VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài Nghiên cứu biểu gen GL0067868 mã hóa endo-1,4-beta-xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn tế bào Escherichia coli BL21 Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực hiện: Trần Thị Huyền Lớp: K19-1203 Hà Nội- 2016 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Lời Cảm Ơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để tơi hồn thành luận văn này: Người thầy tơi, TS Đỗ Thị Huyền, trưởng phịng Kỹ thuật di truyền hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài ThS Nguyễn Minh Giang - nghiên cứu sinh phòng Kỹ thuật di truyền bảo tận tình chun mơn, ln theo sát thí nghiệm tơi để có lời khuyên bổ ích kịp thời Trong gần năm học tập nghiên cứu phòng kỹ thuật di truyền, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành tập thể cán phịng Các thực tập sinh ln thân thiện, nhiệt tình, tạo nên mơi trường nghiên cứu chủ động, hăng say Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Viện Đại Học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô giáo thuộc môn Thực Phẩm truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập vừa qua Hà nội, tháng năm 2016 Sinh viên Trần Thị Huyền TRẦN THỊ HUYỀN Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học MỤC LỤC Lời Cảm Ơn MỞ ĐẦU MỤC TIÊU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Endo-1,4-xylanase 1.1.1.Phân loại endo-1,4-xylanase 1.1.2.Cấu trúc endo-1,4-xylanase 1.1.3.Cơ chế xúc tác endo-1,4-xylanase 1.1.4.Đặc tính xylanase 1.1.4.1 Nhiệt độ hoạt động endo-1,4-xylanase 1.1.4.2 pH hoạt động xylanase 1.1.5.Nguồn xylanase 1.1.5.1 Sinh tổng hợp endo-xylanase từ vi khuẩn 1.1.5.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm 1.1.6.Ứng dụng endo-xylanase 10 1.1.6.1 Trong ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi 10 1.1.6.2 Trong công nghệ sản xuất giấy 11 1.1.6.3 Trong sản xuất bánh 12 1.1.6.4 Trong sản xuất hóa chất, nhiên liệu sinh học 12 1.1.6.5 Ứng dụng ngành công nghiệp nghiền gỗ giặt 12 1.1.6.6 Các ứng dụng khác 13 1.2 Biểu gen 13 1.2.1 Hệ biểu E coli 13 1.2.2 Chủng biểu E coli BL21 15 1.2.3 Vector biểu pET-32a(+) 16 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 TRẦN THỊ HUYỀN Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 2.1 Vật liệu 18 2.1.1.Nguồn gen, chủng vi sinh vật plasmid 18 2.1.2.Hóa chất enzyme 18 2.1.3.Máy móc thiết bị 18 2.1.4.Các loại môi trường nuôi cấy 19 2.1.5.Các dung dịch sử dụng 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH10B phương pháp sốc nhiệt 19 2.2.2 Tinh DNA từ gel agarose QIAquick Gel Extraction kit 20 2.2.3 Cắt kiểm tra gen enzyme hạn chế 20 2.2.4 Phản ứng nối ghép gen ngoại lai vào plasmid 20 2.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 21 2.2.6 Biểu gen tế bào E coli 21 2.2.7 Điện di protein gel SDS-PAGE 21 PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Chọn dòng vector pUC57 mang gen exl 24 3.1.1 Tách dòng plasmid pUC-exl 25 3.1.2 Cắt kiểm tra gen exl pUC-exl NcoI XhoI 27 3.1.3 Cắt kiểm tra gen exl pUC-exl HindIII XbaI 29 3.1.4 Tinh gen exl KIT QIAquick 30 3.2 Thiết kế vector biểu pET-32a(+) mang gen exl 31 3.2.1 Đưa gen exl vào vector pET-32a(+) 31 3.2.2 Cắt kiểm tra gen exl pET-32a(+) enzyme hạn chế 32 3.2.3 Cắt kiểm tra gen exl pET-32a(+) enzyme ScaI 33 3.3 Nghiên cứu biểu gen exl E coli 35 3.3.1 Biểu gen exl E coli 35 TRẦN THỊ HUYỀN Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 3.3.1.1 Biểu vector pET32-exl chủng vi khuẩn E coli BL21 35 3.3.2 Lựa chọn điều kiện biểu 37 3.3.2.1 Nhiệt độ biểu 37 3.