Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề : Trong trình cải biến di truyền, suất chăn nuôi gia súc gia cầm tăng lên đáng kể Việc tăng mật độ nuôi thách thức bệnh tật gia tăng bò nhiễm mầm bệnh khác nhau, đặc biệt vi khuẩn đường ruột E.coli, Salmonella ssp., Clostridium perfringens Campylobacter ssp Bệnh đường ruột có ảnh hưởng lớn đến ngành chăn nuôi Chúng làm giảm suất, tăng tỷ lệ chết nguồn nhiễm tiềm cho sản phẩm thịt, giảm an toàn thực phẩm cho người Sản phẩm thòt bò hạn chế xuất không đủ chất lượng hay tồn dư kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng (người chăn nuôi trộn vào thức ăn để kích thích sinh trưởng, ngăn ngừa bệnh tật, giảm tiêu tốn thức ăn) Với ý thức ngày tăng người kháng thuốc vi khuẩn, nên việc sử dụng kháng sinh chữa bệnh, phòng bệnh cho gia cầm giảm dần Từ lâu có mối quan tâm đến việc tìm loại chất thay kháng sinh chăn nuôi Vi sinh vật sống ống tiêu hóa vật nuôi có ảnh hưởng sâu sắc đến vài trình sinh lí vật chủ Vì vậy, điều quan phải hiểu chế hệ vi khuẩn đường ruột gia cầm, gia súc, tìm chất thay chất kháng sinh Trong trạng thái bình thường đường ruột có cân vi khuẩn có lợi gây bệnh Nó bò ảnh hưởng tương tác quan hệ cộng sinh cạnh tranh Cộng đồng vi khuẩn không bảo vệ máy tiêu hóa mà tăng khả sản xuất động vật chủ Probiotic sản phẩm nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm thay chất kháng sinh, tăng cường miễn dòch cho vật nuôi Probiotic có khả hạn chế tiêu chảy Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền heo con, kích thích tiêu hóa tăng trưởng heo thòt đòi hỏi cấp thiết nhà chăn nuôi Việc sản xuất chế phẩm probiotic từ chủng vi sinh vật với enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi góp phần nâng cao suất thông qua việc tăng sức đề kháng cho gia súc, gia cầm, đặc biệt gia súc non, tăng khả tiêu hóa, hấp thụ chất dinh dưỡng, từ tăng thu nhập cho nông hộ, giải công ăn việc làm, thúc đẩy sản xuất phát triển Để có thòt đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nước xuất khẩu, ngành chăn nuôi Việt Nam tìm thấy lời giải việc thay việc sử dụng kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng probiotics kết hợp với enzyme hỗ trợ tiêu hóa Cụ thể probiotic gì? Và việc bổ sung probiotic vào thức ăn cho vật nuôi có lợi nào? Để sản xuất chế phẩm probiotic đặc thù cho chăn nuôi cần nghiên cứu triển khai vấn đề gì? Để giải đáp câu hỏi chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp nhan đề: “Tìm hiểu tình hình nghiên cứu, sản xuất ứng dụng probiotic chăn nuôi” 1.2 Mục đích đề tài: Mục đích đề tài nhằm tìm hiểu nghiên cứu phân lập, tuyển chọn vi sinh vật làm chế phẩm probiotic chăn nuôi giới Việt Nam Tìm hiểu quy trình sản xuất chế phẩm probiotic Ứng dụng chế phẩm chăn nuôi 1.3 Nội dung đề tài: - Tổng quan nghiên cứu sản xuất ứng dụng probiotic chăn nuôi, cụ thể vi khuẩn lên men lactic, Bacillus spp nấm men Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền enzyme hỗ trợ tiêu hóa nhằm tăng hiệu suất sử dụng thức ăn - Thực nghiệm quy trình sản xuất thử chế phẩm probiotic: khảo sát tìm môi trường sản xuất điều kiện bảo quản chế phẩm; khảo sát khả sinh enzym