Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG : MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề : Ngày nay, vấn đề khoa học công nghệ nhận quan tâm đặc biệt nhằm phát triển để đáp ứng nhu cầu ngày cao người Chính lẽ đó, người đòi hỏi khắt khe chất lượng tất sản phẩm mà họ sử dụng đời sống ngày, đặc biệt sản phẩm có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe thân họ Bởi thế, nói nhu cầu tạo nên tiền đề tác nhân trực tiếp thúc đẩy cho khoa học giới ngày phát triển Một số thành công nghệ sinh học kể đến Probiotics Theo tiếng Hy Lạp probiotics có nghĩa “dành cho sống” ứng dụng vô rộng rãi đời sống ngày người Vậy probiotics gì, nhu cầu sử dụng lại trở nên phổ biến khắp nơi giới thế? Và hiệu mà mang lại liệu có giúp ích nhiều đến việc nâng cao chất lượng sống người hay không? Quả thật, probiotics mang nhiều lợi ích khác bên cạnh : hỗ trợ việc tiêu hóa thức ăn tốt giảm rối loạn hệ đường ruột, đẩy mạnh tổng hợp vitamin B, cải thiện dung nạp lactose, cải thiện chức miễn dịch, ngăn chặn chứng viêm nhiễm, giảm cholesterol, ức chế vi khuẩn gây hại ruột Do công dụng hữu ích mà probiotics xem vấn đề cần quan tâm nghiên cứu nhiều để ứng dụng vào sống người Hiện giới có nhiều nghiên cứu probiotics thu kết đáng kể SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Hình 1.1 : Những công bố nghiên cứu probiotics theo năm [5] So với năm 90 số nghiên cứu probiotics tăng vọt lên nhiều thời gian gần (hình 1.1) Các nhà khoa học tìm hầu hết vi khuẩn lactic sử dụng phổ biến sản phẩm lên men thông thường để tạo chế phẩm probiotic chất lượng phục vụ cho người ngày : sữa chua uống Yakult, men vi sinh sống hỗ trợ điều kiện bệnh rối loạn tiêu hóa, … Không vậy, probiotics chế biến để sử dụng cho loài vật nuôi khác để ứng dụng nông nghiệp góp phần tác động cải thiện môi trường Điều hiển nhiên thực tế mức độ an toàn sinh học thiết thực probiotics vị trí đứng đầu so với phương cách khác Bởi lẽ, tác động probiotic xuất phát từ chế điều hòa tự nhiên, không gây nên sản phẩm phụ có hại hay tác động xấu đến thể sinh vật chủ Đối với vấn đề quan tâm trọn vẹn yếu tố sức khỏe môi trường nói sản phẩm hoàn hảo Một điều đáng quan tâm việc lạm dụng thái kháng sinh nuôi trồng khiến cho nhiều bất cập xảy nhà khoa học phải lên tiếng cảnh báo Mặc dù, không phủ nhận hiệu kinh tế việc sử dụng chúng : tăng suất, tăng hiệu sử dụng thức ăn, phòng bệnh, nâng cao chất lượng sản phẩm, tăng hiệu kinh tế cho người sử dụng SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Song, sử dụng kháng sinh nhiều gây việc tồn dư thể động vật, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người tiêu dùng Ngoài ra, phối trộn với lượng nhỏ không quy cách, dẫn đến hậu nghiêm trọng vô tình làm tăng thêm tượng kháng kháng sinh loài vi khuẩn gây bệnh người vật nuôi Và điều dẫn đến kết tai hại có dịch bệnh rộng lớn toàn cầu kiểm soát tương lai Ở Việt Nam, chế phẩm probiotic dần trở nên phổ biến, đa phần sử dụng chăn nuôi gia cầm bắt đầu sử dụng cho loài thủy hải sản Bên cạnh chế phẩm dược giúp hỗ trợ rối loạn tiêu hóa hệ đường ruột phù hợp cho đối tượng khác Các nghiên cứu probiotic quan tâm tìm hiểu dựa thành tựu nước giới đạt nhằm phục vụ cho nhu cầu ngày cao Tóm lại, nói rằng, việc nghiên cứu để phát triển ứng dụng probiotics vào sống vấn đề cần quan tâm đầu tư nhiều để ngày nâng cao hiệu quả, tính an toàn chất lượng sống ngày cao người Bởi xem tác động thân hữu người vào tự nhiên mở chiến lược phát triển bền vững an toàn Tuy nhiên, để có chế phẩm probiotic thỏa mãn tất yêu cầu đặt với hoạt tính cao cần thiết, định phải kể đến trình chọn lọc chủng vi khuẩn để làm probiotic Đây bước quan trọng, xem yếu tố định vai trò, tác dụng chế phẩm probiotic lên đối tượng cần quan tâm Một chủng vi khuẩn có xem có khả làm probiotics hay không phụ thuộc vào kết khâu tuyển chọn Do mà chọn đề tài đồ án tốt nghiệp nhan đề “Tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic có tiềm probiotics” SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH 1.2 GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Mục tiêu đồ án tốt nghiệp : Tuyển chọn chủng tiềm probiotics sưu tập vi khuẩn lên men lactic