CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành nuôi trồng thủy hải sản giới có từ lâu ngành nuôi trồng thủy hải sản theo hướng đại thực đời từ năm 1930, thật bùng nổ từ năm 80 tôm giống sản xuất với số lượng lớn cung cấp cho người nuôi Hiện nhiều nơi giới, ngành nuôi trồng thủy sản bị gây trở ngại nạn dịch bệnh lây lan khắp nơi Các dịch bệnh thường xảy thủy hải sản bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh còi,… tôm nuôi, bệnh xuất huyết virus, bệnh Indivirus,… cá, bệnh nhóm Vibrio sp., nấm…gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thủy hải sản Một tác nhân gây bệnh đáng quan tâm bệnh nhóm vi khuẩn Vibrio sp gây cho động vật thủy hải sản (tôm, cá) Chúng gây bệnh qua tất giai đoạn động vật thủy sản xem nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng giống thủy hải sản Nhiều trường hợp nhiễm bệnh phát Australia, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan nhiều loài thủy hải sản khác Các giảm sút gần ngành nuôi trồng thủy hải sản Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines Trung Quốc chủ yếu tác động nhóm vi khuẩn Vibrio sp Động vật thủy sản nhiễm bệnh vi khuẩn Vibrio sp thường có dấu hiệu biến ăn, bơi yếu, xuất vùng thoái hóa mô gan Mật độ thả nuôi cao, thức ăn giàu protein, môi trường ương trứng mức thuận lợi tạo môi trường lý tưởng cho Vibrio sp gây tỷ lệ chết cao lên đến 100% Xuất phát từ thực trạng trên, chấp nhận Khoa Môi Trường Công Nghệ Sinh Học, tiến hành thực đề tài “Tìm hiểu Vibrio sp gây bệnh thủy sản” 1.2 NỘI DUNG TÌM HIỀU Giới thiệu nhóm Vibrio sp gây bệnh nuôi trồng thủy hải sản, tìm hiểu chế gây bệnh, phương pháp chuẩn đoán phương pháp phòng ngừa, điều trị -1- CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 TÌNH HÌNH NUÔI TRỒNG THỦY HẢI SẢN TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM 2.1.1 Trên giới Lịch sử nghề nuôi trồng thủy sản giới khoảng 500 năm trước công nguyên Trung Quốc với loài cá nuôi cá chép (Cyprinus carpio) Hình thức sơ khai thu cá giống từ sông để ương nuôi ao vùng nước Nghề nuôi cá chép sau lan rộng nhiều nơi Châu Á, Trung Đông Châu Âu di dân người Hoa Tuy nhiên, vào kỷ thứ sau công nguyên, cá Chép không phép nuôi Trung Quốc, loài loài cá chép Trung Quốc (cá trắm cỏ, cá mè hoa, mè trắng) bắt đầu phát triển ương nuôi Ở Ấn Độ, loài cá trôi Ấn Độ ương nuôi từ kỷ 11 Trong đó, loài cá nước lợ nuôi loài cá Măng (Chanos chanos) vào kỷ 15 Indonesia Ở Việt Nam, nghề nuôi thủy sản truyền thống năm 1960 Sự phát triển nhanh chóng nghề nuôi thủy sản năm thập niên 1970 Đến nay, nghề nuôi thủy sản liên tục phát triển đa dạng lẫn thâm canh hóa Nếu năm 1970, tốc độ tăng trưởng năm sản lượng 3,9%, năm 2006, tốc độ tăng trưởng 36% Sự phát triển nhanh chóng nghề nuôi góp phần tăng tỷ lệ tiêu dùng sản phẩm thủy sản nuôi trồng từ 0,7 kg/người/năn vào năm 1970 lên 7,8 kg/người/năm vào năm 2006 Sản phẩm thủy sản nuôi trồng chiếm 46% tổng sản phẩm thủy sản tiêu dùng hàng năm Ở Trung Quốc, tỷ lệ 90% Trên giới, Châu Á cho sản lượng thủy sản nuôi trồng lớn nhất, chiếm 89% tổng sản lượng 77% tổng giá trị sản phẩm thủy sản nuôi trồng giới năm 2006 Năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản giới 51 triệu sản lượng khai thác 92 triệu Trong số này, Trung Quốc chiếm 66,7% tổng sản lượng nuôi, nước Châu Á khác chiếm 22,8%, nước khác lại Châu Âu, Châu Mỹ, Úc,… chiếm 10,5% Mười nước đứng đầu giới sản lượng nuôi trồng thủy sản theo thứ tự gồm: Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Chile, Nhật Bản, Na Uy Philippines Năm 2006, sản lượng nuôi trồng thủy sản Việt Nam -2- 1,67 triệu tấn, đứng thứ giới Nghề nuôi trồng thủy sản nội địa tiếp tục đóng góp cho nghề nuôi thủy sản nói chung, với 61% sản lượng 53% tổng giá trị sản phẩm nuôi trồng Nuôi thủy sản nước chiếm 58% sản lượng 48% giá trị, nuôi biển chiếm 34% sản lượng 36% giá trị Trong đó, nuôi nước lợ với tỷ lệ sản lượng thấp 8% cho tỷ lệ giá trị đến 16% nuôi chủ yếu loài tôm có giá trị cao Cơ cấu nhóm loài nuôi cho thấy, năm 2006, cá nước cho sản lượng cao 27,8 triệu tấn, đạt giá trị 29,5 triệu USD; động vật thân mềm rong biển cho sản lượng giá trị tương đương Trong đó, giáp xác có sản lượng 4,5 triệu đạt giá trị đến 17,95 triệu USD Hình 2.1: Sản lượng giá trị sản phẩm nuôi trồng thủy sản giới qua năm (FAO 2009) Hình 