cellulase từ chủng nấm mốc Aspergillus niger, Asperigillus oryzae; thu chế phẩm enzym cellulase bổ sung vào chế phẩm probiotic 1.4 Ứng dụng đề tài: Đề tài sở lý thuyết cho nghiên cứu thực nghiệm phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic để sản xuất phát triển chế phẩm probiotic ứng dụng chăn nuôi Việt Nam Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền CHƯƠNG II: TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 2.1 Lòch sử nguồn gốc: Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm, tăng cường sức khỏe cho người Trên hàng nghìn năn trước, lâu đời chưa tìm thuốc kháng sinh, người biết đến thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe như: Sữa lên men, sản phẩm lên men khác… điều tra dựa khoa học, việc sử dụng loại thực phẩm lên men nhiều văn hóa giới xảy trước đời điện lạnh Khái niệm áp dụng cải thiện sức khỏe cách bổ sung tự nhiên vi sinh vật có ích cho đường ruột, cách thêm vào đồ uống từ kỷ thứ mười chín muộn Vào thời điểm đó, số bác só cho bệnh tật lão hóa trình để xây dựng sản phẩm chất thải hoặc, thối rữa ruột già (phần ruột già mà đổ vào trực tràng), vật liệu độc hại bò rò rỉ từ ruột kết vào dòng máu Quá trình rò rỉ-bây gọi ruột thấm hội chứng ruột bò thủng, dẫn đến ngộ độc từ nó, gọi tự thụ độc Lý thuyết cho tự thụ độc thay đổi chế độ ăn kiêng nhằm giảm phân hủy chất độc hại ruột kết có lợi cho sức khỏe Một số nhà quan sát biết việc sử dụng vi khuẩn Acid lactic xúc xích, lên men thòt bảo vệ khỏi hư hỏng, vi khuẩn vô hại người, họ nghó bổ sung chúng vào chế độ ăn uống cách, ăn loại thực phẩm lên men làm giảm lượng độc tố sản xuất ruột kết Nhóm Lactobacilli vi khuẩn, số tìm thấy sữa chua, người tìm hiểu, xác đònh probiotic Trong thập niên 1920 1930, nhiều bác só khuyến cáo Acidophillus có sữa, có loài vi khuẩn Lactobacillus Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền acidophillus, để điều trò táo bón tiêu chảy Điều điều trò hiệu cho nhiều bệnh nhân Giai đoạn phát triển probiotic vào năm 1950, nhà nghiên cứu y tế bắt đầu biết đến Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus câu trả lời cho số tác dụng phụ tiêu hóa dùng thuốc kháng sinh Mọi người biết thuốc kháng sinh phá vỡ cân tự nhiên đường ruột cách giết chết vi lợi ích vi khuẩn gây bệnh Các nhà nghiên cứu nghó việc uống chế phẩm có bổ sung Lactobacillus acidophilus, bù đắp tác dụng phụ thuốc kháng sinh Một khó khăn chế phẩm probiotic đảm bảo sống sót vi khuẩn dày trình tiêu hóa ruột non thành công với thực dân ruột kết Gần đây, probiotic với sống sót đặc biệt thành công với thực dân ruột kết minh chứng nghiên cứu, lên giới Điều cho thấy, probiotic sàng lọc từ nhiều chủng lactobacilli Goldin, Sherwood Gorbach Barry nghiên cứu Lactobacillus GG (LGG) chứng minh có hiệu chống viêm đại tràng Clostridium difficile chống nhiễm trùng ruột kết kết Overkill, kháng sinh vi khuẩn hữu ích chống dò ứng trẻ em ruột thấm Hippoocrates nhều người khác đònh sữa lên men có tác dụng dinh dưỡng chữa trò rối loạn ruột dày ( oberman, 1985) Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền Từ thời nhà khoa học nghiên cứu nhiều người tìm vi sinh vật sống lợi ích chúng có