phân lập từ chế phẩm probiotic dược, thực phẩm lên men truyền thống (nem, sữa, dưa muối) hệ vi sinh đường ruột người theo tiêu chuẩn khả kháng vi sinh vật, chịu acid chịu muối mật 1.3 Nội dung đồ án tốt nghiệp : _Tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men lactic có khả chịu acid _Tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men lactic có khả chịu muối mật _Tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men lactic có khả kháng vi sinh vật thị (Bacillus substilis, Escherichia coli, Salmonella spp., Pseudomonas spp.) _Đề xuất hướng sử dụng chủng vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính 1.4 Phương pháp thực đồ án tốt nghiệp : Qua nhiều tài liệu tham khảo báo cáo nghiên cứu khoa học probiotics, phương pháp tuyển chọn vi khuẩn probiotic tiến hành dựa kết kiểm tra nhà nghiên cứu cách chi tiết Cho nên, từ nguồn thông tin bắt đầu tiến hành thí nghiệm chủng phân lập sưu tập vi khuẩn lên men lactic Cuối thu nhận số liệu, dựng đồ thị để phân tích đánh giá chủng vi khuẩn đưa kết luận cuối 1.5 Phương pháp xử lý số liệu : Sử dụng phần mềm excel tính toán vẽ đồ thị biểu diễn 1.6 Ý nghĩa khoa học thực tiễn : _Tìm hiểu phương pháp tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic _Góp phần chọn lọc chủng vi khuẩn lên men lactic có tiềm probiotics SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Probiotics : 2.1.1 Giới thiệu chung : Kể từ Alexander Fleming phát tính chất kháng vi khuẩn nấm Penicillium spp vào năm 1929 (Fleming, 1929), giới chứng kiến ưu nhanh chóng thuốc kháng sinh điều trị bệnh khác Sự phát triển cách rộng rãi đặc hiệu cao thuốc kháng sinh khiến cho ngành y học tin tưởng vào phương pháp trị liệu kháng sinh đại diện cho phương pháp chữa trị chống lại bệnh khác Tuy nhiên, tồn số hạn chế định liên quan với phương pháp trị liệu kháng sinh Tác động loại bỏ thuốc kháng sinh không phân biệt mầm bệnh thật hệ vi sinh vật có lợi ruột Vì vậy, phương pháp trị liệu kháng sinh dẫn đến thay đổi hệ cân ruột gây vài ảnh hưởng xấu mà tồn lâu dài sau ngừng sử dụng cách điều trị Bên cạnh đó, xuất nhanh nhiều chủng vi khuẩn kháng lại kháng sinh chẳng hạn Enteroccus spp kháng vancomycin Staphylococcus aureus kháng methicillin môi trường bệnh viện mối quan tâm ngày tăng người làm việc nghề y Hơn nữa, vài bệnh lây nhiễm cho sẵn sàng xử lý với thuốc kháng sinh bị công nhận mối đe dọa sức khỏe nghiêm trọng Ví dụ, bệnh tiêu chảy Clostridium difficile, mầm bệnh hội, hoạt động có cân hệ vi sinh vật ruột thông thường diễn suốt trình điều trị kháng sinh Mặc dù bệnh nói chung điều trị thành công với loại thuốc kháng sinh thứ hai, nhiên vài bệnh lây nhiễm tái diễn mặc cho phương pháp trị liệu kháng sinh (Sanders, 1999) Chính nguyên nhân này, người nhận ngăn ngừa giảm nguy bị bệnh thích hợp để đến lúc phải điều trị bệnh Thực SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương tế, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo toàn cầu giảm việc sử dụng thuốc kháng sinh y học đề xuất nỗ lực để ngăn cản bệnh thông qua phát triển vắc xin có hiệu an toàn (Stanton et al., 2001) Một môi trường chung tạo mà bác sĩ lẫn bệnh nhân tìm kiếm biện pháp phòng ngừa chữa bệnh, để hệ vi sinh vật ruột thể người không bị ảnh hưởng xấu Và cách tiếp cận nhanh chóng đạt công nhận khái niệm probiotics, khái niệm chung phần bổ sung dinh dưỡng chứa nhiều chủng vi sinh vật (đặc biệt vi khuẩn nấm men) mà đưa vào thể người có tác động có lợi việc cải thiện hệ vi sinh vật nội sinh (Markowitz Bengmark, 2002) So với nhược điểm đắt, tính hóa học xâm hại ruột thuốc kháng sinh, ưu điểm probiotics an toàn, không đắt, tự nhiên, phần lớn ảnh hưởng có hại Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe người Trên hàng nghìn năm trước, lâu trước có tìm thuốc kháng sinh, người biết tiêu thụ thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi chẳng hạn sản phẩm sữa lên men Các chứng cho thấy trình sản xuất sữa lên men ghi “Book of Genesis” Theo Ayurveda, số ngành y học lâu đời vào khoảng 2500 năm trước công nguyên, tiêu thụ sữa chua (một sản phẩm sữa lên men) ủng hộ để trì sức khỏe tốt (Chopra Doiphode, 2002) Các nhà khoa học đầu tiên, Hippocrates