2.2: Cơ cấu sản lượng giá trị nhóm loài thủy sản nuôi giới 2006 (FAO 2009) -3- 2.1.2 Tại Việt Nam Ở Việt Nam, nghề nuôi thủy sản phát triển động Nghề nuôi thủy sản truyền thống thập niên 1960, nhiên vòng 10 năm nay, nghề nuôi thủy sản có tốc độ phát triển nhanh chóng Theo thống kê Bộ Thủy sản (2006) năm 1999 nước có tổng cộng 524.619 ha, đạt sản lượng 480.767 Năm 2005, nước có gần 1.000.000 nuôi thủy sản, đạt sản lượng 1.437.356 tấn, đó, sản lượng nuôi thủy sản nước lợ - măn 546.716 tấn, sản lượng nuôi nước đạt 890.650 Hiện nay, đối tượng nuôi mô hình nuôi thủy sản Việt Nam phong phú, nhiên, chủ lực nuôi cá tra thâm canh vùng nước nuôi tôm vùng nước lợ ven biển Đặc biệt, năm 2007, sản lượng nuôi cá tra basa đạt 1.200.00 sản lượng tôm nuôi đạt 307.000 Theo kế hoạch, đến năm 2010, diện tích nuôi trồng thủy sản nước 1.000.000 ha, đạt sản lượng 2.000.000 kim ngạch xuất đạt 2.500.000 USD, thu hút 2.800.000 lao động nuôi trồng thủy sản (Bộ Thủy Sản, 2006) Hình 2.3: Sản lượng thủy sản khai thác nuôi trồng Việt Nam (tổng hợp Nguyễn Thanh Phương) 2.1.3 Một số khó khăn nuôi trồng thủy hải sản Vai trò nuôi trồng thủy sản to lớn việc cung cấp thực phẩm, y học, công nghiệp, nông nghiệp hay giúp xoá đói, giảm nghèo phát triển kinh tế xã hội nói chung nhiều quốc gia Tuy nhiên, với thâm canh hoá ngày cao độ, nghề nuôi đối mặt với nhiều thách thức lớn ô nhiễm môi trường, suy -4- thoái nguồn lợi, dịch bệnh thủy sản, an toàn vệ sinh thực phẩm, phân cách mâu thuẫn xã hội Các mô hình chiến lược phát triển thời gian tới gồm: Nuôi thâm canh với hệ thống hoàn chỉnh; nuôi tuần hoàn, nuôi kết hợp nuôi lồng biển khơi Nhằm phát triển bền vững nghề nuôi thủy sản, nay, nhiều tổ chức nổ lực lớn việc phát triển phương thức – qui tắc quản lý tổng hợp nghề nuôi thủy sản bước đầu ứng dụng nhiều nơi như: nuôi sạch, thực hành quản lý tốt hơn, nuôi có trách nhiệm 2.2 GIỚI THIỆU VỀ CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY HẢI SẢN 2.2.1 Tác nhân gây bệnh tôm 2.2.1.1 Bệnh virus a Bệnh còi (MBV – Monodon Baculovirus)  Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh còi (MBV – Monodon Baculovirus) virus có cấu trúc nhân (acid nucleic) DNA mạch đôi, có lớp vỏ bao, dạng hình que, có kích thước nhân 42 ± x 246 ± 15 nm, kích thước vỏ bao 75 ± x 324 ± 33 nm Hình 2.4: Thể virus gây bệnh còi (nhuộm âm): a- b – thể virus vỏ bao vỏ bao phía (a); vỏ bao phía (b); (vạch kẻ = 100nm); c-f – thể virus vỏ bao (vạch kẻ = 150; 150; 60; 80nm) (theo Graindorge & Flegel, 1999) -5- Virus ký sinh tế bào biểu mô hình ống gan tụy (Hepatopancreas) tế bào biểu bì phía trước ruột giữa, virus tái sản xuất bên nhân tế bào vật nuôi, bao gồm giai đoạn sau:  Giai đoạn O (tiềm ẩn): Sau tế bào nhiễm MBV giai đoạn sớm tế bào chất biến đổi  Giai đoạn 1: Nhân tế bào sưng nhẹ, nhiễm sắc thể tan di chuyển sát màng nhân Tế bào chất dần chức chúng hình thành giọt mỡ Virus bắt đầu gây ảnh hưởng  Giai đoạn 2: Nhân sưng nhanh, số lượng virus tăng nhanh, xuất thể ẩn (Occlusion bodies) nhân  Giai đoạn 3: Tế bào bị bệnh, nhân tăng lên gấp lần, đường kính bình thường tăng lần thể tích Bên nhân có đến nhiều thể ẩn, thể ẩn chứa đầy virus Các virus phá huỷ tế bào ký chủ, tiếp tục di chuyển sang tế bào khác theo chất tiết môi trường, tạo thành virus tự tồn bùn nước  Dấu hiệu nhiễm bệnh Khi tôm nhiễm virus MBV, dấu hiệu bệnh không biểu rõ ràng Khi tôm nhiễm bệnh nặng phát bệnh thường có biểu số dấu hiệu sau:  Tôm có màu tối xanh tái, xanh xẫm Tôm ăn, hoạt động yếu sinh trưởng chậm (chậm lớn)  Các phần phụ vỏ kitin có tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám (ký sinh trùng đơn bào, tảo bám vi khuẩn dạng sợi)  Gan tụy teo lại có màu trắng vàng, thối nhanh  Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% tôm chết hầu hết ao -6- Hình 2.5: Gan tuỵ tôm sú nhiễm bệnh còi, xuất thể ẩn () nhuộm xanh malachite 0,5%, X200  Phân bố lan truyền bệnh Bệnh MBV phát năm 1980 đàn tôm sú (Penaues monodon) đưa từ Đài Loan đến nuôi Mehico (Lightner ctv, 1981, 1983) Tiếp theo nhà nghiên cứu phát bệnh MBV có xuất phát từ Đài Loan, Philippines, Malaysia, Polynesia thuộc Pháp, Singapore, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Cho đến người ta biết bệnh MBV phân bố rộng rãi: châu Á, Thái Bình Dương, châu Phi, miền Nam châu