucosid t cõy kh sõm cho lỏ (C tonkinensis) cú Vit nam" Tp Hoỏ hc , 2004, 42 (2), 187-190 Phm Th Hng Minh, Nguyn Th Lan, Phm Hu in, Nguyn Quyt Tin, Phm Hong Ngc (2007), Nghiờn cu thnh phn ancaloit S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 56 cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis) thu hỏi Ninh 16 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc (2003), "ent-(16S)-7 -hydroxy18-acetoxy kauran-15-on - mt kauran diterpen mi, phõn lp t cõy Bỡnh Hi Ngh Hoỏ hc Hu c Ton quc10 /2007, kh sõm cho lỏ Croton tonkinensis", 10 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc, ỏi Duy Ban, Lờ Kim Xuyn, Tp Hoỏ hc, 41(2), 104-109 Hong Th Minh Chõu, Lờ Trung Dng, Phan Xuõn c, Nguyn 17 Perry N B., Burgess E J., Back S H., Weavers R T., Geis W., Manger A Vn V "Kt qu nghiờn cu kh nng tng cng dch ca B., (1999) "11-Oxygenated cytotoxic 8,9-secokauranes from a New cỏc ch phm kh sõm Croton tonkinensis Gagnep.," Zealand liverwort, Lepidolarena tayloric " Tp Y hc Vit Nam, 2007, 333, 24-28 11 Chu Van Man (2003) Informatic applications in biology Tr 195201 National University of Hanoi Press 2003 12 Trng Vn Nh Nghiờn cu cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis) Phytochemistry, 50 (9), 423-433 18 Phan Minh Giang, Hui Zi Lin, Phan Tong Son, Jeong Hyuny Lee, Yuong Soo Hong and Jung Joon Lee (2003) Ent-kauran diterpenoids from Croton tonkinensis inhibit LPS-inuce NF -kB activation and no production v ỏnh giỏ tỏc dng trờn ký sinh trựng st rột bng phng phỏp thc nghim J Nat Prod., 66 (9), 1217-1220 19 Pham Thi Hong Minh, Pham Hoang Ngoc, Nguyen Manh Cuong, Taylor Lun PTS khoa hc y dc H ni 1992 13 Nguyn Ngha Thỡn (1995), "H thu du (Euphorbiaceae Juss h W C, (2004) A new ent-kauran diterpenoid from Croton tonkinensis Gagnep., leaves. thc vt Vit Nam", Fitoterapia, 75 (2), 552-556 Tp Sinh hc, 17(4), 7-30 14 Phan Tng Sn, Vn Ngc Hng, Phan Minh Giang, Taylor W C 20 Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Lee, J J., and Otsuka, H., (2004) entkauran diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep., Chem Pharm Bull., 52 (7), 879-882 (1999), "úng gúp vo vic nghiờn cu hot cht sinh hc t cõyKh sõm cho lỏ Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae" Tp Hoỏ hc, 27(4), tr 1-2 15 Pham Thi Hong Minh, Pham Hoang Ngoc, ang Ngoc Quang, Hashimoto 21 Nagashima F., Kondoh M., Uematsu T., Nishiyama A., Saito S., Sato M., and Asakawa (2002) Chem Pharm Bull 50, 808-813 22 Gonzales A.G., Frega B.M., Hernandez M G., Luis J G., (1973) Phytochemistry, 12, 2721-2723 T., Takaoka S., Asakawa Y (2003), "A novel ent-1 -acetoxy7 ,14 -dihydroxy-16-kauren-15-on from the Croton tonkinensis", 23 Monte F J G., Dantas E M G., Braz F R., (1988) Phytochemistry, 27, 3209-3212 Chem Pharm Bull.51(5), 590-591 24 Phan Minh Giang, Hideakii Otsuka, Phan Tong Son (2005) "The minor ent-kauran-16-en-15-on type diterpen from Croton