người khác định sữa lên men với tính chất dinh dưỡng thuốc nó, để chữa trị rối loạn ruột dày (Oberman, 1985) Một giải thích khoa học cho ảnh hưởng có lợi vi khuẩn lactic có sữa lên men cung cấp lần vào năm 1907 người đoạt Giải Nobel, nhà sinh lý học người Nga, Eli Metchnikoff Trong thảo luận xuất sắc ông " Việc kéo dài sống " (‘The prolongation of life’), Metchnikoff tuyên bố "Sự phụ thuộc hệ vi sinh vật ruột thực phẩm làm SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương cho có khả chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh vật người chúng ta, tức thay vi sinh vật có hại vi sinh vật hữu ích (Metchnikoff, 1907 " Người ta đề xuất tiêu hóa vài vi khuẩn chọn lựa có ích lợi ảnh hưởng đến vùng dày-ruột người Metchnikoff tin vào lý gây trình lão hóa người chất độc tạo thành thối rữa lên men ruột (O ' Sullivan et al., 1992 ) Và nhận thấy trình lên men lactic sản phẩm sữa ngăn chặn thối rữa, ông ta tin tiêu thụ sản phẩm sữa lên men tương tự với việc ngăn chặn lại trình thối rữa ruột Metchnikoff đưa giả thuyết sống khoẻ mạnh lâu dài nông dân Bungari tiêu thụ sản phẩm sữa lên men Ông tin tiêu thụ, vi khuẩn lên men sản phẩm ảnh hưởng tốt đến hệ vi sinh vật ruột kết: giảm hoạt động vi khuẩn độc, cách dẫn đến sống thọ Điều khiến cho Metchnikoff khuyên sách ông uống đồ uống chẳng hạn sữa chua chứa vi khuẩn lactic ngăn cản lão hóa Ngoài ra, thời gian, Henry Tissier phân lập Bifidobacteria, thành viên nhóm vi khuẩn lactic, từ phân trẻ nuôi sữa mẹ nhận thấy chúng thành phần bật hệ vi sinh vật ruột (Ishibashi Shimamura, 1993) Tissier tin thống trị Bifidobacteria thể trẻ chiếm chỗ vi khuẩn thối rữa liên quan đến xáo trộn dày tự thành lập chúng để chiếm chỗ vi khuẩn có ích ruột Như tương tự Metchnikoff, Tissier tin vào giả thuyết ảnh hưởng lớn Bifidobacteria tới số trẻ em này(O ' Sullivan et al., 1992) Lý thuyết ông khẳng định quan sát lâm sàng trẻ nuôi sữa mẹ so với trẻ nuôi sữa hộp (Rasic Kurmann, 1983) Mặc cho diễn Thế chiến I chết Metchnikoff làm giảm nhẹ lượng tiền quan tâm tới liệu pháp diệt khuẩn ông ấy, tảng cho khái niệm đại probiotics rõ ràng thành lập Nghiên cứu việc sử SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương dụng vi khuẩn lactic chế độ ăn uống tiếp tục suốt kỷ vừa qua Trong công việc giai đoạn trước kỷ đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột, nghiên cứu gần tập trung vào lợi ích sức khỏe khác vi sinh vật bảo đảm sống sót vi khuẩn vùng dày-ruột loại thực phẩm để vận chuyện chúng vào thể người (Lourens - Hattingh Viljoen, 2001) Các kiến thức có probiotics thông qua nghiên cứu thúc đẩy mạnh mẽ ngành công nghiệp sản phẩm sữa Từ quan sát từ sớm Eli Metchnikoff nhà nghiên cứu khác, lịch sử probiotics với sản phẩm sữa lên men tiếp tục tận đại Điều hiển nhiên thấy rõ qua thực tế ngày hôm thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ tồn 2.1.1.1 Định nghĩa Probiotics : Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa “cho sống” Tuy nhiên, định nghĩa probiotics phát triển nhiều theo thời gian Lily Stillwell (1965) mô tả trước tiên probiotics hỗn hợp tạo thành động vật nguyên sinh mà thúc đẩy phát triển đối tượng khác Phạm vi định nghĩa mở rộng Sperti vào đầu năm bảy mươi bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật (Gomes Malcata, 1999) Sau đó, Parker (1974) áp dụng khái niệm phần thức ăn gia súc có ảnh hưởng tốt thể vật chủ việc góp phần vào cân hệ vi sinh vật ruột Vì vậy, khái niệm “probiotics” ứng dụng để mô tả “cơ quan chất mà góp phần vào cân hệ vi sinh vật ruột” Định nghĩa chung sau làm cho xác Fuller (1989), ông định nghĩa probiotics “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ việc cải thiện cân hệ vi sinh vật ruột nó” Khái niệm sau phát triển xa : “vi sinh vật sống SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương (vi khuẩn lactic vi khuẩn khác, nấm men trạng thái khô hay bổ sung thực phẩm lên men) mà thể ảnh hưởng có lợi sức khỏe vật chủ sau tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có vật chủ” ( Havenaar Huis in't Veld, 1992 ) Tuy nhiên, nghiên cứu gần chứng minh vùng ruột thật hệ sinh thái vi sinh vật người trưởng thành (Tannock, 