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG 38 3.4 Kết luận 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 45 Phụ lục 1: Các môi trƣờng dung dịch 45 Các dung dịch sử dụng tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 45 Các dung dịch dùng điện di DNA gel agarose 45 Các dung dịch dùng điện di gel polyacrylamide-SDS 46 Mã gen trình tự gen 47 PHỤ LỤC 2: Quy trình phƣơng pháp nghiên cứu 49 Quy trình biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH10B phương pháp sốc nhiệt 49 Quy trình tinh DNA từ gel Agarose kit QIA quick 50 Cắt kiểm tra gen enzyme hạn chế 51 Phản ứng nối ghép gen ngoại lai vào plasmid 51 Quy trình tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 52 Quy trình biểu gen tế bào E coli 53 Quy trình điện di protein gel polyacrylamide-SDS 53 TRẦN THỊ HUYỀN Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học DANH MỤC HÌNH Hình Cấu trúc hóa học xylan5 Hình 2: Cấu trúc không gian chiều xylanase họ GH10 từ Bacillus halodurans14 Hình 3: Cấu trúc không gian chiều xylanase họ GH1115 Hình 4: Bản đồ vector pET-32a(+) 17 Hình 5: Kết biến nạp plasmid mang gen pUC57-exl vào tế bào E coli DH10B 25 Hình 6: Điện di đồ kiểm tra dòng DNA plasmid từ tế bào E coli DH10B tái tổ hợp biến nạp với pUC-exl 27 Hình 7: vị trí cắt NcoI XhoI vector pUC57-exl 28 Hình 8: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pUC-exl bẳng enzyme NcoI XhoI 28 Hình 9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt pUC-exl enzyme XbaI HindIII 29 Hình 10: Sản phẩm tinh gen exl KIT QIAquick 30 Hình 11: Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid pET32-exl 32 Hình 12: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt pET32- exl NcoI XhoI gel agarose 0,8% 33 Hình 13: Điểm cắt ScaI vector pET32-exl 34 Hình 14: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt pET32-exl ScaI gel agarose 0,8% 34 Hình 15: Điện di đồ kiểm tra protein tổng số thể biến nạp E coli BL21(DE3) mang vector pET32-exl nuôi cấy nhiệt độ khác gel polyacrylamide 12,6% 36 TRẦN THỊ HUYỀN Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Hình 16: Điện di kiểm tra protein pha tan (T), không tan (KT) protein tổng số (TS) từ chủng E coli BL21(DE3) mang pET32-exl nuôi cấy nhiệt độ khác gel polyacrylamide 12,6% 38 Hình 17: Điện di đồ kiểm tra protein pha tan E coli BL21 mang gen exl nuôi cấy nồng độ chất cảm ứng khác 39 TRẦN THỊ HUYỀN Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid mRNA Messenger ribonucleic acid RBS Riboxom Bp Base pair kDa Kilo Dalton E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside LB Luria – Bertani medium PCR Polymerase chain reaction SDS Sodium dodecyl sulphate OD Optical density TAE Tris acetate EDTA Amp Ampicillin M Marker TRẦN THỊ HUYỀN Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học MỞ ĐẦU Theo Tổng cục Thống kê Việt Nam, sản lượng lúa nước ta trung bình đạt 60 triệu tấn/năm, hàng