tonkinensis" Journal of Chemistry, 43 (2), 263-264 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 58 25 Addae Mensah I., Achenbach H., Waibil R., and Mwangi J W (1992), "Epoxychiromodine and other constitutents of 33 Kitazawa E., Two diterpenes alcohols from Croton sublyratus (1981), Croton megalocarpus" Phytochem., 20(2), 287-289 34 Krebs H C., Ramiarantsoa H (1996), "Clerodan diterpenes and other Phytochem., 31(6), 2055-2058 constituents of Croton hovarum" 26 Barbili F E., Moulis C., Bon M Respand M J., Fouraste I (1998), Phytochem., 41(2), 561-563 35 LecomteH., Flore general de LIndochiene, 1910-1931 Tom V., "Three furanoditerpenes from the bark of Croton campestris Phytochem., 48(1), 165-169 27 Cai Y., Chen Z P., and Phillipson J D (1993), "Clerodane diterpenoids from Croton lechleri" p.291 36 Maciel M A M., Pinto A C., Arruda A C., Pamploma S G S R., Vandelinde F A., Lapa A j., Echevarria A., Rao V S N (2000), Phytochem., 34(1), 265-268 28 Chapman & Hall/CRC 1982-2006,From DNP on CD-ROM,Version "Ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology: a successful combination in the study of Croton cajucara" 15:1 J Ethnopharm., 70, 41-55 29 Chatterjee A., Banerjee A., and Bohlmann F (1978), "Isocrotocaudin, a new norclerodans-type diterpene from Croton caudatus", 37 Maciel M A M., Pinto A C., Brabo S N and Silva M D A (1998), "Terpenoids from Croton cajucara" Phytochem., 17, 1777-1779 Phytochem., 49(3), 823-828 30 Gelpi E., Contributions of liquid chromatography-mass spectrometry to 38 Martins A.P., Salguerio L.R., Goncalves M.J., Vila R., Tomi F., (2000) highlights of biomedical research Antimicrobial activity and chemical composition of the back oil of J Chromatogr A, 1000, p 567-581 (2000) Croton stellulifea, an endemic species from S tome & Principe 31 He X G., On-line identification of phytochemical constituents in Planta Med., 66(7), 647-650 botanical extracts by chromatographic-diode combined array high-performance detection-mass liquid 39 Ngadjui B T., Folefoc G G., Keumedjio F., Dongo E., Sondengam B spectrometric L., Connolly J D (1999), "Crotonadiol, a labdane diterpenoids techniques from the stem bark of Croton zambesicus" J Chromatogr A, 880, p 203-232 (2000) Phytochem., 51, 171-174 32 Kapingu M C., Guillaume D., Mbwambo Z H., Moshi M J., Uliso F 40 Nguyen Manh Cuong, Tran Van Sung, Ahn B.Z (2002) Cytotoxic C., (2000), Mahunnah R L A "Diterpenoids from the roots of compounds from Croton Cascarilloides Kor Croton macrostachys" J Pharmacogn., 33(3), 207-210 Phytochem., 54, 767-770 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 60 41 Pelletier S W (1970) Chemistry of the alkaloids Van Nostrand PH LC Reihold company Newyork/Toronto/London/Melburn., p 31-82 42 Peres M T L P., Monache F D., Cruz A B., Pizzolati M G., Yunes R A (1997), "Chemical composition and antimicrobial activity of Croton