Âu, châu Mỹ Tôm sú (P monodon) thường xuyên nhiễm bệnh MBV số tôm khác nhiễm bệnh MBV: P merguiensis, P semisulcatus, P kerathurus, P plebejus, P.indicus, P penicillatus, P esculentus, P vannamei (có khả năng) Virus MBV nhiễm từ Postlarvae đến tôm trưởng thành Ở Việt Nam tháng 10 – 11/1994 Bùi Quang Tề lần nghiên cứu mức độ nhiễm bệnh MBV tôm sú nuôi tỉnh ven biển phía nam: Tôm sú nuôi nhiễm virus MBV cao: Tôm thịt Minh hải: 50 – 85,7%, Sóc Trăng 92,8%; Tôm giống Bà Rịa – Vũng Tàu 5,5 – 31,6%, tôm giống Nha Trang 70 – 100% Bệnh MBV nguyên nhân gây chết tôm tỉnh phía Nam năm 1993 – 1994 Tiếp theo Đỗ Thị Hoà từ tháng 11/1994 – 7/1995 nghiên cứu bệnh MBV tôm sú nuôi tỉnh Nam Trung Bộ, kết cho thấy: tỷ lệ nhiễm virus MBV ấu trùng tôm sú 33,8%, tôm giống 52,5%, tôm thịt 66,5% Năm 1995 sơ điều tra bệnh tôm sú nuôi tỉnh phía Bắc nhiễm mầm bệnh MBV tỉnh: Nghệ An, Thanh Hoá, Hải Phòng Vì tỉnh lấy tôm giống từ Nha Trang nuôi (Bùi Quang tề ctv, 1997) Đến kiểm tra tôm post sản xuất -7- từ miền Bắc Quảng Ninh đến tỉnh phía Nam Cà Mau hầu hết chúng nhiễm mầm bệnh MBV, mức độ khác Bệnh MBV không làm tôm chết hàng loạt, làm tôm chậm lớn chết rải rác Khi thu hoạch tỷ lệ tôm sống thấp vấn đề nan giải nghề nuôi tôm biển tỉnh ven biển b Bệnh hội chứng đốm trắng giáp xác (WSSV – White Spot Syndrome Virus)  Tác nhân gây bệnh Trước năm 2002, có chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng gọi virus Trung Quốc Tuỳ nước nghiên cứu chúng có tên gọi kích thước khác Bảng 2.1: Các chủng Baculovirus nghiên cứu Kích thước virus Tên virus Kích thước nhân Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm Virus tôm Nhật 1(RVPJ-1) 84 x 226 nm Virus tôm Nhật (RVPJ-2) 83 x 275 nm 54 x 216 nm Virus bệnh đốm trắng Thái Lan (SEMBV) 121 x 276 nm 89 x 201 nm 70-150 x 350-380nm 58-67 x 330-350nm Virus bệnh đốm trắng (WSBV) Virus dạng hình trứng, kích thước 120 x 275nm, có đuôi phụ đầu, kích thước 70x300nm Virus có lớp protein, lượng phân tử từ 15 – 28 kDa Vỏ bao có hai lớp protein VP28 VP19; Nucleocapsid có lớp VP26, VP24, VP15 Nhân cấu trúc DNA mạch đôi: không ẩn (Occlusion body) Khi tôm xuất đốm trắng, quan sát thấy nhiều thể vùi (Inclusion body) Ở nhân tế bào mang, biểu bì ruột, dày tế bào biểu bì vỏ, quan lympho, nhân hoại tử sưng to Khi môi trường nuôi tôm xấu bệnh dễ xuất -8- Hình 2.6: Virus nhuộm âm huyết tương tôm sú nhiễm bệnh WSSV (theo Graindorge & Flegel, 1999)  Dấu hiệu nhiễm bệnh Dấu hiệu đặc trưng bệnh có đốm trắng vỏ Những đốm trắng thường có đường kính từ 0,5 – 2,0 mm Thường liên quan đến xuất bệnh đỏ thân Những dấu hiệu khác: Đầu tiên thấy tôm tầng mặt dạt vào bờ, bỏ ăn, hoạt động kém, phần phụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên vỏ có nhiều sinh vật bám Khi có dấu hiệu sức khoẻ tôm yếu, đồng thời đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm phát bệnh vòng từ – 10 ngày lên đến 100% tôm chết hầu hết ao nuôi Hình 2.7: Tôm sú bị bệnh đốm trắng, bóc vỏ đầu ngực thấy rõ đốm trắng vỏ  Phân bố lan truyền bệnh Bệnh đốm trắng thông báo Trung Quốc đầm nuôi tôm sú nuôi tỷ lệ chết cao (Chen, 1989) Năm 1993 Nhật Bản nhập tôm Trung Quốc nuôi xuất bệnh đốm trắng Năm 1994 có báo cáo từ Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản Thái Lan tìm nguyên nhân gây bệnh đốm trắng -9- Trong năm gần bệnh đốm trắng thường xuyên xuất khu vực nuôi tôm ven biển Việt Nam, hầu hết tỉnh bị nhiễm bệnh đốm trắng làm tôm chết hang loạt gây tổn thất lớn cho nghề nuôi tôm Năm 2001, Bùi Quang Tề cộng điều tra 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23 huyện tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34,37%) mang mầm bệnh đốm trắng tôm nuôi tôm cua tự nhiên có 169 hộ (34,99%) bệnh đốm trắng gây tôm chết Tôm sú nuôi sau – tháng bệnh đốm trắng xuất gây tôm chết hàng loạt c Bệnh đầu vàng (YHD – Yellow Head Disease)  Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh đầu vàng tôm sú virus hình que kích thước 44±6 x 173±13nm Nhân virus có đường kính gần 15nm, chiều dài tới 800nm Cấu trúc acid nhân ARN có đặc điểm gần giống họ Rhabdoviridae nhóm virus dạng sợi họ Paramyxoviridae  Khi tôm nhiễm bệnh đầu vàng kiểm tra tiêu máu thấy có dấu hiệu bất thường: Nhân tế bào hồng cầu thoái hoá kết đặc lại bị phá huỷ phân mảnh  Kiểm tra mô bệnh học tế bào có tượng hoại