ý nghóa lớn đến sống người Với hai nhà khoa học Lourens Hattigh Viljoen, 2001, nghiên cứu từ trước kiến thức probiotic ngày đẩy mạnh nũa Giai đoạn kỷ đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trò bệnh lây nhiễm đường ruột, nghiên cứu gần tập trung vào lợi ích khác cuả vi khuẩn đường ruột loại thực phẩm để vận chuyển vào thể người vật nuôi 2.2 Đònh nghóa probiotic: Thuật ngữ probiotic Metchnikoff đưa nghiên cứu người nông dân BUNGARY có sức khỏe tốt vào năm 1970 Probiotic nhóm vi khuẩn trung tính, sống đường tiêu hóa động vật, chúng tạo thành khu hệ vi sinh vật, chúng cản trở phát triển số vi sinh vật gây bệnh, cung cấp cho người số chất có lợi cho thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dòch Con người sử dụng chế phẩm có chứa probiotic loại thực phẩm loại thuốc phòng chữa bệnh Đồng hành với thuật ngữ probiotic thuật ngữ PREBIOTIC : Là non-digestible oligosaccharides (NDOs), ảnh hưởng đến phát triển khu hệ vi sinh vật (bao gồm resistant starches) Sự kết hợp probiotic prebiotic gọi synbiotic tăng cường khả điều hòa khu hệ vi sinh vật ảnh hưởng đến khả tiêu hóa, chống bệnh đường tiêu hóa vật chủ Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghóa “Cho sống” Tuy nhiên, đònh nghóa probiotics phát triển nhiều theo thời Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền gian Lily Stillwell (1965), mô tả trước tiên probiotic hỗn hợp tạo thành động vật nguyên sinh mà thúc đẩy phát triển đối tượng khác Phạm vi đònh nghóa mở rộng Sperti vào đầu năm bảy mươi bao gồm, dòch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật Probiotic vi sinh vật như: vi khuẩn hay nấm men mà thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể vi sinh vật đường ruột sinh vật chủ ( parrer, 1974) Vì vậy, khái niệm “probiotic” ứng dụng để mô tả “cơ quan chất mà góp phần vào cân hệ vi sinh vật ruột” Đònh nghóa chung sau làm cho xác Fuller (1989), ông đònh nghóa probiotic “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ việc cải thiện cân hệ vi sinh vật ruột nó” Khái niệm sau phát triển xa : “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic vi khuẩn khác, nấm men trạng thái khô hay bổ sung thực phẩm lên men), mà thể có lợi sức khỏe vật chủ sau tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có vật chủ”( Havenaar Huis in't Veld, 1992) Theo Laurent Verschuere CTV (2000) probiotic đònh nghóa sau: "Probiotics sinh vật sống có ảnh hưởng tốt cho vật chủ nhờ vào biến đổi hệ sinh vật gắn với vật chủ hay xung quanh vật chủ, từ cải thiện khả sử dụng thức ăn, nâng cao khả chống bệnh vật chủ, cải thiện môi trường xung quanh” Năm 2001 Schrezenmeir Devrese đònh nghóa Probiotic "Lượng vi sinh vật sống xác đònh với số lượng thích hợp chuẩn bò sản Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền phẩm, có tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật vùng ruột có tác dụng tốt đến sức khỏe vật chủ” Theo đònh nghóa FAO/WHO 2002:" Probiotic, vi sinh vật sống kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ" Tóm lại probiotic là: - Tập hợp vi sinh vật sống - Được đưa vào thể vật nuôi qua đường tiêu hóa (thức ăn hay thuốc) - Đem lại hiệu thích