1990); phương pháp trị liệu kháng sinh, bệnh tật thay đổi chế độ ăn dẫn đến thay đổi hệ sinh thái này, trạng thái cân dường có khả tự hiệu chỉnh (annock, 1983) Vi khuẩn probiotic tiêu thụ với số lượng lớn không đủ để trở thành chủng chiếm ưu ruột phát mẫu ruột phân sau hay hai tuần sau tiêu hóa Do đó, quan trọng phải hiểu thực tế ảnh hưởng probiotic đem lại kết hợp cấu hoạt động thân thiết tạm thời so với hệ vi sinh vật người (Sanders, 1999) Vì vậy, định nghĩa probiotics “vi sinh vật sống mà ngang qua vùng ruột làm lợi cho sức khỏe người tiêu dùng” (Tannock et al., 2000) 2.1.1.2 Hiệu sử dụng probiotic : Do nhiều yếu tố, phần lớn lượng vi sinh vật có lợi đường ruột bị giảm hay bị tiêu diệt bị tiêu chảy, sử dụng kháng sinh chữa bệnh, điều ảnh hưởng trực tiếp đến khả hoạt động hệ tiêu hóa thủy phân đường lactoza sữa, giảm khả hấp thụ thức ăn giảm tính đề kháng thể Chính lẽ mà thể cần phải bổ sung thêm lượng đủ lớn sinh khối vi khuẩn có lợi nhằm cải thiện sức khỏe SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Hình 2.1 : Tác dụng probiotics Đã có nhiều chế phẩm probiotics dành cho người hay cho vật nuôi đăng kí bảo hộ sáng chế Hầu hết sản phẩm chứa Lactobicillus spp Streptococcus spp., số chứa Bifidobacteria spp., Saccharomyces boulardii hay Bacillus subtilis Ảnh hưởng chế phẩm probiotics trực tiếp gián tiếp thông qua điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột (Hình 2.1) Những chế phẩm có hiệu sử dụng biết tới sau : a Có khả kháng ung thư chống yếu tố đột biến : Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn probiotic làm giảm nguy ung thư ruột kết ung thư bàng quang Ngoài có tác dụng khử chất độc gây ung thư có thể làm chậm phát triển khối u bướu Cơ chế nghiên cứu kết luận : Nhờ gắn kết phân hủy chất gây ung thư Sản xuất hợp chất kháng ung thư : sinh acid yếu có lợi cho đường ruột acid butyric có vai trò giảm tạo chất gây ung thư đường ruột kích thích tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương mau lành hồi phục chức SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 10 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Kiểm tra khả chịu acid vi khuẩn probiotics : Các chủng vi khuẩn lên men lactic sử dụng thí nghiệm lấy từ nguồn Thứ giống S1a, C1, N3, T1a T8 anh chị khóa 05DSH phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống (như cà muối, nem, sữa chua) chế phẩm dược Chúng khảo sát tính đối kháng với vi sinh vật thị E.coli, sau kết luận giống có phần trăm ức chế vi sinh vật thị nhiều có hoạt tính cao so với vi khuẩn lên men lactic lại Kết thúc thí nghiệm năm trước cho thấy giống chống lại E.coli chưa thử nghiệm khả chịu acid hay muối mật yếu tố quan trọng mặt kỹ thuật vi khuẩn có tiềm probiotics Bổ sung thêm với giống vi khuẩn giống E2, N8 Y1 vừa phân lập từ hệ vi sinh đường ruột, sữa chua uống Yakult nem chua Cả chủng thử nghiệm tính đối kháng với loài vi sinh vật thị E.coli Salmonella spp, kết cho thấy khả đối kháng chủng mạnh có tiềm làm probiotic Khả chịu acid đánh giá qua việc khảo sát lượng sinh khối chủng vi khuẩn lactic nồng độ pH 2, 3, 4, Đây tiêu chuẩn quan trọng vi khuẩn tiềm probiotics Do pH dày, đường tiêu hóa thể môi trường acid, nên bắt buộc chúng phải có khả chịu đựng điều kiện phát huy tác dụng có lợi Bởi lẽ đó, đánh giá cần tiến hành trước công nhận chủng vi khuẩn sử dụng probiotic Tuy nhiên, tiến hành thực phương pháp gặp phải số khó khăn : _Quá trình đo pH cần phải thực xác tuyệt đối, sai khác gây ảnh hưởng sai khác khảo sát mật độ Trong lúc tiến hành, cố máy đo pH bị hư nên giá trị pH mang tính tương đối SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 43 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương _Sử dụng pipet 1ml hút lấy dịch tế bào vi khuẩn probiotic cho vào ống nghiệm có nguy bị nhiễm cao, đồng thời dịch hút không trộn hoàn toàn sinh khối khiến cho mật độ tế bào cho vào ống nghiệm không giống cách xác _Đem ủ 24h, 370C, điều kiện kị khí, thời gian nhiệt độ cần đảm bảo kết sai số _Ly tâm 4000 vòng/ phút thu cặn sinh khối Nếu không cẩn thận hút phần sinh khối lúc loại bỏ dịch môi trường MRS, hút chưa hết môi trường gây nên khác biệt hai thí nghiệm tiến hành đo quang Lượng sinh khối thu lại đủ ban đầu mà mang tính tương đối đọng lại phần ống ly tâm _Nếu không làm hòa tan dịch sinh khối nước muối sinh lý trước đo quang kết xác mong muốn _Cần tiến hành trải đĩa nồng độ pha loãng khác để đếm tính mật độ tế bào vi khuẩn probiotic từ dịch gốc ban đầu Bước tiến hành dễ bị nhiễm vi sinh vật khác đòi hỏi thực nhiều lần để có kết Kết kiểm tra khả chịu acid chủng (bảng 4.1) Bảng 4.1 : Tỉ lệ sống sót vi khuẩn LAB Tỉ lệ sống sót (%) = (ODTN/ODĐC)×100 Giống pH pH pH pH S1a 14 16 69 81 C1 17 19 54 73 N3 21 49 82 93 T1a 26 29 70 92 T8 21 34 80 90 E2 34 45 53 97 N8 34 42 76 94 Y1 26 30 64 88 SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 44 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Đồ thị 4.1 : Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng giống S1a Đồ thị 4.2 : Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng giống C1 SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 45 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Đồ thị 4.3 : Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng giống N3 Đồ thị 4.4 : Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng giống T1a SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 46 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Đồ thị 4.5 : Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng giống T8 Đồ thị 4.6 : Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng giống E2 SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 47 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Đồ thị 4.7 : Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng giống N8 Đồ thị 4.8 : Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng giống Y1 Để xây dựng đồ thị trước tiên cần phải xác định mật độ sinh khối tế bào vi khuẩn lên men lactic 1ml dịch môi trường nuôi cấy ban đầu Bằng cách pha loãng nồng độ sinh khối đo OD bước sóng 610nm để xây dựng đường chuẩn tiến hành trải đĩa đếm khuẩn lạc, tính toán có CFU/ml tế bào dịch nuôi vi khuẩn ban đầu Sau thay giá trị OD tương ứng đo vào phương trình tính toán Excel tìm xác số tế bào vi khuẩn nồng độ pH khác SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 48 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Tính toán tỉ lệ sống sót cách lấy giá trị OD đo pH 2, 3, 4, chia cho giá trị OD ống đối chứng tiến hành dựng đồ thị Biện luận : Những chủng phân lập có khả chịu môi trường có nồng độ pH thấp đường tiêu hóa Trong tỉ lệ sống sót chủng N3 N8 phân lập từ nem chua (đồ thị 4.3, đồ thị 4.7), T8 phân lập từ thuốc Ybio (đồ thị 4.5) T1a phần lập từ thuốc Biolactyl (đồ thị 4.4), E2 phân lập từ phân trẻ sơ sinh (đồ thị 4.6), Y1 phân lập từ sữa chua Yakult (đồ thị 4.8) thể chúng có khả chịu acid tốt Khi tiến hành nuôi cấy điều kiện pH 2, tỉ lệ phần trăm sống sót chủng (bảng 4.1) thể rõ điều Phần trăm cao thuộc hai giống vi khuẩn phân lập từ hệ vi sinh đường ruột trẻ em E2 từ nem chua Lai Vung N8 với khả sống sót sau thời gian nuôi cấy 24h 370C 34% (bảng 4.1) Những giống từ sữa chua Y1 26%, chế phẩm dược T8 21% T1a 26%, cuối nem chua Ninh Hòa N3 với 21% (bảng 4.1) Từ [2] [3], nghiên cứu tiến hành điều kiện 105 phút 370C thu kết cao, tỉ lệ sống sót vi khuẩn LAB đem thử nghiệm thời gian từ 90% trở lên Vấn đề khác biệt kết biện luận khác biệt thời gian nuôi cấy điều kiện pH thấp Ở thí nghiệm khảo sát khả chịu acid vi khuẩn lactic từ sưu tập giống trường, chọn hẳn điều kiện môi trường nuôi cấy LAB pH thấp để đánh giá sống sót chúng Chính vậy, kết thu nhận định chủng vi khuẩn lactic có tỉ lệ sống sót cao sưu tập điều kiện nuôi cấy chắn có khả chịu điều kiện acid dày vào đường tiêu hóa thức ăn thể vật chủ Và tiếp tục kiểm tra hoạt tính khác để đánh giá tiềm probiotics chúng, đồng thời nên tiến hành thí nghiệm khảo sát khả chịu acid SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 49 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương với thời gian ngắn để phù hợp với thời gian tồn vi khuẩn lactic trình tiêu hóa thể vật chủ 4.2 Kiểm tra khả chịu muối mật vi khuẩn probiotics : Tương tự thí nghiệm kiểm tra khả chịu acid, khả chịu muối mật tiêu chuẩn cần quan tâm vi khuẩn probiotic