năm nước ta có khoảng 30-40 triệu rơm rạ1 Số rơm rạ sử dụng phần nhỏ làm phân bón sinh học, sản xuất nấm ăn, chủ yếu bị đốt bỏ cánh đồng gây lãng phí ảnh hưởng đến môi trường Trong năm gần đây, nguồn rơm rạ giới nghiên cứu chuyển hóa thành nhiều chất có giá trị y dược nơng nghiệp Đặc biệt, công nghiệp lượng, rơm rạ dùng để sản xuất lượng sinh học xanh thay nguồn than đá ngày cạn kiệt Việc chuyển hóa khơng mang lại sản phẩm có giá trị mà cịn bảo vệ mơi trường sống, giảm phát thải khí nhà kính gây biến đổi khí hậu tồn cầu tạo nguồn kinh tế chỗ cho nông dân Tuy nhiên, để chuyển hóa hiệu nguồn sinh khối lignocellulose, yêu cầu cấp thiết tìm nguồn enzyme có hoạt tính cao có tốc độ phản ứng nhanh để làm giảm chi phí q trình chế biến sản phẩm Một enzyme chìa khóa sử dụng q trình chuyển hóa lignocellulose thành đường xylan beta 1,4-xylanase gọi tắt endo-xylanase Enzyme endo-xylanase (EC 3.2.1.8) đóng vai trị quan trọng phân cắt xylan (thành phần lignocellulose từ rơm rạ) thành đường xylose2 Vì vậy, việc tìm kiếm enzyme có đặc điểm mới, có hoạt tính cao nhà khoa học nước quan tâm Ngồi ra, endoxylanase cịn enzyme thương mại quan trọng sử dụng lĩnh vực truyền thống thực phẩm, thức ăn chăn nuôi ngành công nghiệp giấy Trong năm gần đây, để tìm kiếm nguồn gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose, phịng Kỹ thuật di truyền, viện Công nghệ sinh học TRẦN THỊ HUYỀN Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Cơng Nghệ Sinh Học tiến hành giải mã tồn DNA metagenome vi khuẩn sống tự ruột mối khai thác 587 trình tự mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose có 27 trình tự mã hóa enzyme endo-1,4-beta-xylanase Bằng cơng cụ tin sinh học, trình tự mang mã số GL0067868 ước đốn sinh enzyme có hoạt tính tốt Trong khuôn khổ luận văn này, tiến hành đề tài: „Nghiên cứu biểu gen GL0067868 có nguồn gốc từ vi khuẩn ruột mối mã hóa endo-1,4- beta-xylanase tế bào Escherichia coli BL21‟ để tiến tới tinh chế xác định đặc điểm enzyme MỤC TIÊU Mục tiêu đề tài nghiên cứu biểu gen GL0067868 có nguồn gốc từ vi khuẩn ruột mối mã hóa endo-1,4-xylanase Escherichia coli BL21 TRẦN THỊ HUYỀN Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 3.4 Kết luận Với kết thu q trình thực đề tài, chúng tơi rút số kết luận sau: Đã thiết kế thành cơng vector pET32a(+) mang gen exl mã hóa endo-1,4-βxylanase vi sinh vật ruột mối Enzyme tái tổ hợp EXL biểu thành công chủng E coli BL21 dạng dung hợp với thioredoxin vector pET32a(+) với tổng kích thước khoảng 77 kDa EXL biểu pha tan tốt chủng E coli tái tổ hợp nuôi cấy mơi trường LBA có 1,25 mM IPTG 20oC TRẦN THỊ HUYỀN 40 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Anh Lê, Nguyễn Thị Thu Hạnh & Lê Thùy Linh (2013) in 26–33 Kulkarni, N., Shendye, A & Rao, M (1999) Molecular and biotechnological aspects of xylanases FEMS Microbiol Rev 23, 411–456 Sørensen, J F & Sibbesen, O (2006) Mapping of residues involved in the interaction between the Bacillus subtilis xylanase A and proteinaceous wheat xylanase inhibitors Protein Eng Des Sel 19, 205–210 Törrönen, A., Harkki, A & Rouvinen, J (1994) Three-dimensional structure of endo-1,4-beta-xylanase II from Trichoderma reesei: two conformational states in the active