tử nhiều quan xuất thể vùi tế bào chất, nhân thoái hoá kết đặc vụ phân mảnh nhiều tế bào khác nhau: hệ bạch huyết (lymphoid), tế bào mang, tế bào kẽ gan tụy, tế bào biểu bì ruột Hình 2.8: Thể virus đầu vàng tế bào lympho tôm sú nhiễm bệnh - 10 - hạn, V alginolyticus xác định tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh cá tráp (Sparus aurata) nuôi Israel loài cá bị thương tổn (Colorni cộng sự, 1981) Trong đó, V.vulnificus tác nhân gây bệnh cho cá chình Nhật thông báo Muroga cộng năm 1979 Bioscas vào năm 1991 Cùng với Vibrio anguillarum, V.ordalii (Schiewe et al 1981) V.salmonicida (Egidius et al 1986) xuất tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho cá hồi nuôi Thái Bình Dương Đại Tây Dương Qua trình tồn phát triển, giống loài Vibrio gây bệnh có biến đổi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc dẫn đến tượng kháng thuốc, có tác hại nghiêm trọng phát triển nghề nuôi thuỷ sản nói chung nuôi cá biển nói riêng 2.3.3.2 Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh loài Vibrio cá có điểm khác biệt so với giáp xác Vì thành máu cá có tế bào hồng cầu, nguồn cung cấp ion Fe++ cho vi khuẩn Vibrio sống ký sinh thể cá Khi cá nuôi có sức đề kháng tốt, yếu tố môi trường ổn định, đại thực bào tăng sinh mạnh tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Trong trường hợp cá có vấn đề sức khoẻ điều kiện môi trường thuận lợi cho phát triển vi khuẩn (nhiệt độ biến động, hàm lượng protein môi trường nuôi cao ), số lượng đại thực bào không đủ để tiêu diệt vi khuẩn vi khuẩn có hội công vào hệ cơ, mô phận khác làm thương tổn ảnh hưởng xấu đến chức quan Vi khuẩn lấy ion Fe++ từ máu cá để hình thành enzyme protease phục vụ cho trình tổng hợp protein chúng, từ chúng gây hoại tử mô cá, hình thành vết loét thể, tạo điều kiện thuận lợi cho tác nhân hội khác xâm nhập 2.3.3.3 Đặc điểm dịch tễ a Đặc điểm phân bố  Địa lý: Vi khuẩn Vibrio gây bệnh cá biển có phân bố rộng vùng nước lợ, mặn khắp giới, từ châu Âu, châu Á, châu Mỹ hay lục địa Chúng luôn tồn môi trường nước gây bệnh cho cá gặp điều kiện thuận lợi - 49 -  Ký chủ: Có thể bắt gặp nhiều loài Vibrio gây bệnh cho cá như: cá chình, cá tráp, cá hồi, cá bơn  Giai đoạn phát triển: bệnh bắt gặp tất giai đoạn phát triển cá bệnh vi khuẩn thường gây thiệt hại lớn giai đoạn cá hương, cá giống cá trưởng thành Vibrio gây số thương tổn da làm giảm giá trị thương phẩm cá b Mùa vụ xuất Bệnh vi khuẩn Vibrio xuất quanh năm thường bùng phát vào mùa có nhiệt độ cao vùng nước có độ mặn cao cá bị stress, bệnh xảy khu vực cửa sông hay số loài cá nước c Tác hại Mặc dù vi khuẩn cảm nhiễm quan phận khác thường chúng công mạnh tim hệ cá Vì vi khuẩn có khả công mạnh vào hệ nên tác hại chúng nghiêm trọng khó chữa trị triệt để, vi khuẩn gây nên bệnh mãn tính cá trưởng thành Nếu bệnh xảy cấp tính hậu thiệt hại nặng nề Đối với ấu trùng cá hay cá giai đoạn cá hương, cá giống nhiễm bệnh nặng tỷ lệ chết lên đến 50% Đối với cá lớn tỷ lệ thiệt hại thấp cá giảm ăn, ngừng ăn không lớn thu hoạch quan sát thấy vết thương hoại tử da cá 2.3.3.4 Dấu hiệu bệnh lý a Dấu hiệu lâm sàng Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn Cơ thể có màu đen đặc biệt vùng lưng vết thương tổn; da, vây sưng lên bị lở loét Cơ hạch, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục b Dấu hiệu bệnh tích Lớp da có nhiều sắc tố melanin màu đen thể dấu hiệu hoại tử, có tượng lở loét lớp biểu bì Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử lan nhanh, hoá lỏng lách có màu đỏ anh đào, dần hình dạng ban đầu nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng Các quan bên khoang bụng xuất mạch máu rõ lên Tim cá bị bệnh xuất vết nâu đen - 50 - 2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH Vibrio sp 2.4.1 Phát vi khuẩn Vibrio sp phương pháp nuôi cấy 2.4.1.1 Nguyên tắc Nuôi cấy tăng sinh khối môi trường canh peptone kiềm, phân lập môi trường phân lập đặc trưng Quan sát chọn khuẩn lạc đặc trưng đĩa cấy Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực tốn Tuy nhiên nhược điểm thời gian để thực 2.4.1.2 Cách thực  Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên – tôm (cá) ao nuôi có dấu hiệu nhiễm khuẩn  Lấy máu tôm (cá): 0,1ml, sau nhỏ lên đĩa chứa môi trường TCBS, dàn khắp bề mặt môi trường, cấy lên đĩa Ủ tủ ấm 300C 