VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: “Nghiên cứu, lựa chọn thành phần môi trƣờng điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn sinh hƣơng nƣớc mắm Bacillus sp.VTPF4” Giáo viên hƣớng dẫn : ThS Bùi Thị Hồng Phƣơng Sinh viên thực : Trần Thị Xuyến Lớp : 1202 – K19 Hà Nội - 2016  - LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Bùi Thị Hồng Phương tận tình bảo hướng dẫn trình hoàn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện cho hoàn thành khóa luận Chân thành cảm ơn cô chú, anh chị Bộ môn Công nghệ Enzyme & Protein – Viện Công nghiệp Thực phẩm Xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình hoàn thành khóa luận Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2016 Sinh viên Trần Thị Xuyến MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………… 1.1 Giới thiệu chung nước mắm 1.1.1 Giới thiệu nước mắm 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng nước mắm 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình hình thành nước mắm 1.1.3.1 Ảnh hưởng loại cá sử dụng để chế biến nước mắm 1.1.3.2 Ảnh hưởng NaCl 1.1.3.3 Tỷ lệ muối ướp cá 1.1.3.4 Ảnh hưởng oxy 1.1.3.5 Enzyme 10 1.1.4 Cơ chế hình thành hương trình lên men nước mắm 12 1.1.4.1 Hương hình thành từ cá nguyên liệu 12 1.1.4.2 Hương hình thành trình lên men cá 13 1.1.5 Vai trò vi sinh vật trình lên men tạo hương nước mắm 15 1.2 Giới thiệu chung chủng Bacillus sp 16 1.2.1 Đặc điểm hình thái 16 1.2.2 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng tới sinh trưởng chủng vi khuẩn Bacillus sp 17 1.2.2.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 17 1.2.2.2 Ảnh hưởng nguồn Nitơ 18 1.2.2.3 Ảnh hưởng muối 18 1.2.2.4 Ảnh hưởng muối khoáng 19 1.2.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng chủng vi khuẩn Bacillus sp 20 1.2.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 20 1.2.3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 20 1.2.3.3 Ảnh hưởng pH môi trường 20 1.2.3.4 Ảnh hưởng chế độ sục khí tốc độ khuấy 21 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 23 2.1 Nguyên vật liệu 23 2.1.1 Nguyên vật liệu hóa chất 23 2.1.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.1.2 Môi trường sử dụng 23 2.1.1.3 Hóa chất 24 2.1.2 Máy móc, thiết bị 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp vi sinh 25 2.2.1.1 Đánh giá khả phát triển chủng Bacillus sp.VTPF4 môi trường nồng độ muối cao 25 2.2.1.2 Khảo sát sơ khả tạo hương chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 25 2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lý 26 2.2.2.1 Xác định khả sinh trưởng mật độ tế bào 26 2.2.2.2 Xác định đơn vị khuẩn lạc ………………………………… 26 2.2.2.3 Phương pháp phân tích hợp chất bay 26 PHẦN III: KẾT QUẢ, BÀN LUẬN……………………………………….28 3.1 Nghiên cứu xác định khả chịu muối, khả sinh hương đặc điểm hình thái chủng Bacillus sp.VTPF4 28 3.1.1 Nghiên cứu khả chịu muối chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 28 3.1.2 Khảo sát sơ khả tạo hương chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 29 3.1.2.1 Phân tích thành phần hợp chất bay dịch chượp lên men chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 30 3.1.2.2 Đánh giá khả thủy phân tạo acid chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 31 3.1.3 Nghiên cứu xác định đặc điểm hình thái chủng Bacillus sp.VTPF4 32 3.2 Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng Bacillus sp.VTPF4 34 3.3 Nghiên cứu lựa chọn thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 35 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 35 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ glucoza bổ sung 36 3.3.3 Ảnh hưởng nguồn Nitơ 37 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến trình lên men 39 3.4 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 40 3.4.1 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 