cực cho sức khỏe vật chủ Để “tập hợp vi sinh vật sống “thực sự” đem lại hiệu tích cực cho sức khỏe vật chủ”, chúng phải chọn lọc đáp ứng tiêu chuẩn - An toàn sinh học - Hoạt tính sinh học - Đặc tính kỹ thuật để trở thành sản phẩm ngành lên men công nghiệp (Tuomola et al.,2001) 2.3 Tiêu chẩn an toàn sinh học Các vi khuẩn Lactic hay vi khuẩn lên men Lactic acid bacteria (LAB), sử dụng làm probiotic nhiều chúng sử dụng thực phẩm lên men truyền thống từ lâu Người ta xếp chúng vào vi sinh vật GRAS (Generelly Recognized As safe ).lee y k salminens., 2009) 2.4 Hoạt tính sinh học Để có ảnh hưởng tích cực lên sức khỏe vật chủ, probiotics phải có hoạt tính sinh học sau: - Có khả sống sót qua đường tiêu hóa nghóa chòu acid, dòch tiêu hóa dày Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền - Có khả kết dính bề mặt biểu mô ruột tồn lâu dài bên đường tiêu hóa - Có hoạt tính đối kháng chống lại vi sinh vật gây bệnh như: Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella Ssp, Helicobacter pylori… - Kích thích miễn dòch không gây viêm - Kháng đột biến kháng ung thư ( Matila et al.,2002 ) 2.5 Đặc tính kỹ thuật để trở thành sản phẩm ngành lên men công nghiệp - Khả lên men - Khả tổ hợp - Khả sinh axit lactic - Khả kháng khuẩn 2.6 Cơ chế hoạt động probiotic Cách thức hoạt động probiotics loại trừ, cạnh tranh, nghóa cạnh tranh bám vào màng nhầy thành ruột, qua tạo nên hàng rào vật lý bảo vệ công khuẩn gây bệnh ( Fullar, 2005) Chúng sản xuất hoạt chất kháng khuẩn men kích thích hệ thống miễn dòch Ngăn cản phát triển vi khuẩn gây bệnh cách sinh acid lactic, acid béo, peroxide kháng sinh In vitro, vi khuẩn lactic ngăn cản phát triển Staphylococcus, Shigella, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella chủng E.coli gây bệnh Tăng cường tiêu hóa thức ăn: Vi khuẩn lactic sản xuất vitamin nhóm B enzyme phân giải protein, lipid chuyển hóa đường latose sữa thành acid lactic, ngăn ngừa chứng tiêu chảy không dung nạp đường lactose sữa (xảy 90% dân châu Á) Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền Giảm cholesterol: Nhiều kết cho thấy vi khuẩn lactic có tác dụng làm giảm cholesterol máu Gilliland cộng thấy vi khuẩn lactic phân lập từ phân lợn có khả phân huỷ cholesterol môi trường nuôi cấy Các báo cáo cho thấy nồng độ cholesterol máu thấp lợn nuôi cholesterol có bổ sung chủng vi khuẩn lactic phân lập 2.6.1 Tác dụng biểu mô ruột Vi sinh vật probiotic có khả bám dính tốt tế bào biểu môruột, cạnh tranh nơi cư trú với vi sinh vật bệnh cạnh tranh dinh dưỡng Do đó, chúng có khả giảm kích thích tiết hậu phản ứng viêm lây nhiễm vi khuẩn, đẩy mạnh tạo phân tử phòng vệ chất nhầy 2.6.2.Tác dụng đến hệ vi sinh vật đường ruột Probiotic điều chỉnh thành phần vi khuẩn đường ruột Sự sống sót probiotic tiêu hóa phần khác phận tiêu hóa khác giống Khi tập trung khoang ruột, chúng tạo nên cân tạm thời hệ sinh thái đường ruột, thay đổi nhận thấy vài ngày sau bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng liều lượng giống vi khuẩn Kết với tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn đònh cư cách tạm thời ruột, chấm dứt tiêu thụ số lượng vi sinh vật probiotic giảm