24  Tiến hành thử nghiệm đặc tính sinh hóa Vibrio sp khả sử dụng đường glucose, sorbitol, maltose, sucrose, lactose, galactose; khả sử dụng Citrate nguồn carbon môi trường Simons Citrate Agar; khả sinh gar glucose, kiểm tra khả lên men oxy hóa; khả phân giải gelatin; khả sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hóa; khả sử dụng acid amin Hình 2.46: Khuẩn lạc vi khuẩn Vibrio sp môi trường TCBS 2.4.2 Phương pháp miễn dịch học – ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên - 51 - mẫu xét nghiệm Kỹ thuật ELISA sử dụng để phát bệnh phát sáng V.harveyi tôm, mẫu nước xác định tất dòng Vibrio sp… Phương pháp thực dựa nguyên tắc bắt dính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể gồm bước sau:  Kháng nguyên chưa biết gắn bề mặt  Kháng thể biết trước "rửa" qua bề mặt Kháng thể gắn kết với enzyme  Thêm vào chất (substance); enzyme biến đổi chất tạo tín hiệu xác định Đối với ELISA phát quang, ánh sáng phát từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể Sự diện phức hợp kháng nguyên – kháng thể định cường độ sáng phát Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định có mặt hay mặt lượng kháng nguyên mẫu nghiên cứu Để tiến hành ELISA cần phải có kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết Thông thường kháng nguyên cố định giếng vi phiếm (polystyrene microtiter plate)  Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt đĩa  Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên gắn với kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần kiểm tra Kháng thể đặc hiệu thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể sảy Nếu kháng thể gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học enzyme làm biến đổi chất giúp phát kháng nguyên cần kiểm tra Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) gắn với enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định nhận biết qua kháng thể thứ cấp Giữa bước ELISA, protein kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên lấy nhờ loại dịch có tác dụng "rửa" Sau bước "rửa" cuối cùng, kháng thể liên kết với kháng nguyên giữ lại Sau thêm vào, chất chịu tác dụng enzyme liên kết với kháng thể - 52 - phức hợp kháng nguyên – kháng thể Phản ứng phát quang (biến đổi chất) sảy ra.Trước chất tạo màu sắc sử dụng ELISA ngày chất phát quang dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu độ xác ELISA Có phương pháp ELISA sau: 2.4.2.1 ELISA gián tiếp (indirect ELISA) Chuyển kháng nguyên biết lên bề mặt cứng (được gọi chung đĩa) Kháng nguyên cố định bề mặt Nồng độ mẫu kháng nguyên dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ kháng nguyên mẫu chưa biết  Chuyển mẫu kháng nguyên chưa biết vào giếng khác Kháng nguyên chưa biết hòa tan loại dung dịch đệm giống mẫu kháng nguyên chuẩn  Thêm dung dịch protein không tương tác (non – interacting protein) albumin huyết bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất mẫu (kể mẫu chuẩn) Bước gọi "blocking" protein huyết có tác dụng ngăn cản hấp phụ protein khác lên bề mặt đĩa  Rửa bề mặt đĩa sau chuyển kháng thể (biết trước) vào tất giếng đĩa Kháng thể kết hợp với kháng nguyên cố định mà không kết hợp với protein huyết  Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp kết hợp với kháng nguyên dư (bước bỏ qua kháng thể dùng để phát kháng nguyên gắn với enzyme)  Rửa đĩa, kháng nguyên gắn enzyme dư loại bỏ  Thêm chất Enzyme làm biến đổi chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng yếu tố khuyếch đại) - 53 - Hình 2.47: ELISA gián tiếp 2.4.2.2 Sandwich ELISA Phương pháp sử dụng để phát kháng nguyên mẫu nghiên cứu bao gồm bước sau (quy trình thay đổi nhiều trường hợp):  Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể  Khóa tất vị trí gắn kết không đặc hiệu bề mặt  Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định  Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không gắn kết bị rửa trôi  Thêm kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đoán  Thêm KT thứ cấp gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp bước 5)  Rửa đĩa, phần không gắn kết bị rửa trôi  Thêm chất Enzym biến đổi chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện  Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa qua xác định có mặt hàm lượng kháng thể - 54 - Hình 2.48: Các bước Sandwich ELISA (1) Phủ đĩa kháng thể (2) Thêm mẫu cần xác định kháng nguyên Kháng nguyên (nếu có) gắn với kháng thể; (3) kháng thể dùng để phát thêm vào kết hợp với Kháng nguyên; (4) Thêm kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme Kháng thể thứ cấp gắn với kháng thể dùng để phát hiện; (5) Thêm chất Enzym làm biến đổi chất phát tín hiệu phát đo 2.4.2.3 ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) Các giếng kỹ thuật ELISA gắn kháng thể sơ cấp chống lại kháng nguyên Các tác nhân phát phức hợp đồng hóa trị kháng nguyên enzyme thường sử dụng horseradish peroxidase alkaline phosphatase Các tác nhân trộn chung với mẫu dịch chiết kháng nguyên phức hợp cho vào giếng Trong giếng đối chứng (không chứa kháng nguyên mẫu), phức hợp kháng nguyên – enzyme gắn lên kháng thể sơ cấp sau thêm chất tạo màu, kết màu mẫu Trong giếng kiểm tra, phân tử kháng nguyên tự dịch chiết cạnh tranh với phức hợp gắn kháng thể sơ cấp Nồng độ kháng nguyên cao, phức hợp gắn kháng thể sơ cấp tí dẫn đến màu giếng nhạt Thí nghiệm nhanh, dễ dàng thực - 55 - Hình 2.49: ELISA cạnh tranh 2.4.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Karl Mullis cộng (Mỹ) phát minh năm 1985 kể từ tạo nên tác động to lớn nghiên cứu sinh học toàn giới Ðây phương pháp in vitro sử dụng cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn từ trình tự DNA đặc biệt dựa hoạt động enzyme polymerase Hiện sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh Vibrio sp vài mà không nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn Nguyên tắc phương pháp phát đoạn DNA đặc hiệu cho Vibrio sp Phương pháp PCR dựa hoạt động DNA polymerase trình tổng hợp DNA từ mạch khuôn Tất DNA polymerase cần mồi, đoạn DNA ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn Ðoạn mồi sau nối dài nhờ hoạt động DNA polymerase để hình thành mạch hoàn chỉnh Trong phản ứng PCR để khuyếch đại trình tự đặc biệt đó, ta cần phải có thông tin tối thiểu trình tự để thiết kế mồi bổ sung hai đầu mạch bao gồm mồi xuôi (sense primer) mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã gene Một cung cấp hai mồi bổ sung hai đầu, phản ứng cho hàng loạt đoạn DNA nằm hai mồi Một phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba giai đoạn: - 56 -  Giai đoạn biến tính: dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao vòng 30 giây – 1phút, thường 940C  Giai đoạn bắt cặp: giai đoạn này, nhiệt độ hạ thấp cho phép mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ dao động khoảng từ 30 – 70C khoảng 40 giây – phút  Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ tăng lên đến 720C cho DNA polymerase sử dụng vốn polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt Thời gian tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thưòng kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn lặp lại nhiều lần, lần làm tăng số lượng lên gấp đôi Sự khuếch đại phản ứng theo cấp số nhân theo tính toán, sau 30 chu kỳ, khuếch đại 106 so với số lượng mẫu ban đầu Hình 2.50: Các giai đoạn phản ứng PCR - 57 - 2.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÒNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ 2.5.1 Biện pháp phòng bệnh tổng hợp 2.5.1.1 Cải tạo vệ sinh môi trường nuôi Cải tạo ao trước ương nuôi: tháo cạn, vét bùn (rửa đáy ao), phơi khô (hoặc rửa chua) khử trùng ao nuôi với mục đích là:  Diệt địch hại sinh vật vật nuôi trung gian sinh vật cạnh tranh thức ăn tôm, cá, loài cá dữ, cá tạp, giáp xác, côn trùng, nòng nọc, sinh vật đáy  Diệt sinh vật gây bệnh cho tôm, giống loài vi sinh vật: Vi khuẩn, nấm loài ký sinh trùng  Cải tạo chất đáy làm tăng muối dinh dưỡng, giảm chất độc tích tụ đáy ao  Đắp lại lỗ rò rỉ, tránh thất thoát nước ao, xoá bỏ nơi ẩn nấp sinh vật hại tôm Vệ sinh môi trường ao nuôi trình nuôi: vệ sinh môi trường nuôi phương pháp học, hóa học, sinh học  Vệ sinh môi trường nuôi phương pháp học: trình nuôi thương phẩm thức ăn thừa phân gây ô nhiễm môi trường nuôi, đặc biệt thời gian cuối chu kỳ nuôi Những sản phẩm khí độc như: H2S, NH3 ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ tôm nuôi Biện pháp dùng hệ thống máy quạt nước để tăng cường hàm lượng oxy hoà tan ao, đặc biệt tầng đáy, tạo điều kiện cho vi sinh vật hiếu khí phát triển làm giảm thiểu lượng khí độc ao Sục khí