urucurana Baillon (Euphorbiacea) J Ethnopharm., 56, 223-226 43 Piacente S., Belisario M A., Castillo H D., Pizza C., and Feo V D (1998), "Croton ruizianus: Platelet proaggregating activity of two new pregnane glucoside" J Nat Prod., 61, 318-322 44 Roengsumram S., Achayindee S., Petsom A., Vilaivani T (1998), "Two new cembranoids from Croton oblongifolius" J Nat Prod., 61, 652-654 45 Vigor C., Fabre N., Fourastộ I and Moulis C (2002), Neoclerodane diterpenoids from Croton eluteria J Nat Prod., 65, 1180-1182 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Ph ca Crotonkin -1 1.1 Ph IR 1.2 Ph MS 1.3 Ph 1H-NMR 1.4 Ph 3C-NMR v DEPT Ph ca Crotonkin -2 2.1 Ph IR 2.2 Ph 1H-NMR 2.3 Ph 3C-NMR 2.4 Ph DEPT Ph ca Crotonkin -3 3.1 Ph IR 3.2 Ph MS 10 3.3 Ph 1H-NMR 11 3.4 Ph 3C-NMR 12 Ph ca Crotonkin -5 13 4.1 Ph 1H-NMR 13 4.2 Ph 3C-NMR 14 4.3 Ph DEPT 15 Cỏc s liu phõn tớch ph LC /MS v ng chun ca Crotonkin -1 16 Cỏc s liu phõn tớch ph LC /MS v ng chun ca Crotonkin -2 32 Mt s i din ph LC /MS ca mu thu ti Súc Sn 48 7.1 Ph LC /MS ca mu lỏ kh sõm thu 5/2007 48 7.2 Ph LC /MS ca mu cnh kh sõm thu 5/2007 50 7.3 Ph LC /MS ca mu lỏ kh sõm thu 4/2007 52 7.4 Ph LC /MS ca mu cnh kh sõm thu 4/2007 54 7.5 Ph LC /MS ca lỏ kh sõm thu ti Ninh Bỡnh vo thỏng 5/2007 56 7.6 Ph LC /MS ca cnh kh sõm thu ti Ninh Bỡnh 5/2007 58 Cỏc s liu phõn tớch ph LC /MS v ng chun ca Crotonkin -3 60 Mt s i din ph LC /MS ca mu thu ti Tờn Yờn-Bc Giang 72 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... hot cht ca cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis Gagnep.,) h Euphorbiaceae Lun ỏn tin s hoỏ hc, H Ni 12/2003 5 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc (2002), "Phõn lp v nhn dng cỏc triterpen acetat trong cõy Croton tonkinensis" , Tp chớ Dc hc, 2002, 12, 8-9 6 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc, Trn Quang Hng, Chu ỡnh Kớnh (2003), "Phỏt hin cỏc berbin alcaloit trong cõy kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis" , Tp chớ Phõn... crotonkin trong lỏ v cnh Kh sõm ca mi cht s tớnh c khi lng ca cht ú trong 1mg cn chit (m) v hm lng (%)ca Crotonkin trong nguyờn liu tớnh theo cụng thcc: % crotonkin = yCT - b x a m M theo cỏc thi im khỏc nhau 3 Theo dừi s bin ng hm lng cỏc Crotonkin -1 v Crotonkin -2 x 100 (3.1) Trong ú yCT : din tớch tớch phõn trờn ph LC -MS ng vi Rt ca trong cnh v lỏ cõy Kh sõm trng Súc Sn - H Ni cho kt qu ghi trong. .. cõy ti ly v c sy ngay 110 C trong 10 phỳt dit men, Cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis) thuc loi thc vt c hu sau ú hong khụ ni thoỏng mỏt, hoc sy nhit 50-60 C cho ti khi ca Vit Nam l cõy thuc dõn gian, cha c mt s bnh ph bin, nhng khụ giũn Mu khụ em nghin nh, cho vo bỡnh ngõm chit vi cloroform hiu bit v thnh phn húa hc v dc lý ca cõy cho bit cú tỏc dng nhit phũng cho n khi nht mu chng viờm,... vi thuc th trong cỏc dung mụi hu c, ớt tan trong ete du ho, cho phn