xuống Điều cho tất loại probiotic Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất sinh vật đường ruột Probiotic làm giảm pH phận tiêu 10 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền Xác đònh lượng tế bào đồng phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu Số tế bào ml mẫu nghiên cứu tính công thức sau: Số tế bào/ ml = a × 4000 × 103 ×10n/ b Trong đó: a: số tế bào ô lớn (80 ô con) b: số ô ô lớn (80 ô con) 103: chuyển từ mm3 sang ml (1000 mm3 = 1ml) n: số lần pha loãng mẫu Sau xác đònh lượng bào tử đồng chủng ta lắc dòch huyền phù nấm mốc, dùng pipet đầu típ vô trùng hút 20l dòch bào tử cho vào đóa petri có chứa môi trường Czapek với nồng độ CMC khác Làm cho tất chủng.( hình 3.1), sau cho vào tủ ấm, ủ 280C/ ngày Quan sát, đánh giá khả phân giải cellulose chủng Hình 3.1 Phương pháp lấy mẫu cho vào giếng thạch - Chỉ tiêu phương pháp theo dõi:  Sử dụng thuốc thử Iod để đánh giá vòng phân giải cellulose 53 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền  Nhỏ thuốc thử Iod vào đóa mẫu sau dùng thước để đo đường kính phân giải cellulose mẫu ghi nhận lại kết  Đường kính vòng phân giải cellulose (mm) 3.5.6 Lên men thu chế phẩm enzym cellulase bổ sung vào chế phẩm probiotic 3.5.6.1 Phương pháp lên men: Sử dụng phương pháp lên men bề mặt để sản xuất enzyme protease bổ sung vào chế phẩm probiotic 3.5.6.2 Quy trình nhân giống: * Quy trình nhân giống Aspergillus ssp Môi trường Czapek thạch nghiêng Ống mốc cấy chuyển Nuôi cấy 30-320C 5-6 ngày Nước cất Giống ống thạch nghiêng Trộn bào tử Cho vào môi trường czapek lỏng bình tam giác Nuôi cấy 30-320C 5-6 ngày 54 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền Trộn vào môi trường lên men 0.510% 3.5.6.3 Quy trình lên men thu chế phẩm enzym cellulase Nguyên liệu Xử lí nguyên liệu Hấp khử trùng Ủ khay Làm nguội Bóp tơi Trộn giống vsv Cho vào thau cho nước cất vào Cồn hay sunlfat amon Lọc Thu kết tủa enzyme Sấy Enzyme bán tinh khiết 3.5.6.4 Thuyết minh quy trình: Nguyên liệu: Nguồn tinh bột rẽ tiền như: cám gạo, ngô, bắp, bã khoai mỳ, hàm lượng tinh bột phải đạt 20-30%, độ ẩm không 15%, tạp chất không 0.05% Nguyên liệu xốp giúp sợi nấm phát triển tốt đa để sinh hoạt lực enzyme cao Hấp trùng: nguyên liệu có nhiều bào tử vsv khác nên phải trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường canh trường sản xuất không chứa vsv ngoại lai, trùng nhiệt độ 1200C 55 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền 90 phút Trước trùng dùng HCL hay H2SO4 để điền chỉnh pH môi trường Sau trùng làm nguội bắt đầu cấy giống Trộn giống vi sinh vật: Sau làm nguội, tiến hành cấy giống vào, trộn đều, tỉ lệ cấy giống thường 0,5-20% so với khối lượng môi trường Kỹ thuật nuôi cấy: Sau trộn giống xong, môi trường trải khay Để phòng ủ có nhiệt độ độ ẩm không khí thích hợp cho sợi nấm phát triển Nhiệt độ thích hợp 28-320C Thu chế phẩm enzyme: sau nuôi thời gian 5-6 ngày Ta cho vào bì cho nước cất vào, bóp cho tơi, lọc cho vào thau, cho cồn hay sunlfat amon vào để kết tủa enzyme Sau sấy thu dịch enzyme thô Trong tiến hành kết tủa, ta phải làm lạnh dòch enzym thô xuống 4-70C, để tránh làm hoạt tính enzym Khi đổ dung dich kết tủa phải đổ cách từ từ để tránh tượng biến tính 56 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền 3.6 Kết thảo luận 3.6.1 Sản xuất thử probiotic vi sinh Tìm thời gian lên men thích hợp Lên men vi sinh vật Saccharomyces, Bacillus, Lactobacillus, lấy mẫu sau 24, 48, 56 72 h, đo sinh khối vòng kháng vi sinh vật thò (Shigella spp.) Thử nghiệm hoạt tính kháng vsv môi trường lên men tìm thời gian lên men thích hợp.