mạnh làm khí độc thoát khỏi ao, đồng thời gom chất thải ao vào nơi định, giúp rút các chất thải khỏi ao nuôi tốt  Vệ sinh phương pháp hóa học: vệ sinh môi trường nước nuôi tôm thường xuyên vôi bột (vôi nung để hả) tuỳ theo pH nước ao Vôi có tác dụng cung cấp Ca2+ cho ao, ổn định pH, khử trùng làm nước ao Nếu pH 8,0 dùng bột đá vôi (CaCO3) vôi đen – CaMg(CO3)2 để bón 1kg/100m3 Đối với ao nuôi thâm canh dùng vôi đen – Dolomite (Ca Mg), ý chất lượng vôi đen nguồn gốc Trong trình nuôi tôm nên thường xuyên bón vôi – lần/tháng với liều lượng – 2kg/100m3 nước(100 – 200kg/ha với độ sâu 1m) Dùng số hoá dược có tính oxy hoá mạnh phun vào ao: thuốc tím - 58 - (KMnO4) nồng độ – 5g/m3 Benzalkonium Chloride (BKC) nồng độ từ 0,1 – 0,5 g/m3 để tham gia vào trình oxy hoá khí độc (H2S, NH3) thành vật chất đơn giản không độc  Vệ sinh phương pháp sinh học: nuôi qui mô lớn dùng số chế phẩm sinh học để cải thiện môi trường nuôi tôm Tác dụng chế phẩm sinh học: cải thiện chất lượng nước, ổn định pH, cân hệ sinh thái ao; loại chất thải chứa nitrogen ao nuôi, chất thải gây độc cho động vật thủy sản,sau chúng chuyển hóa thành sinh khối làm thức ăn cho động vật thủy sản; giảm bớt bùn đáy ao; giảm vi khuẩn gây bệnh như: Vibrio sp, Aeromonas sp loại virus gây bệnh khác; hạn chế sử dụng hóa chất kháng sinh 2.5.1.2 Tiêu diệt nguồn gốc gây bệnh Khử trùng thể giống trước thả nuôi: ao tẩy dọn khử trùng đáy ao, nước tháo vào ao lọc kỹ giống mang mầm bệnh vào ao hồ Do nguồn giống thả vào thuỷ vực cần tiến hành kiểm dịch, có sinh vật gây bệnh ký sinh thể tôm tuỳ theo kết kiểm tra mà chọn thuốc trị bệnh cho thích hợp Khử trùng thức ăn: Thức ăn động vật tươi nên rửa sạch, tốt nấu chín Phân hữu cần ủ với 1% vôi sau sử dụng Xung quanh nơi cho ăn, thức ăn thừa thối rữa gây nhiễm bẩn, tạo điều kiện cho sinh vật gây bệnh phát triển Do thức ăn thừa phải vớt bỏ làm khử trùng địa điểm cho ăn Làm nơi cá (tôm) đến ăn dùng thuốc hay số lượng nhiều tuỳ thuộc vào chất nước, độ sâu, nhiệt độ nước, diện tích nơi cho ăn tình hình phát sinh bệnh Khử trùng dụng cụ: sinh vật gây bệnh theo dụng cụ lây lan bệnh từ ao bể bị bệnh sang ao, bể tôm khỏe Vì dụng cụ nghề nuôi nên dùng riêng biệt ao, bể Nếu thiếu sau sử dụng xong phải có biện pháp khử trùng đem dùng cho ao, bể khác Dụng cụ đánh bắt dụng cụ gỗ, quần áo lội ao phải dùng dung dịch Ca(OCl)2 200ppm để ngâm rửa dùng 2.5.1.3 Tăng cường sức đề kháng bệnh - 59 - Nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào thể có phát sinh bệnh hay không tuỳ thuộc vào yếu tố môi trường thân thể vật nuôi Nếu vật nuôi có sức đề kháng tốt có khả chống đỡ lại yếu tố gây bệnh nên không mắc bệnh bệnh nhẹ Ngược lại khả chống đỡ yếu, dễ dàng nhiễm bệnh Do khâu quan trọng để phòng bệnh cho vật nuôi phải tăng cường sức đề kháng cho vật nuôi Cho ăn theo phương pháp “4 định”:  Định chất lượng thức ăn: Thức ăn dùng cho ăn phải tươi, không bị mốc, ôi thối, mầm bệnh độc tố Thành phần dinh dưỡng thích hợp yêu cầu phát triển thể giai đoạn  Định số lượng thức ăn: dựa vào trọng lượng thể để tính lượng thức ăn, thường sau cho ăn sau kiểm tra ăn hết lượng vừa phải Nếu ăn thừa nên giảm bớt lần sau, thiếu tăng lần sau (chú ý tôm lột xác ăn  Định vị trí ăn: Khi cho ăn phải rải khắp ao (đối với cá cho ăn nơi cố định để tập cho cá có thói quen đến ăn tập trung điểm định), trừ vùng tập trung nhiều cặn bã (như đáy ao nuôi thâm)  Định thời gian cho ăn: tháng đầu nuôi hàng ngày cho ăn lần, tháng cuối chu kỳ nuôi cho ăn 4-5lần/ngày Ví dụ nuôi tôm thâm canh, mật độ dày tháng thứ 3-4 cho ăn lần/ngày Khi nuôi dùng phân hữu bón xuống thuỷ vực bổ sung chất dinh dưỡng sinh vật phù du phát triển cung cấp nguồn thức ăn tự nhiên 2.5.2 Điều trị  Khi tôm (cá) bị nhiễm bệnh sử dụng loại thuốc kháng sinh Furacin, Oxytetracylin, trộn vào thức ăn cho ăn liên tục -7 ngày  Dùng số kháng sinh trị bệnh cho ấu trùng tôm: Oxytetracyline + Bacitracin (tỷ lệ 1:1) nồng độ 1-3 ppm Erytromycin + Rifamycin (tỷ lệ 5:3) nồng độ 1-2 ppm Erytromycin + Bacitracin (tỷ lệ 1:1) nồng độ 1-3 ppm Thuốc phun trực tiếp bể sau 12 thay nước, xử lý ngày liên tục - 60 - CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 3.1 KẾT LUẬN Qua kết tìm hiểu Vibrio sp gây bệnh thủy sản cho thấy nhóm vi khuẩn lây nhiễm tất giai đoạn phát triển động vật thủy sản gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thủy sản giới Việt Nam  V.parahaemolyticus vi khuẩn chủ yếu gây bệnh phồng đuôi cho tôm, không lan truyền thành dịch bệnh lớn ảnh hưởng đến suất chất lượng tôm nuôi  V.alginolyticus gây bệnh đỏ dọc thân tôm, bệnh nhiễm khuẩn cá tráp  V.harveyi vi khuẩn chủ yếu gây bệnh phát sáng tôm, ao bị nhiễm V.harveyi nặng làm tôm chết hoàn toàn  V.vulnificus tác nhân gây bệnh cho cá chình Nhật  V.anguillarum, V.ordalii, V.salmonicida tác nhân gây bệnh cho cá hồi nuôi Thái Bình Dương Đại Tây Dương Có phương pháp thông dụng để xác định vi khuẩn Vibrio sp phương pháp nuôi cấy môi trường đặc trưng, phương pháp ELISA dựa theo nguyên tắc bắt dính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, phương pháp PCR dựa vào việc phát đoạn DNA đặc hiệu vi khuẩn Vibrio sp đưa đến biện pháp phòng ngừa, điều trị thích hợp 3.2 KIẾN NGHỊ  Cần tiến hành thử nghiệm gây cảm nhiễm chủng vi khuẩn Vibrio sp động vật nhiều điều kiện khác nhau, đặc biệt điều kiện gần với sản xuất thực tế vùng  Cần mở rộng nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn Vibrio sp khác để tổng hợp, đưa phương pháp xác định xác biện pháp phòng ngừa thích hợp cho bệnh động vật thủy sản  Nghiên cứu phát triển ứng dụng chế phẩm vi sinh vào lĩnh vực nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao chất luợng sản phẩm thủy sản, bảo đảm an toàn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu ngày cao khắt khe xã hội - 61 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Bùi Quang Tề, (1994) Kết khảo sát bệnh Penaeus monodon Baculovirus (MBV) tôm sú nuôi tỉnh phía Nam Báo cáo khoa học Viện Nghiên Cứu Thủy Sản I Bùi Quang Tề Vũ Thị Tám, (1994) Những bệnh thường gặp tôm cá đồng sông Cửu Long biện pháp phòng trị bệnh NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Bùi Quang Tề, (1996) Bệnh tôm cá giải pháp phòng trị.Tạp chí thuỷ sản số 4/1996 Bùi Quang Tề, (1997) Tình hình bệnh tôm cá thời gian qua biện pháp phòng trị bệnh.Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y - Hội thú y Việt nam, tập IV, số 2/1997 Đỗ Thị Hoà, (1996) Nghiên cứu số bệnh chủ yếu tôm sú (Penaeus monodon) nuôi khu vực Nam Trung Bộ Luận văn P.TS khoa học nông nghiệp Đỗ thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004) Bệnh học thủy sản NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Hà Ký ctv, (1995) Nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh tôm cá Tổng kết đề tài cấp nhà nước mã số KN – 04 – 12, năm 1991 – 1995 Nguyễn Văn Thành ctv, (1974) Kết nghiên cứu bệnh đốm đỏ cá trắm cỏ Tuyển tập công trình nghiên cứu Đại học Thuỷ sản Trần Linh Thước, (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo dục 10 Trần Thị Thanh Tâm, (2003) Nghiên cứu bệnh đốm trắng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi công nghiệp Báo cáo khoa học Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, năm 2001 – 2003 - 62 - Tài liệu tiếng Anh Claude E Boyd, (1996) Water Quality in Ponds for Aquculture Copyright by Claude E Boyd Ph.D Auburn University Auburn Alabana 36849 USA Printed 1996 by Shrimp Mart (Thai) Co Ltd 40-41 Chaiyakul Soi 1, Hatyai, Songkhla Thailand Chanratchakool et all, (1994.) Health Management in shirmp ponds.Published by Aquatic Animal Health Research Institute Department of Fisheries Kasrtsart University Campus Jatujak Bangkok Thailand H.W.Ferguson, J F Turnbull, A Shinn, K Thompson, T T Dung and M Crumlish, (2001) Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam Journal of fish diseases 2001 Tom Defoirdt, Peter Bossier, Patrick Sorgeloos and Willy Verstraete, (2004) The impact of mutations in the quorum sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum and Vibrio harveyi on their virulence towards gnotobiotically cultured Artemia franciscana Ghent University, Belgium Tài liệu web http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Sinh_h%E1%BB%8Dc_ph%C3%A2n_t %E1%BB%AD http://www.ebook.edu.vn/?page=1.31&view=5020 http://www.ebook.edu.vn/?page=1.1&view=5441 http://www.mekongfish.net.vn/modules/news/article.php?storyid=68 http://www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/thuysanweb/modules/news/article.ph p?storyid=236 http://www.vietlinh.com.vn/kithuat/ca/fishdisease.htm http://www.fineprint.com - 63 -