phân lập Hệ tiêu hóa vốn cần có muối mật để nhũ tương hóa, hòa tan lipid trở nên dễ hấp thu Chính lẽ đó, khả chịu đựng nồng độ pH thấp, vi khuẩn probiotic phải có khả chịu nồng độ muối mật định hệ đường ruột Cả hai yếu tố mang tính quan trọng Xác định phần trăm ức chế chủng tính toán tỉ lệ sống sót tương tự cách làm thí nghiệm khả chịu acid Vấn đề khó khăn trình tiến hành tương tự thử nghiệm chịu acid : _Sử dụng pipet 1ml hút lấy dịch tế bào vi khuẩn probiotic cho vào ống nghiệm có nguy bị nhiễm cao, đồng thời dịch hút không trộn hoàn toàn sinh khối khiến cho mật độ tế bào cho vào ống nghiệm không giống cách xác _ Đem ủ 24h, 370C, điều kiện kị khí, thời gian nhiệt độ cần đảm bảo kết sai số _Ly tâm 4000 vòng/ phút thu cặn sinh khối Nếu không cẩn thận hút phần sinh khối lúc loại bỏ dịch môi trường MRS, hút chưa hết môi trường gây nên khác biệt hai thí nghiệm tiến hành đo quang Lượng sinh khối thu lại đủ ban đầu mà mang tính tương đối đọng lại phần ống ly tâm _Nếu không làm hòa tan dịch sinh khối nước muối sinh lý trước đo quang kết xác mong muốn Kết kiểm tra khả chịu muối mật chủng sau : SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 50 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Bảng 4.2 : Giá trị OD khảo sát khả chịu muối mật vi khuẩn LAB : Giống Tỉ lệ sống sót (%)= (ODTN/ODĐC)×100 S1a 21,2 C1 17,1 N3 54,2 T1a 12,7 T8 42,9 E2 56,6 N8 54,4 Y1 28,9 Phương pháp cần tiến hành nuôi cấy để thu lấy dịch sinh khối tế bào cách ly tâm 4000 vòng thời gian 15 phút Sau thay dịch môi trường bỏ nước muối sinh lý, trộn sinh khối lên tiến hành đo OD bước sóng 610nm thu nhận kết Biện luận : Bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ sống sót môi trường nuôi cấy MRS có bổ sung muối mật sau 24h 370C cao chủng E2 phân lập từ hệ vi sinh đường ruột người với 56,6% Hai chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua N3 N8 có tỉ lệ sống sót khoảng 54% Cuối chủng phân lập từ chế phẩm dược Ybio đạt 43% Theo nghiên cứu Jacobsen et al [102] [1] thí nghiệm tiến hành cách sử dụng môi trường MRS Broth bổ sung 0,3% muối mật_là mức chịu đựng nằm giới hạn cho phép đa số chủng vi khuẩn lactic để khảo sát khả chịu đựng chủng vi khuẩn tiềm probiotics khác Từ [1] nhận thấy đa số chủng vi khuẩn lên men lactic sinh trưởng chậm ngừng sinh trưởng điều kiện Tuy nhiên, kết SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 51 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương cho biết xác tỉ lệ sống sót vi khuẩn lactic để so sánh với kết thử nghiệm Do đó, với tỉ lệ phần trăm sống sót thí nghiệm kiểm tra khả chịu muối mật, kết luận chủng vi khuẩn LAB sống sót điều kiện tối thiểu 0,3% muối mật dựa nghiên cứu khảo sát [1] có tiềm probiotic Tóm lại, chủng N3 N8 phân lập từ sản phẩm nem chua, E2 từ hệ vi sinh vật đường ruột trẻ em, T1a T8 từ chế phẩm dược Y1 từ sữa chua Yakult chịu đựng tốt điều kiện acid thấp bổ sung 0,3% muối mật 4.3 Kiểm tra khả đối kháng phương pháp Turbidometry (đo độ đục): Thí nghiệm thực hai nghiệm thức : Nghiệm thức : xác định hoạt tính dựa ức chế vi khuẩn thị E.coli, Salmonella, B.subtilis Pseudomonas chất sinh trình phát triển chủng LAB Nghiệm thức : xác định hoạt tính dựa ức chế vi khuẩn thị E.coli, Salmonella, B.subtilis Pseudomonas chất sinh trình phát triển chủng LAB loại bỏ yếu tố acid lactic cách trung hòa với dung dịch NaOH Sử dụng vi khuẩn E.coli, Salmonella, B.subtilis Pseudomonas nuôi cấy qua 21h, pha loãng 10-2, nồng độ 105 tế bào/ml môi trường NaOH 1N để trung hòa acid Sau 24h nuôi cấy thực với hai nghiệm thức trên, đem ống nghiệm đo OD bước sóng 610nm Công thức tính : % ức chế = (1- ODTN/ODĐC)×100 Với : ODTN : giá trị đo OD mẫu chứa dịch nuôi cấy LAB ly tâm ODĐC : giá trị đo OD ống đối chứng thay dịch nuôi cấy LAB ly tâm môi trường MRS Kết thí nghiệm sau : SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 52 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Bảng 4.3 : Kết kiểm tra khả đối kháng vi sinh vật thị (% ức chế) thí nghiệm không trung hòa Vi sinh vật thị (% ức chế ức chế = (1- ODTN/ODĐC)×100) Giống E.coli Salmonella B.subtilis Pseudomonas S1a 26 39 38 61 C1 69 67 94 100 N3 90 87 100 100 