40 3.4.2 Lựa chọn pH môi trường nuôi cấy thích hợp 41 3.4.3 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp 42 3.4.4 Lựa chọn chế độ lắc thích hợp 43 3.4.5 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 44 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………… 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………48 DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT MT1 Môi trường MRS lỏng, bổ sung muối với tỷ lệ 50g/l MT2 Môi trường dịch chiết cá MT3 Glucose 0.5%, cao nấm men 0.75%, dung dịch muối khoáng 5% MT4 Môi trường JMC 168 NB Nutrient Broth cs Cộng ĐC Đối chứng m/z Tỷ số khối lượng điện tích GC Gas Chorimatography DE Diethyl ether DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các loại nước mắm Ch u Bảng 1.2 Hàm lượng acid amin có nước mắm số nước Bảng 1.3 Thành phần chất dinh dưỡng vài loài cá Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng cá cơm 23 Bảng 2.2 Thành phần hóa học muối Nghệ An 23 Bảng 2.3 Thành phần môi trường MRS (trong lít môi trường) 23 Bảng 3.1 Kết khảo sát sơ khả phát triển tạo hương chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 29 Bảng 3.2 Kết phân tích hợp chất bay dịch lên men chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 30 Bảng 3.3 Khả thủy phân tạo acid chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 32 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái đặc tính sinh lý chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 32 Bảng 3.5 Khảo sát khả phát triển môi trường khác chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 38 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 40 Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả phát triển chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 41 Bảng 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến trình phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4…… 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Quy trình tách chiết hợp chất bay 27 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 28 Hình 3.2 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng Bacillus sp.VTPF4 33 Hình 3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 36 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ glucoza bổ sung đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 37 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 39 Hình 3.6 Ảnh hưởng chế độ lắc đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 43 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trình phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 44 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Nước mắm loại gia vị phổ biến Việt Nam nhiều nơi giới Nước mắm không làm cho ăn ngon hơn, đậm đà mà mang lại giá trị dinh dưỡng cao Ngày nay, có nhiều thương hiệu nước mắm tiếng nước như: nước mắm Khải Hoàn Phú Quốc, nước mắm Cát Hải, nước mắm 584 Nha Trang, loại nước mắm có hương vị đặc trưng riêng Nhiều công trình nghiên cứu sản xuất nước mắm thực nhằm rút ngắn thời gian lên men, tăng khả thủy ph n protein, làm tăng hương vị cho nước mắm Các công trình nghiên cứu cho thấy có mặt chủng vi khuẩn trình sản xuất nước mắm như: Bacillus sp, Staphylococcus sp, Streptococcus sp, Micrococcus sp, Pseudomonas sp,… mặt trình thủy phân protein cá mà có vai trò tạo hương thơm cho nước mắm Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên cứu thức tìm hiểu thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng vi khuẩn sinh hương nước mắm để ứng dụng sản xuất nước mắm thực tiễn Vì lý trên, trình thực tập nghiên cứu làm đồ án tốt nghiệp, thấy việc thực đề tài “Nghiên cứu, lựa chọn thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn sinh hương nước mắm Bacillus sp.VTPF4” cần thiết - Mục tiêu: Nghiên cứu, lựa chọn thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 