site EMBO J 13, 2493–2501 Krengel, U & Dijkstra, B W (1996) Three-dimensional structure of Endo1,4-beta-xylanase I from Aspergillus niger: molecular basis for its low pH optimum J Mol Biol 263, 70–78 Degefu, Y Cloning and characterisation of xylanase genes from phytopathogenic fungi with a special reference to Helminthosporium turcicum, the cause of northern leaf blight of maize PhD thesis Juturu V Wu J.C (2012) Microbial xylanases: engineering, production and industrial applications Biotechnol Adv 30(6), 1219-27 Nishitani, K & Nevins, D J (1988) Enzymic analysis of feruloylated arabinoxylans (feraxan) derived from zea mays cell walls I plant physiol 87, 883–890 Kavya, V & Padmavathi, T (2009) Optimization of growth conditions for xylanase production by Aspergillus niger in solid state fermentation Pol J Microbiol Pol Tow Mikrobiol Pol Soc Microbiol 58, 125–130 TRẦN THỊ HUYỀN 41 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 10 Wong, K K., Tan, L U & Saddler, J N (1988) Multiplicity of beta-1,4xylanase in microorganisms: functions and applications Microbiol Rev 52, 305–317 11 Biely, P., M Vršanská, M Tenkanen, and D Kluepfel (september 1997) “Endo-β-1,4-xylanase families: differences in catalytic properties.” \iJournal of Biotechnology, Biochemistry and genetics of cellulases and hemicellulases and their application, 57, no 1–3: 151–66 doi:10.1016/S0168- 1656(97)00096-5 12 de Lemos Esteves, F., Ruelle, V., Lamotte-Brasseur, J., Quinting, B & Frère, J.-M (2004) Acidophilic adaptation of family 11 endo-β-1,4-xylanases: Modeling and mutational analysis Protein Sci Publ Protein Soc 13, 1209– 1218 13 Kuhad, R C & Singh, A (2007) Lignocellulose Biotechnology: Future Prospects (I K International Pvt Ltd) 14 Jeffries, T W (1996) Biochemistry and genetics of microbial xylanases Curr Opin Biotechnol 7, 337–342 15 Meagher, M M., Tao, B Y., Chow, J M & Reilly, P J (1988) Kinetics and subsite mapping of a D-xylobiose- and D-xylose-producing Aspergillus niger endo-(1 4)-beta-D-xylanase Carbohydr Res 173, 273–283 16 Tenkanen, M et al (2013) Xylanase XYN IV from Trichoderma reesei showing exo- and endo-xylanase activity FEBS J 280, 285–301 17 Trần Thị Nhung, , Phạm Thị Thu Phương, , Nguyễn Thúy Hường & , Nguyễn Thị Mai Phương nghiên cứu thu nhận xylooligosaccharide (xos) từ cám gạo công nghệ enzyme 18 Caspers, M P et al (2001) Synthesis, processing and export of cytoplasmic endo-beta-1,4-xylanase from barley aleurone during germination Plant J Cell Mol Biol 26, 191–204 TRẦN THỊ HUYỀN 42 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 19 Cleemput, G., Hessing, M., Van Oort, M., Deconynck, M & Delcour, J A (1997) Purification and characterization of a [beta]-D-xylosidase and an endo-xylanase from wheat flour plant physiol 113, 377–386 20 Zhang, C., Liu, M.-S & Xing, X.-H (2009) Temperature influence on fluorescence intensity and enzyme activity of the fusion protein of GFP and hyperthermophilic xylanase Appl Microbiol Biotechnol 84, 511–517 21 Kim, J.