T1a 86 87 99 100 T8 89 87 100 100 E2 67 86 N8 79 73 Y1 95 97 Bảng 4.4 : Kết kiểm tra khả đối kháng vi sinh vật thị (% ức chế) thí nghiệm trung hòa Vi sinh vật thị (% ức chế ức chế = (1- OD/ODĐC)×100) Giống E.coli Salmonella B.subtilis Pseudomonas S1a 12 C1 18 33 N3 38 12 30 35 T1a 25 12 31 T8 39 12 46 55 E2 47 26 N8 39 31 Y1 34 SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 53 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Đồ thị 4.9 : Phần trăm ức chế vi khuẩn E.coli chủng vi khuẩn lactic Đồ thị 4.10 : Phần trăm ức chế vi khuẩn Salmonella chủng vi khuẩn lactic SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 54 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Đồ thị 4.11 : Phần trăm ức chế vi khuẩn B.subtilis chủng vi khuẩn lactic Đồ thị 4.12 : Phần trăm ức chế vi khuẩn Pseudomonas chủng vi khuẩn lactic Biện luận : Đối với thí nghiệm không trung hòa, khả ức chế cao (bảng 4.3) Các vi khuẩn LAB phân lập từ chế phẩm dược T1a T8 lên đến 85% vi sinh vật thị E.coli Salmonella spp., ức chế hoàn toàn sinh trưởng B.subtilis Pseudomonas spp (bảng 4.3) Giống N3 phân lập từ nem chua có phần trăm ức chế gần 90% E.coli Salmonella spp., ức chế hoàn toàn sinh trưởng B.subtilis Pseudomonas spp (bảng 4.3) Những chủng mặt đối kháng E.coli có giảm so với kết đề tài nghiên SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 55 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương cứu trước không đáng kể, điều sai số trình thí nghiệm Giống Y1 phân lập từ sữa chua Yakult thử nghiệm đối kháng với E.coli Salmonella spp thu kết cao 95% 97% (bảng 4.3) Đối với thí nghiệm không trung hòa lại có chênh lệch lớn phần trăm ức chế vi sinh vật thị Khả ức chế cao chủng E2 phân lập từ hệ vi sinh đường ruột người E.coli Salmonella spp (chưa thử nghiệm với B.subtilis Pseudomonas spp.) 47% 26% (bảng 4.4) T8 vi khuẩn LAB phân lập từ chế phẩm dược ức chế vi khuẩn B.subtilis 46% Pseudomonas spp 55%, cao tất chủng (bảng 4.4) Qua đồ thị 4.9, 4.10, 4.11, 4.12 biểu diễn phần trăm ức chế vi sinh vật thị E.coli Salmonella spp., B.subtilis Pseudomonas spp chủng vi khuẩn LAB, nhận thấy có khác biệt đáng kể thử nghiệm trung hòa không trung hòa Điều nhận định chủng vi khuẩn lactic ức chế chủ yếu nhờ vào có mặt acid lactic sinh dịch nuôi cấy với môi trường có pH thấp Đối với chất lại bacteriocins, H2O2, diacetyl tham gia vào hoạt động ức chế vi sinh vật thị Vì thế, muốn xác định xác khả chất đặc biệt bacteriocins vi khuẩn lactic cần có thử nghiệm khác nghiên cứu riêng chi tiết Thử nghiệm tính đối kháng chủng lên men lactic có tiềm probiotics chứng minh khả ức chế phổ rộng chúng không vi khuẩn Gram dương mà vi khuẩn Gram âm hoàn toàn có thực tiến hành khảo sát (bảng 4.3 bảng 4.4) Trong tài liệu thường nhắc nhiều đến vi khuẩn Gram dương đa phần vi sinh vật gây bệnh hệ tiêu hóa sử dụng thử nghiệm E.coli, Salmonella Pseudomonas vi khuẩn Gram âm Chính lẽ đó, làm đa dạng phong phú cho tính đối kháng vi khuẩn lactic phân lập sưu tập phòng thí nghiệm thay dựa vi khuẩn E.coli báo cáo trước SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 56 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận : _Các chủng N3 N8 phân lập từ sản phẩm nem chua, E2 từ hệ vi sinh vật đường ruột trẻ em, T1a T8 từ chế phẩm dược Y1 từ sữa chua Yakult chịu đựng tốt điều kiện acid thấp bổ sung 0,3% muối mật (bảng 4.2) _Chủng E2, T8, N3 N8 có khả ức chế cao tất vi sinh vật thị E.coli Salmonella spp., B.subtilis Pseudomonas spp thí nghiệm không trung hòa trung hòa, chứng tỏ họat tính kháng khuẩn bao gồm acid hữu sinh thành phần phi acid, bacteriocin _ Đề nghị tiếp tục nghiên cứu sử dụng chủng chế phẩm probiotics 5.2 Kiến nghị : _Tiếp tục khảo sát khả chịu acid muối mật vi khuẩn lên men lactic có tiềm probiotics sưu tập cách mở rộng liều khoảng thí nghiệm ủ khoảng thời gian khác phù hợp với điều kiện bên thể vật chủ _Tiến hành thử nghiệm phương pháp điều kiện in vivo để có kết từ thực tế với quy mô lớn _Kết thúc thử nghiệm tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men lactic có tiềm probiotics đánh giá tìm chủng hoàn thiện nhất, cần định danh chủng đề xuất hướng sử dụng phù hợp chủng vi khuẩn lactic từ sưu tập dựa vào kết cao thu từ thử nghiệm tiến hành SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 57 [...]