nhằm mục đích tăng thu hàm lượng sinh khối - Nội dung nghiên cứu: + Nghiên cứu đặc tính chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 + Nghiên cứu, lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp + Nghiên cứu, lựa chọn thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 Trần Thị Xuyến - 1202 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương + Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 Trần Thị Xuyến - 1202 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp hàm lượng sinh khối ướt thu chủng Bacillus sp.VTPF4 cao sinh trưởng môi trường NB, tương ứng 3.42 x 7CFU/ml 6.0g/l Quan sát thấy sinh khối tăng dần theo thời gian nuôi cấy, sau 48 nuôi cấy mật độ tế bào đạt 7CFU ml Theo số tác giả dịch cá có đầy đủ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển, chẳng hạn protein, cacbonhydrat loại muối khoáng Theo Chandrashekar Deosthale đ công bố thành phần dịch chiết cá chứa 11.4% protein; 6.1% lipid; 0.8% chất khoáng nguyên tố vi lượng (Chandrashekar Deosthale, 1993) Như vậy, khác biệt mật độ tế bào ml chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 nghiên cứu môi trường khác không đáng kể Dựa kết thu được, lựa chọn môi trường NB làm môi trường nuôi cấy cho chủng Bacillus sp.VTPF4 3.3 Nghiên ứu ự họn thành phần môi trƣờng nuôi ấ thí h hợp ủ hủng vi huẩn sinh hƣơng Bacillus sp.VTPF4 Sau đ chọn thành phần môi trường nuôi cấy để nâng cao hiệu suất thu sinh khối tiến hành nghiên cứu thêm ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng bổ sung thêm vào môi trường lên men 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon Trong nguồn dinh dưỡng cung cấp cho trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn cacbon nguồn cung cấp lượng cung cấp lượng cho trình xây dựng cấu trúc tế bào tạo sản phẩm Nguồn cacbon bao gồm loại như: glucose, lactose, saccarose gelatin số đó, glucoza loại đường hầu hết vi khuẩn sử dụng thích hợp cho trình lên men tạo sinh khối tế bào Ở thí nghiệm với chủng Bacillus sp.VTPF4 nguồn cacbon ban đầu glucose có nồng độ 0,5% thí nghiệm thực với 1% glucose thay glucose loại nguồn cacbon khác lactoza, saccaroza gelatin Thí nghiệm tiến hành thực nuôi cấy nhiệt độ 35oC, giống bổ sung vào 5% (105 CFU/ml), thời gian nuôi cấy 48 Kết thể hình 3.3 Trần Thị Xuyến - 1202 35 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp Mật độ tế bào (107CFU/ml) 5.19 4.45 3.74 2.16 Glucoza Saccaroza Lactoza Gelatin Nguồn C bon Hình 3.3 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 Nguồn cacbon có ảnh hưởng đến trình tạo sinh khối, glucoza xác định có ảnh hưởng lớn đến trình tạo sinh khối chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 so với nguồn cacbon khác sử dụng cho nghiên cứu Một số tác giả đ nghiên cứu sử dụng gelatin làm nguồn cacbon cho trình phát triển chủng làm tăng mật độ tế bào sử dụng gelatin 1% để thay nguồn cacbon glucose môi trường NB không nhận thấy gia tăng mật độ tế bào chủng Theo Kanekar gelatin báo cáo nguồn cacbon nguồn Nitơ tốt phân lập tuyển chọn chủng Bacillus alkalophilus (Kanekar cs, 2002) Do với kết thu hình 3.3 sử dụng glucoza làm nguồn cacbon cho nghiên cứu 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ glucoza bổ sung Tiến hành thí nghiệm với nồng độ glucoza bổ sung 0.5%; 1%, 2%, 3%, bình tam giác 250ml có chứa ml môi trường NB đ bổ sung với nồng độ glucoza trên, nhiệt độ nuôi cấy 35oC, thời gian 48 giờ, tỷ lệ tiếp giống 5% Kết thể hình 3.4 Trần Thị Xuyến - 1202 36 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Mật độ tế bào (107CFU/ml) Khóa luận tốt nghiệp 5.8 5.57 5.6 5.4 5.31 5.19 5.2 4.8 4.66 4.6 4.4 4.2 0.5 Nồng độ g u oz bổ sung (%) Hình 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ glucoza bổ sung đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 Kết hình 3.4 cho thấy, chủng Bacillus sp.VTPF4 sử dụng nồng độ đường glucoza khác Với nồng độ đường glucoza sử dụng 2% thu mật độ tế bào cao nhất, đạt 5.57x107CFU/ml Khi tăng nồng độ đường lên đến 3% mật độ tế bào giảm xuống, 5.51x107CFU/ml Điều áp suất thẩm thấu bên môi trường cao tế bào vi sinh dẫn đến tượng co nguyên sinh Kết nghiên cứu tương tự kết công bố Yongsawatdigul sử dụng glucose bổ sung vào môi trường NB làm tăng khả phát triển vi khuẩn (Yongsawatdigul cs, 2007) Do vậy, từ kết nghiên cứu chọn nồng độ glucoza bổ sung vào môi trường nuôi cấy 2% glucoza 3.3.3.