-D (2005) Production of xylanolytic enzyme complex from Aspergillus flavus using agricultural wastes Mycobiology 33, 84–89 22 Xylanase gene sequences from the genomic DNA of unpurified rumen microorganisms 23 Ramalingam*, A D H and C (2010) Xylanases and its application in food industry: A Review J Exp Sci 1, 1–11 24 Escherichia coli Wikipedia, the free encyclopedia (2016) 25 Rosano, G L & Ceccarelli, E A (2014) Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges Front Microbiol.5.172 26 Merritt, C., Rasoloson, D., Ko, D & Seydoux, G (2008) 3′ UTRs Are the primary regulators of gene expression in the C elegans germline Curr Biol 18, 1476–1482 27 Dirix, G et al (2004) Peptide signal molecules and bacteriocins in Gramnegative bacteria: a genome-wide in silico screening for peptides containing a double-glycine leader sequence and their cognate transporters Peptides 25, 1425–1440 28 Studier, F W & Moffatt, B A (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes J Mol Biol 189, 113–130 TRẦN THỊ HUYỀN 43 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 29 Tu, Q et al (2016) Room temperature electrocompetent bacterial cells improve DNA transformation and recombineering efficiency Sci Rep 6, 24648 30 QIAquick® Gel Extraction Kit (2015) 31 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: A laboratory manual., Second edi Cold Spring Harbor Laboratory Press 32 Ahmed, S., Riaz, S & Jamil, A (2009) Molecular cloning of fungal xylanases: an overview Appl Microbiol Biotechnol 84, 19–35 TRẦN THỊ HUYỀN 44 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các môi trƣờng dung dịch Các dung dịch đƣợc sử dụng tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli  Môi trường: môi trường chọn lọc LBA lỏng  Dung dịch: - Dung dịch Sol I: Tris-HCl, pH 25 mM ADTA, pH 10 mM Glucoza 50 mM - Dung dịch Sol II NaOH 0,2% SDS 1% - Dung dịch Sol III Kali acetat 3M Acid acetic 5M - Dung dịch đệm TE Tris HCl pH 10 M EDTA pH 1M - Dung dịch chloroform/isoamylalcohol (24:1): 24 lần thể tích chloroform cộng với lần thể tích isoamylalcohol - Dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1): 25 lần thể tích phenol cộng với 24 lần thể tích chloroform lần thể tích isoamylalcohol Các dung dịch dùng điện di DNA gel agarose  Dung dịch đệm TAE 50 lần (100 ml): Tris 24,2% Acid acetic 5,71% TRẦN THỊ HUYỀN 45 Viện Đại Học Mở Hà Nội EDTA 0,5 M pH Khoa Công Nghệ Sinh Học 10 ml  Đệm tra mẫu (loading dye 6X): Bromophenol blue 0,25% Xylen cyanol FF 0,25% Glycerol 30%  Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml Các dung dịch dùng điện di gel polyacrylamide-SDS  Đệm Tris-HCl, pH 8,8 Tris 0,75 M SDS 0,2 dùng HCl để chỉnh pH đến 8,8  Đệm Tris-HCl, pH 6,8 Tris 0,25 M SDS 0,2% dùng HCl để chỉnh pH đến 6,8  Đệm chạy điện di Tris 0,05 M Glycine 0,192 M SDS 0,1% - SDS 10%: 10 g SDS bổ sung nước cất đến 100 ml - APS 10%: 10 g ammonium persulfate bổ sung nước cất đến 100 ml - TEMED: sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ cơng ty hóa chất - Dung dịch nhuộm gel (Cosmasie brilliant blue): Comasie brilliant blue: 0,025 g; Methanol: 40 ml; Axit acetic: 10 ml - Dung dịch rửa gel: Methanol: ml; axit acetic: 7,5 ml làm đầy đến 100 ml nước - Đệm xử lý mẫu: (treatment buffer 6X) Tris HCl 1M (pH 6,8) ml Glycerol 100% ml TRẦN THỊ HUYỀN 46 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học SDS 1g 2-Mecapto ml Bromophenol 1,2 mg - Đệm tra mẫu điện di