ng mu da Dragendorf cho mu vng cam xn, sau ú chuyn sang mu nõu, di ỏnh cam ti vi thuc th Dragendorff, mu tớm en vi thuc th vanilin - sỏng t ngoi (254 nm) khụng cho hunh quang Khi kt tinh li trong hn H2SO4 5% Kt tinh li trong axeton cho khi cht rn vụ nh hỡnh núng chy hp etylaxetat -n-hexan cho tinh th hỡnh kim, núng chy 1420-1430C... CT4 (crotonkin-4), cht D1 (Crotonkin1) Thc nghim v cỏc kt qu t c Cho n nay ó bit 13 ent -kauran ditecpen t cõy Kh sõm (Croton tonkinensis) hu ht chỳng l cht mi thuc dn xut hydroxy ca b khung ent -kauran-16-ent-15-on Tip tc ra gii ct bng h dung mụi n -hexan-etyl axetat (3:1) ó thu c cht kt tinh Crotonkin -3 dng hỡnh kim Theo qui tc IUPAC, chỳng tụi ngh gi tờn cỏc ent -kauran ny l crotonkin kốm theo. .. Crotonkin -1, Crotonkin-2, Crotonkin-3 tinh khit mụ t mc S liu phõn tớch nh tớnh cỏc dch chit t cõy Kh sõm cho bit cỏc 3.2 l nhng ent -kauran ch yu ca cõy Kh sõm cho lỏ, chỳng c dựng ent -kauran trong lỏ v cnh ca Croton tonkinensis thng cú cha 3-4 thnh lm mu chun xõy dng ng chun trong phõn tớch nh lng theo phn chớnh, tu thuc vo b phn dựng (lỏ, cnh), thi im thu hỏi v ni phng phỏp LC -MS sinh trng 3.3.1... v 13C-NMR a ra cu trong hn hp etylaxetat -n-hexan cho tinh th hỡnh kim, núng chy 97- trỳc ent -7 -hydroxy-18-axetoxykaur-16-en-15-on (crotonkin-1) hon ton 980C So sỏnh cỏc c trng vt lý vi cht chun v cỏc d liu ph FT -IR phự hp vi [4] Nhng tinh th hỡnh kim ca cht ny cho ph nhiu x tia ,MS, 1H- v X rừ rng v phi cnh khụng gian ca nú nờu trong hỡnh 3.1 7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-2) Nhng... th vanilin -H2SO4 cho mu tớm 3.2.4 Ent-7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on(Crotonkin-4) T lỏ cõy C tonkinensis ó phõn lp c cht Crotonkin -4 Cỏc c trng vt lý nh giỏ tr Rf, im núng chy 210-212oC cỏc phộp ghi ph thu , khụng cho hunh quang di ỏnh sỏng t ngoi (254 nm) v cng khụng c so vi cỏc d liu ph chun [16], [17] cho phộp xỏc nh l ent -7 ,14 cú phn ng mu vi thuc th Dragendorff Kt tinh li trong hn hp a -dihydroxykaur-16-en-15-on... Lu Th Hu, Phm Hong Ngc, Phm Hu in (2006), Gúp phn nghiờn cu thnh phn ancaloit trong cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis) Tõy Thiờn -Tam o Tp chớ khoa hc Trng HSP H Ni, cỏc KHTN 2006, 4 trang 110-114 8 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc, Chu ỡnh Kớnh (2004), "Phõn lp v nhn dng mt s flavonoit -C-glucosid t cõy kh sõm cho lỏ (C tonkinensis) cú Vit nam" Tp chớ Hoỏ hc , 2004, 42 (2), 187-190 9 Phm Th Hng... http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 56 trong cõy Kh sõm cho lỏ (Croton tonkinensis) thu hỏi Ninh 16 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc (2003), "ent-(16S)-7 -hydroxy18-acetoxy kauran-15-on - mt kauran diterpen mi, phõn lp t cõy Bỡnh Hi Ngh Hoỏ hc Hu c Ton quc10 /2007, kh sõm cho lỏ Croton tonkinensis" , 10 Phm Th Hng Minh, Phm Hong Ngc, ỏi Duy Ban, Lờ Kim Xuyn, Tp chớ