Ảnh hưởng nguồn Nitơ Theo tài liệu tham khảo chủng vi khuẩn ứng dụng sử dụng làm chế phẩm khởi động làm tăng trình thủy ph n có nhu cầu sử dụng nguồn Nitơ Để kiểm tra nguồn đạm có ảnh hưởng đến phát triển sinh trưởng tế bào tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Nitơ nồng độ Nitơ Nguồn Nitơ sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: Nitơ hữu (0.5% cao nấm men, 0.5% pepton, 0.5% bột nấm Trần Thị Xuyến - 1202 37 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp men bia thủy phân) Nitơ vô (0.5% NaNO3, 0.5% (NH4)2 SO4) bổ sung vào môi trường NB đ lựa chọn nguồn Cacbon Tiến hành lên men điều kiện nhiệt độ 35oC; giống bổ sung với tỷ lệ 5% Kết nghiên cứu thể bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 Nguồn Nitơ Mật độ tế bào (107CFU/ml) ĐC 5.84 Cao nấm men 5.95 Pepton 5.41 Bột nấm men thủy phân 5.06 NaNO3 3.81 (NH4)2SO4 1.66 Kết đ ra, đưa nguồn Nitơ vào không cải thiện cho việc tăng trưởng tế bào vi khuẩn Mật độ tế bào thay đổi môi trường có bổ sung thêm nguồn Nitơ hữu cơ, với nguồn Nitơ vô bổ sung vào không làm tăng phát triển tế bào Điều giải thích khả dịch chiết cá cơm đ chứa đủ hàm lượng đạm cần thiết cho tăng trưởng chủng, mà môi trường đ đủ nguồn dinh dưỡng cho phát triển vi sinh vật việc bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường làm giảm độ oxy hòa tan môi trường nuôi cấy dẫn đến việc môi trường không cung cấp đủ oxy cho tế bào vi sinh vật phát triển mà tế bào không tăng trưởng bị ức chế làm tế bào chết giảm mật độ tế bào Do vậy, lựa chọn không bổ sung thêm nguồn Nitơ vào môi trường NB cho chủng Bacillus sp.VTPF4 Trần Thị Xuyến - 1202 38 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến trình lên men Trong môi trường lên men, hàm lượng muối có ảnh hưởng định đến phát triển vi sinh vật Đ y yếu tố cần xác định cho phát triển chúng, nhiên hàm lượng muối thích hợp cho chủng yếu tố cần khảo sát Thí nghiệm khảo sát nồng độ NaCl bổ sung vào môi trường lên men đ lựa chọn, nồng độ muối bổ sung: 0; 5; 10; 15; 20; 25% Quan sát mật độ tế bào phương pháp đếm số tế bào khuẩn lạc hàm lượng sinh khối tế bào thu từ chọn nồng độ Mật độ tế bào (107CFU/ml) muối thích hợp cho phát triển chủng Bacillus sp.VTPF4 5.37 5.51 5.18 4.45 3.89 2.81 0 10 15 20 25 Nồng độ N C (%) Hình 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 Từ hình 3.5 thấy nồng độ muối bổ sung 5% Bacillus sp.VTPF4 đạt mật độ tế bào cao 5.51x107CFU ml tương ứng với hàm lượng sinh khối thu 6.4g l, 48 nuôi cấy Như vậy, với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng nồng độ muối đến tạo thành sinh khối chọn nồng độ muối bổ sung vào môi trường nuôi cấy nh n giống 5% NaCl Trần Thị Xuyến - 1202 39 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp 3.4 Nghiên ứu ự họn điều iện nuôi ấ thí h hợp ho hủng vi huẩn sinh hƣơng Bacillus sp.VTPF4 3.4.1 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp Nhiệt độ yếu tố quan trọng trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn Mỗi loài vi khuẩn có giới hạn nhiệt độ thích hợp cho trình sinh trưởng Nghiên cứu tìm nhiệt độ thích hợp với trình sinh trưởng chủng vi khuẩn có ý nghĩa quan trọng để nghiên cứu x y dựng quy trình nhân sinh khối Trong nghiên cứu này, chủng Bacillus sp.VTPF4 tiến hành nghiên cứu xác định nhiệt độ thích hợp