DNA (5X) Bromo phenol blue 0,25% Xylen cyanol FF 0,25% Glycerol 30% - Gel polyacrylamide cho gel: Hóa chất Gel tách (14%) Gel (5%) H2O 300 µl 650 µl Tris HCl pH 8,8 1,125 ml - Tris HCl pH 6,6 - 250 µl Glycerol 50% 0,9 ml - Acrylamide 30% 2,1 ml 175 µl SDS 10% 45 µl µl APS 10% 30 µl 10 µl TEMED µl µl Mã gen trình tự gen  Mã gen: exln  Trình tự gen: GTGAGCCGATTGATCTGCAACCCGTTGAATATTGAATATCGCTATCA AATTCTGAATGGCAGTTCACCTTTCGCAAGAGACTCTAAACCGTATCT GTTTCGTGAAGCGGCCGATCCCACTATGCTGCTTTTCAAGGATGTATA TTATCTCTTCGCGTCCATGACGGGTGGATTTTGGTATTCTGATGATTT GATTGATTGGCGGTTTAAGGCGACACCAGAATTGCCTGTGACTCGAT ATTCGCCAGACGTGCGACAGATTGGCGACGCGTTGGTGTTCTCCGCG TCACGATATGGCAGTGAACCGTCGTTCTATCGAACCACTGATCCATTC TRẦN THỊ HUYỀN 47 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học ACGATTCCGTTTGAACCCATTTCAGACGCGTTCCAAAGAGCGGAAGA TCCTGACCTCTTTCAGGATGACGATGGGCGGATATATTATTATGGCGG ATGCTCGAATGAAACACCCATTTGGGGTGTTGAACTTGACCCTGTGA CATTTGCTCCACTCGGTGAAAAGGTTTCGTTGATATACGCCAACACA GAGTGTCACTTGTGGGAGGTTCACGGTGGCAAACCATACATCGAAGG TGTATATATGACGAAACACAAAGATAAATATTATTTGCAATATGCCG CGCCTGGCACGAATGTTGCGTGGTATTCGGATGGTGTGTATGTGGGTT CTGCGCCGCTTGGTCCGTTTGAATATCAGAAACATAACCCGTTTTCGT CAAAAATGACAGGGTTCATGCGCGGTGCTGGGCATGGCAGCACATTC AAAGACAAGCTGGGGAATTATTGGCATGTGTCAACATGCGCGATTTG TGTGAATCAAGGGATTCTGGAGCGCAGGGTGGGTTTGTTCCCTTGCG CCTTTGATGATGATGGTTTGTTATATTGCAATCAGAATTTCGCGGACT ATCCGTTTGATCTCTCGAACAGGCAACCTGGCGACGCTGGTTCAACG ACCCCGCCATATATGTTGCTGTCATATGGTAAGGTTGTGACCGCGTCG TCCAGTCAGCCTGGACACGAACCACAGCAAGCCGTGAACGAGGATTT GGTCACGTGGTGGGCTGCGGATGTTTTTGGCGATGATCAATGGCTTG AATTGGATTTGGGTGGATTGCAAACGGTTGCCGCCATTCAAGTCAAC TTTGCCGATCACTTCATCATGACACCGCTTGAGTTGCGCGAACTGACA CAGCGCGTCATAATTGAAAAACAATCGACCCGTTATCTGCTTGAATC CTCAACTAACGGGCAGGATTGGATGCCACTGATGGATCGCAGGGATG GAGAACATGACAACACGCATGATTTCATCGAGCTTCCAGATCCAATC GAAACACGTTATATACGCGTTTCAAACATGCAGCTACCCTTCAATGG TGTGCCTGCCGTCAGTGGTTTGCGTGTTTTTGGTCATGGACAAGGCGA GTTGCCAGAAACTGTGAGTGACATAGTAGCGACACGAAATGATGACT CAAGCATAGCGCTAAAGTGGCGTTCATCGAGCCGCGCGGTGGGTTAC AACATTAGGTTTGGCATATCACCGAATAAGCTATATTCGTCATTTCAG GTTCACGACGCCACTGAAGCGAAGCTGACCATGATAAACAAAGGTGT GAAGTATTATGCCGTGATTGACAGTTTCAATGAGTGCGGTGTGACAC AAGGCAAGGCAGTGATTGAGATATAA TRẦN THỊ HUYỀN 48 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Cơng Nghệ Sinh Học PHỤ LỤC 2: Quy trình phƣơng pháp nghiên cứu Quy trình biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH10B phƣơng pháp sốc nhiệt  Tạo tế bào khả biến - Cấy ria chủng từ -80oC đĩa LB LBA để lấy khuẩn lạc ủ qua đêm 37oC - Lấy khuẩn lạc ml LB lắc 200 vòng/phút qua đêm 37oC - Hút ml dịch nuôi cấy cho vào 200 ml LB lắc 37oC để làm tươi tế bào, thu mẫu OD = 0,2-0,4 (tế bào vào pha sinh trường OD đạt 0,15-0,19) - Thu tế bào, để lên đá (thu ống falcon) ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút 4oC (ly tâm tránh vỡ tế bào) thu tủa box - Rửa tủa CaCl2 0,1 M đến thể tích ban đầu (200 ml), để đá 15 phút - Ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút 4oC (sau rửa tủa lần CaCl2, tế bào xốp nên tăng thời gian ly tâm để tế bào lắng xuống, ly tâm kéo dài làm tế bào bám chặt vào nhau, khó tan CaCl2 Thu tủa box vơ trùng - Hồ tủa vào 45 ml 0,1 M CaCl2 Để đá - Ly tâm 8000 vòng/phút 10 phút 4oC, thu tủa - Hoà tủa 0,1 M CaCl2 tới 0,5 ml - Giữ tế bào khả biến glycerol lạnh 15% (0,25 ml glycerol 80oC cho ml tế bào khả biến) hoà chia ống eff 50 ml giữ -80oC (chuẩn bị trước ống eff để cồn lạnh nito lỏng) - Cấy tủa tế bào khả biến LB LBA để kiểm tra, ủ 37oC  Biến nạp: - Tế bào khả biến lấy từ tủ -80oC làm tan đá khoảng 30 phút (tránh bị sốc nhiệt) TRẦN THỊ HUYỀN 49 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học - Bổ sung vào ống tế bào khả biến µl mẫu sản phẩm lai (DNA + T4-DNA ligase + vector), đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố dịch tế bào khả biến sau đó, đặt toàn đá thời gian 20-30 phút - Tạo sốc nhiệt: Mẫu đặt đá chuyển sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC 90 giây Sau mẫu lấy đặt lên đá lạnh thời gian phút Bổ sung 300 µl LB, lắc hỗn hợp tế bào 37oC 60 phút - Hút 100 µl dịch tế bào cấy trải đĩa môi trường LBA đặc, ủ đĩa 37oC qua đêm Quy trình tinh DNA từ gel Agarose kit QIA quick Sử dụng để tinh DNA từ 70 bp đến 10 kb gel Agarose Quá trình tinh thực theo bước sau: Bƣớc 1: Cho thêm lần thể tích đệm QG vào lượng DNA cần tinh Ví dụ: khối lượng DNA 100 ug cho vào 300 µl đệm QG Bƣớc 2: Ủ 60oC gel tan hồn tồn Bƣớc 3: Thêm lần thể tích isopropanol mẫu (bước làm tăng hiệu cho DNA < 500 bps, > kb) Bƣớc 4: Đặt cột vào spin nhẹ để mẫu không bám lên thành cột Bƣớc 5: Ly tâm 13000 vòng/phút phút Lượng mẫu tối ưu 800 µl, lượng mẫu lớn 800 µl phải cho vào ly tâm nhiều lần, lần 800 µl Bƣớc 6: Bỏ dịch sau ly tâm, đặt cột vào lại Eppendorf ml cũ Bƣớc 7: Thêm vào cột 0,5 ml đệm QG, ly tâm 13000 vòng/phút phút Bước để loại bỏ tát cặn agarose Bƣớc 8: Thêm 0,75 ml đệm PE vào cột để rửa cặn Ly tâm 13000 vòng/phút phút Bƣớc 9: bỏ dịch sau ly tâm ly tâm thêm phút TRẦN THỊ HUYỀN 50 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Bƣớc 10: Đặt cột vào ống Eppendorf 1,5 ml Bƣớc 11: Để thu DNA, ta thêm vào cột 50 µl đệm EB nước (pH = 8,5) vào trung tâm màng lọc, ý không làm thủng màng, ly tâm 13000 vòng/phút phút Sau bước ta thu DNA tinh khiết điện di gel Agarose để kiểm tra Cắt kiểm tra gen enzyme hạn chế Một phản ứng cắt enzyme cắt hạn chế thường tiến hành tổng thể tích 10 µl gồm thành phần sau: Bảng 1: thành phần phản ứng cắt Thành phần phản Thể tích ứng (µl) H2O 4,4 Tango Buffer DNA plasmid XhoI (20U/µl, 0,3 NcoI (10U, Biolab) 0,3 Tổng 10 Biolab) Hỗn hợp phản ứng trộn đều, ủ nhiệt độ 37oC thời gian thích hợp với loại enzyme Sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra cách điện di gel agarose 0,8% Phản ứng nối ghép gen ngoại lai vào plasmid Bảng 2: thành phần chất phản ứng nối ghép gen TRẦN THỊ HUYỀN 51 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Thành phần Thể tích (µl) H2O Buffer 2,7 T4 DNA ligase 10X Gen Vector pET-32a(+) T4 DNA ligase 0,3 Tổng 10 Chuẩn độ 16oC Quy trình tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli - Cấy chuyển khuẩn lạc tế bào E.coli vào lọ penicillin chứa ml môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicilin (100 µ/ml), ni lắc qua đêm 37oC, 200 vịng/phút - Rót 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf loại 1,5 ml, ly tâm 6000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch thu tế bào - Bổ sung 100 µl dung dịch Sol I, vortex cho tan tế bào, để yên nhiệt độ phịng phút - Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II, đảo đầu ống eppendorf nhanh, nhẹ nhàng để tránh đứt gãy DNA Hỗn hợp dịch trở nên suốt quánh , ủ đá 10 phút - Bổ sung 150 µl dung dịch Sol III, đảo nhẹ lần, hỗn hợp xuất kết tủa trắng, ủ đá 10 phút - Bổ sung 450 µl Chloroform : Isoamyl, đảo nhẹ nhàng Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút để loại protein DNA nhiễm sắc thể - Hút 400 µl pha chuyển sang ống eppendorf - Tủa dịch pha với 900 µl cồn 100% Giữ tủ (-80oC) từ 30 phút đến tiếng TRẦN THỊ HUYỀN 52 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học - Lấy mẫu tủ âm ly tâm 13000 vịng/phút 15 phút sau loại bỏ dịch - Rửa phần kết tủa cách bổ sung 500 µl cồn 70% thu lại cách ly tâm 13000 vòng/phút 15 phút , loại bỏ dịch - Làm khô tủa máy speed-vac 6-7 phút - Hồ tan AND plasmid vào 30 µl dung dịch RNase, để máy lắc 37oC 45 phút - AND plasmid kiểm tra cách chạy điện di gel agaroza 0,8% Quy trình biểu gen tế bào E coli - Cấy lắc qua đêm khuẩn lạc ml LB lỏng có bổ sung Amp đến nồng độ cuối 100 µg/ml - Chuyển dịch nuôi cấy sang môi trường LBA lỏng (pha loãng 100 lần), lắc tiếp khoảng 37oC đến OD600 đạt khoảng 0,6-0,8 lấy tiến hành cảm ứng IPTG với nồng độ 0,05 mM - Tiếp tục cấy lắc mẫu cảm ứng 37oC - Thu mẫu vào ống ly tâm ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút để thu tủa tế bào Tế bào hòa vào nước đến OD600 = 10 Giữ tế bào tủ -80oC qua đêm đến phân tích Quy trình điện di protein gel polyacrylamide-SDS a/ Đổ gel Lau điện di cồn nước deion, lau khô, lắp vào khung điện di Kiểm tra nước xem lắp cách chưa, cách quan sát mức độ hụt nước nước vơi nhiều phải lắp lại kiểm tra nước không vơi Tiến hành đổ gel, ngồi gel tách thơng thường cịn có gel cơ, gel có tác dụng nén protein xuống đáy giếng để lúc điện di co giãn cấu trúc protein không ảnh hưởng đến kết điện di Thành phần gel trình bày phụ lục TRẦN THỊ HUYỀN 53 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Sau đổ gel tách đến 2/3 thể tích kính, ta cho nước đầy phần cịn lại Để khoảng 15-30 phút cho gel khơ hồn tồn đổ nước đi, cho gep tác vào Chờ cho gel khơ hồn tồn lắp vào buồng điện di Đổ đệm chạy vào buồng điện di Chú ý: đệm dung dịch đệm cịn đệm ngồi dùng lại đệm cũ Sau chuẩn bị buồng điện di tiến hành tra mẫu b/ Xử lý mẫu Cho mẫu vào effendorf, them vào đệm xử lý mẫu với tỷ lệ 4:1 VD: 48 ul mẫu + 12 ul = 60 ul đệm xử lý Sau cho biến tính protein 100oC 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút c/ Tra mẫu Dùng micropipette hút lượng mẫu cần thiết tra vào giếng cẩn thận không làm tràn giếng d/ Chạy điện di Sau tra mẫu ta tiến hành chạy điện di hiệu điện 38 mA, sau chạy hết phần gel tăng lên 42 mA Trong điện di, quan sát độ dịch chuyển protein thông qua di chuyển đệm xử lý lẫu Khi thấy chạy đến cuối dừng lại, lấy điện di tiến hành nhuộm màu e/ Nhuộm màu Có hai cách nhuộm màu gel acylamide sau điện di: nhuộm comassive nhuộm bạc Đối với protein có kích thước lớn, ta tiến hành nhuộm Comassive khoảng 15-30 phút, sau rửa cách ngâm gel dung dịch Destaining, lắc máy lắc khoảng 1-2 giờ, soi gel ánh sáng đèn, ta quan sát rõ băng protein biểu So sánh vị trí băng protein vị trí băng marker chuẩn ta biết kích thước băng cần xác định TRẦN THỊ HUYỀN 54