( kết trình bày bảng 3.1) Bảng 3.1 Kết thử nghiệm hoạt tính kháng vsv môi trường lên men Số lượng Thời gian lên men (giờ) vsv(cfu/ml)và hoạt 24 48 56 72 tính sinh học Số lượng vsv 5.8× 107 ×108 7.8 7.6 ×108 Saccharomyces ×108 Hoạt tính kháng 10 Shigella(D-d,mm) Bacillus Số lượng vsv 4.9 ×108 7.8 ×109 9.9 ×108 ×10 Hoạt tính kháng 18 12 10 Shigella(D-d,mm Số lượng vsv 6.8 ×107 9.5 ×109 8× 108 7.5 ×108 Lactobacillus Hoạt tính kháng 18 20 19 Shigella(D-d,mm - Bảng 3.1 cho ta thấy nồng độ vsv giảm dần theo thời gian lên men Chủng thời gian lên men 48 tốt chủng vsv, bảng kết cho thấy với 56 khả kháng shigella chủng vk Lactobacillus cao  Thử nghiệm phương pháp sấy, xác đònh tỉ lệ sống sót 57 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền Trong sấy phun giai đoan dầu giai đoạn nước bay hơi, rơi buồng sấy, yếu tố như: nhiệt độ khí vào, thời gian lưu đốc độ bơm thụ động yếu tố ảnh hưởng tới tỉ lệ sống sót vi khuẩn probiotics Nhiệt độ vi khuẩn vào buồng sấy coi thông số đònh tỉ lệ sấy phun Nhiệt độ < 640C, nhiệt độ tổn thương màng tế bào, vượt 650C xảy biến tính protein ribosome gây chết tế bào Trong sấy đông khô tổn thương tế bào lại đông đá Sấy đông khô trình làm nước làm lạnh đông Trong trình làm lạnh đông làm tăng nồng độ chất hòa tan ngoại bào, nước di chuyển từ tế bào Tốc độ lạnh đông ( 0C/phút) yếu tố đònh thu hồi sản phẩm tốc độ thấp nước bên nội bào không đủ thời gian thoát bên ngoài, làm lạnh nhanh màng phospholipid co thắt hạn chế nước thoát ra, nồng độ môi trường tăng cao, áp xuất thẩm thấu tăng gây stress cho tế bào gây tổn thương cho ribosomes Bảng 3.2 trình bày tỉ lệ sống sót vi sinh vật probiotic sau q trình sấy phun đơng khơ Tỉ lệ sống sót hỗn hợp vi sinh vật 75% sấy phun 80% đơng khơ Bảng 3.2 Tỉ lệ sống sót vsv qua q trình sấy Quá trình sấy Thông số sấy Sấy phun Đông khô Nhiệt độ đầu vào, 1450C 55 0C Kích thước hạt: 0.1 – 0.5µm Hệ số thu hồi chất rắn: 60% Năng xuất lít/giờ Tốc độ đông khô đá: 0.8 0C/ phút Nhiệt độ đông: - 400C Bơm chân không -3 1,95×10 mbar Năng xuất lít/giờ Thành phần chất Sữa gầy 20% + lactose 2% + Sữa gầy 20% + lactose 58 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền bảo vệ (%) cao nấm men 0.05% + NaCl 10% + sucrose 10% + 0.01% gelatin 1% Độ ẩm sau sấy 7.0% 7.0% Nồng độ tế bào 6×10 6×109 trước sấy cfu/ml Nồng độ tế bào 4.5×109 4.8×109 sau sấy cfu/ml Tỉ lệ sống sót % 75% 80% Sấy nhiệt gây tổn thương cho tế bào tỷ lệ tổn thương hơn, nhiệt độ sấy từ 35 – 400C Dùng phương pháp không tốn chi phí thiế bò hai phương pháp Nhưng dễ bị tạp nhiễm mơi trường xung quanh Chế độ phơi nhiệt độ bình thường không bò ảnh hưởng nhiệt độ phương pháp rẽ tiền, không tốn trang thiết bò …Nhưng khả bò tạp nhiễm vsv khác