... khảo sát sự ức chế của vi khuẩn probiotics đối với chúng 2.3.3 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn : 2.3.3.1 Bacteriocins : Bacteriocins là những hợp chất có bản chất là protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocins, trong đó các vi khuẩn lactic (LAB) được quan... lâu hơn và do đó có điều kiện để biểu hiện những tác động điều hòa miễn dịch hơn là những chủng không có khả năng bám dính _Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng _Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây vi m _Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối kháng với các vi sinh gây bệnh, đặc biệt là vi sinh vật gây... để tuyển chọn làm probiotics, vì thế danh sách vi sinh vật chỉ thị được bổ sung bao gồm cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn Gram SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên MSSV: 106111040 Trang 35 Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương âm ngòai Escherichia coli còn thêm các vi khuẩn gây bệnh khác là Salmonella spp và Pseudomonas spp Từ đó đề xuất hướng ứng dụng cho các vi khuẩn. .. người; đồng thời chúng phải có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để probiotics có thể sống sót được khi đi qua ruột non) _Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ : khả năng bám vào bề mặt và sau đó là phát triển trong đường tiêu hóa người được xem là điều kiện tiên quyết quyết định chức năng của probiotics Những vi khuẩn có khả năng bám dính vào bề mặt ruột... phương pháp trong vi c kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của vi khuẩn probiotics Tuy nhiên, tất cả đều dựa trên khả năng sinh kháng sinh hay các chất cạnh tranh để ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh Ở thí nghiệm này phương pháp được sử dụng là đo độ đục (Turbidometry) Nguyên tắc là ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn chỉ thị bằng các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn probiotics Trong... khỏe con người chúng phải có những đặc điểm sau : _Chủng vi sinh phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để có thể đưa vào sản xuất, dễ nuôi cấy _Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm _Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm _Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng, để tồn tại được chúng phải có hai đặc tính là: có khả năng dung nạp với acid (chịu... 05_lớp 05DSH_khoa Môi trường & Công nghệ sinh học_trường ĐHKTCN TPHCM Và do sinh vi n Dương Thúy Vy lớp 06DSH đã phân lập được từ đề tài : “Xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic ” Vi khuẩn E.coli được cung cấp từ ĐH Y dược TPHCM Vi khuẩn Salmolnella spp được cung cấp từ Vi n Pasteur TPHCM Vi khuẩn B subtilis và Pseudomonas spp được cung cấp từ ĐH KHTN TPHCM Các chủng... MT-CNSH, HUTECH, các chủng có hoạt tính kháng E coli cực đại được chọn để tiến hành kiểm tra tính chịu acid và chịu muối mật Khả năng chịu muối mật và acid quyết định vi c vi khuẩn có họat tín kháng vi sinh vật có được sử dụng trong chế phẩm probiotics trực tiếp hay không hay cần có biện pháp kỹ thuật thích hợp vậ chuyể chúng đến nơi họat động là đường ruột Hoạt tính kháng vi sinh vật phổ rộng của một... nhận biết được nhưng không phải từ acid lactic) ở điều kiện in vitro có khả năng ức chế rộng vi khuẩn gây bệnh Gram dương như là S.aureus, L.monocytogenes, Bacillus cereus, Clostridium,… Tuy nhiên, sự ức chế của vi khuẩn lactic và Bifidobacteria là không thể xóa bỏ 2.3.2 Thử nghiệm trên vi khuẩn Gram âm : Đa số các nghiên cứu về hoạt tính đối kháng dựa trên các vi sinh vật gây bệnh Gram dương như S.aureus,... động của probiotics đến hệ vi sinh vật đường ruột như sau : _Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh _Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính của chúng vào đường ruột Vị trí nào được các vi khuẩn probiotics gắn kết thì các độc tố đường ruột bị ngăn chặn _Vi khuẩn probiotics tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương Những hợp chất này có thể làm