môi trường xung quanh dễ dàng Dù sấy phương pháp tế bào bò tỗn thương nước hay đổi cấu trúc không gian protein màng Tìm chất mang, chế độ phối trộn khảo sát thời gian bảo quản Sau sấy, hỗn hợp vi sinh probiotic trộn với thành phần chất mang khác Tỉ lệ sống sót sau 15, 30, 60, 90 ngày bảo quản theo dõi (bảng 3.3) Bảng 3.3 kết khảo sát chất mang phối trộn thời gian bảo quản sau sấy Chất mang Nồng độ Thời gian bảo quản sau sấy đông khô tế bào (ngày) ban đầu 15 30 60 90 59 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền ×109 ×109 ×109 ×109 CM I CM II CM III CM IV 4.5 ×109 5.0 ×109 4.5 ×109 4.8 ×109 4.0 ×109 4.5 ×109 3.2 ×109 4.0 ×109 8.2×108 2.3 ×109 2.0 ×109 7.5 ×108 7.8 ×108 2.0 ×109 1.0 ×109 6.5 ×108 Nhìn vào kết ta thấy sau thời gian bảo quản lượng sinh khối vsv giảm dần, cụ thể thay đổi nồng độ vsv môi trường sau thời gian bảo quản 60 90 ngày so với ban đầu sau: CM I: 15% - 13% CM II: 75% - 35% CM III: 35% -16 CM IV: 13% - 11% Kết cho thấy môi chất mang II chất mang III không giảm nhiều so với chất mang I IV Vậy nên chọn chất mang II III thích hợp Thời gian bảo quản khoảng 60 ngày thích hợp sau nồng độ tế bào giảm  Bao bì bảo quản sản phẩm Sản phẩm đựơc nghiên cứu bảo quản hai lọai bao bì polyethylene bao tráng nhơm Tỉ lệ sống sót sau thời gian bảo quản trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Khảo sát chế độ bảo quản chế phẩm Chế độ bảo quản Thời gian bảo quản (ngày) 15 Polyethelene 8.5 ×108 Bao tráng 8.2 ×108 nhôm 30 8.2 ×108 ×108 60 7.5 ×108 7.6 ×108 60 90 6.7 ×108 7.2 ×108 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền Với bao bì Polyethelene, tỉ lệ sống sót 78% sau 90 ngày so với 15 ngày, khi sử dụng bao tráng nhôm, tỉ lệ tương ứng đạt 85% Bảo quản bao tráng nhôm cho tỉ lệ sống sót vi sinh vật probiotic cao so với bao bì Polyethelene., nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê, nên loại bao bì thích hợp để bảo quản vi sinh vật probiotic 3.6.2 Sản xuất thử enzyme cellulase hỗ trợ tiêu hóa  Chọn chủng thích hợp: Từ chủng ban đầu tiến hành làm thí nghiệm thăm dò rút khả phân giải cellulose chủng nấm mốc Aspergillus niger Aspergillus oryzae (bảng 3.5, hình 3.2) (bảng 3.5, hình 3.3) Những chủng nấm mốc nói phân lập tuyển chọn từ nguyên liệu tự nhiên có nguồn gốc nước, sẵn có rẻ tiền Đồng thời có tính ổn đònh tốt, khả tăng trưởng sinh tổng hợp enzyme tốt Bảng 3.5.Chủng A1: (Aspergillus niger) Lặp lại Lần Lần Lần TB Nồng độ CMC 61 CMC Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền 0,5 36 34 33 34,33 35 35 37 35,67 1,5 29 29 31 29,67 Hình 3.2 Vòng phân giải chủng A1: (Aspergillus niger) Bảng 3.6 Chủng A2: (Aspergillus oryzae) Lặp lại Lần Lần Lần 0,5 36 34 39 36 34 30 32 32 1,5 30 29 29 29,33 Nồng TB CMC độ CMC 62 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền Hình 3.3 Vòng phân giải Chủng A2: (Aspergillus oryzae) Lên men thu chế phẩm enzym cellulase bổ sung vào chế phẩm probiotic Phương pháp lên men bề mặt đựơc áp dụng để sản xuất enzyme protease bổ sung vào chế phẩm probiotics Nhân giống sản xuất lên men chìm sử dụng môi trường Czapek Lên men bề mặt sản xuất enzyme sử dụng nguyên liệu rẻ tiền bã khoai mỳ bổ sung khoáng Czapek Enzyme thu hồi qua phương pháp kết tủa cồn sunfat amôn, sau sấy nhiệt độ 35-40oC, đến ngày (xem vật liệu phương pháp) Bảng 3.7 Tóm tắt q trình lên enzyme thu chế phẩm enzyme cellulase 63 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền Chuẩn bò tiệt trùng môi trường nuôi cấy: Môi trường lên men bã khoai mỳ sau hấp trùng Trộn giống sau làm nguội môi trường tỉ lệ giống: 0,5-20% Lên men bề mặt: Nhiệt độ thích hợp 28320C thời gian lên men 5-6 ngày Canh trường lên men trộn với nước cất để trích ly enzyme 64 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền 3.6.3 Hoàn thành quy trình sản xuất chế phẩm probiotic Hình 3.8 Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic Giống Lên men chìm, 16h/370C Lên men riêng rẽ giống Lên men riêng rẽ giống Phối trộn giống (tạo hỗn hợp) Phối trộn giống (tạo hỗn hợp) Sữa gầy 20%, Đồng hóa hỗn hợp dịch giống cao nấm men với chất bảo quản nhiệt 0.05%, lacto 2%, Đồng hóa huyền phù với chất bảo NaCL Sữa gầy quản nhiệt 20%, cao nấm men 0.05%, lacto Phối trộn với chất mang (bột đậu nành, cám2%, gạo, trấu, bã NaCL 0.01% khoai mỳ) xử lí nhiệt, độ ẩm 15% Sấy ( sấy phun, đông khô, sấy nhiệt …) Phối trộn với Enzym Đóng gói Sản phẩm, bảo quản 100C 3.6.4 Chế phẩm probiotic dạng bột đông khô dạng lỏng  Đã sản xuất 20 lít chế phẩm dạng lỏng, kg sản phẩm dạng bột 65 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền  Thành phần sản phẩm: Dạng lỏng: Lactobacillus plantarum, L brevis : 109CFU/ml Bacillus amyloliquefaciens, B megaterium :108CFU/ml Saccharomyces cerevisae, S boulardii Amylase : UI/ml Protease : 9,7 UI/ml Cellulase : 1841 UI/ml : 109CFU/ml Hình 3.9 Chế phẩm probiotic dạng lỏng Dạng bột Lactobacillus plantarum, L brevis : 8.5 x 108cfu/g Bacillus amyloliquefaciens, B megaterium :8.2 x 107CFU/g Hình 3.10 Chế phẩm probiotic dạng bột đông khô CHƯƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận: 66 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hương GVHD: T.s Nguyễn Hòai SVTH: Nguyễn Thò Thúy Hiền Sau trình tìm hiểu thực nghiệm chế phẩm probiotic chăn nuôi Em tổng kết cho kiến thức, hiểu chế phẩm nhận thấy rằng: chăn nuôi chế phẩm chủ yếu chứa vi sinh vật sống có họat tính kháng vi sinh gây bệnh đường ruột tăng cường miễn dòch nhằm tăng hiệu chăn nuôi gia súc gia cầm Hiện giới Việt Nam có nhiều nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật hoạt tính probiotics Trong chế phẩm probiotic chăn nuôi thương mại hóa rộng rãi nứơc ngòai xuất thò trường Việt Nam, nghiên cứu nước giai đọạn hoàn thiệt quy trình sản xuất probiotic quy mô phòng thí nghiệm, xác đònh điều kiện lên men tối ưu tăng sinh khối phương pháp thu hồi sản phẩm cho tỉ lệ sống sót cao Bên cạnh đó, sản xuất enzyme hỗ trợ tiêu hóa ý nhằm phối hợp với vi sinh probiotic tạo thành chế phẩm thức ăn bổ sung vừa phòng chữa bệnh vừa tăng hiệu suất sử dụng thức ăn 4.2.Đề nghò Hòan thiện quy trình sản xuất chế phẩm probiotic, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy qúa trình thu hồi sản phẩm Thử nghiệm sản phẩm gia súc Nghiên cứu thành phần bổ sung vào chế phẩm probiotics nhằm đa dạng hóa nâng cao hiệu sử dụng sản phẩm 67