cho trình sinh trưởng chủng điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau: 25 oC, 30oC, 35oC 40oC môi trường NB, thời gian nuôi cấy 48 Mật độ tế bào đưa vào ban đầu 5CFU/ml Khả phát triển chủng đánh giá thông qua xác định mật độ tế bào khuẩn lạc mọc đĩa thạch hàm lượng sinh khối thu sau 48 lên men trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển ủ hủng vi huẩn Bacillus sp.VTPF4 Thông số đánh giá Nhiệt độ Mật độ tế bào Hàm ƣợng sinh hối ƣớt (107CFU/ml) (g/l) 25oC 0.69 4.6 30oC 3.89 6.2 35oC 5.51 6.5 37oC 6.11 6.9 40oC 4.74 6.2 Kết nghiên cứu bảng 3.7 cho thấy chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 phát triển mạnh nhiệt độ 37 oC Kết tương tự công bố Trần Thị Xuyến - 1202 40 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp Sinsuwan (Sinsuwan cs, 2008) Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả phát triển chủng đáng kể, nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 37oC cho chủng Bacillus sp.VTPF4 3.4.2 Lựa chọn pH môi trường nuôi cấy thích hợp Trong trình nuôi cấy, chủng vi khuẩn sinh trưởng mạnh sinh khối tế bào tăng nhanh làm tăng lượng acid dịch nuôi cấy làm giảm pH dịch môi trường lên men Để lựa chọn pH môi trường ban đầu tối ưu cho phát triển chủng đ lựa chọn xác định ảnh hưởng pH giá trị pH khác 6.0; 6.5; 7.0; 7.5 Chủng Bacillus sp.VTPF4 nuôi cấy môi trường NB có bổ sung 5% muối, nhiệt độ nuôi cấy 37 oC Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn đánh giá thông qua xác định mật độ tế bào khuẩn lạc mọc đĩa thạch hàm lượng sinh khối thu sau 48 lên men (bảng 3.8) Bảng 3.8 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến phát triển ủ hủng vi huẩn sinh hƣơng Bacillus sp.VTPF4 Thông số đánh giá pH Mật độ tế bào (CFU/ml) Hàm ƣợng sinh hối ƣớt (g/ ) 6.0 1.74 x 106 5.7 6.5 7.53 x 106 6.0 7.0 8.14 x 107 7.3 7.5 5.93 x 107 6.4 Từ số liệu thu bảng 3.8 cho thấy chủng Bacillus sp.VTPF4 sinh trưởng tốt pH=7.0 đạt giá trị sinh khối cao Ở giá trị pH thấp 6.5 mật độ tế bào có giảm so với giá trị pH=7 Kết trùng với nghiên cứu Tanasupawat Hiraga (Tanasupawat, 1992 Hiraga, 2005) chủng Bacillus subtilis sinh trưởng tốt pH=7.0-7.2 Như vậy, với việc tìm giá trị pH thích hợp phục vụ cho nghiên cứu chúng Trần Thị Xuyến - 1202 41 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp lựa chọn pH=7 pH thích hợp cho chủng Bacillus sp.VTPF4 tuyển chọn 3.4.3 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp Tỷ lệ tiếp giống ảnh hưởng nhiều đến trình sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn tỷ lệ giống g y tượng thừa chất, hiệu suất thu hồi k m, nhiều g y cản trở trình trao đổi chất cần phải nghiên cứu cho tỷ lệ giống đưa vào thích hợp Chủng Bacillus sp.VTPF4 nhân giống qua cấp từ 12-16 (dựa số liệu tăng trưởng sinh khối biểu đồ thời gian), sau chuyển cấp lên men Chủng giống tiếp với tỷ lệ 3%; 5%; 7.5%; 10% 12% tương ứng với mật độ tế bào ban đầu 105CFU/ml, sau tiếp giống cấp mẫu tiến hành thực nghiệm điều kiện đ nghiên cứu trên, kết thể bảng 3.9 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng t ệ tiếp giống đến trình phát triển ủ chủng vi huẩn Bacillus sp.VTPF4 T lệ tiếp giống Thông số đánh giá Mật độ tế bào Hàm ƣợng sinh hối ƣớt (CFU/ml) (g/l) 3% 1.61 x 107 5.7 5% 8.40 x 107 6.9 7.5% 4.21 x 108 7.2 10% 1.82 x 109 7.5 12 % 1.05 x 108 7.3 (%) Từ kết nghiên cứu thấy chủng Bacillus sp.VTPF4 phát triển tốt đạt mật độ sinh khối cao nồng độ giống tiếp vào 10% giống, tăng tiếp nồng độ giống đến 12% dẫn đến nguồn dinh Trần Thị Xuyến - 1202 42 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp dưỡng bị cạn kiệt trình trao đổi chất kém, mật độ sinh khối tăng dẫn đến nhu cầu oxy chủng bị cạn kiệt dẫn đến tượng tế bào phát triển dẫn đến hiệu thu sinh khối thấp Với kết thí nghiệm này, chọn tỷ lệ tiếp giống 10% tỷ lệ tiếp giống thích hợp cho trình lên men thu sinh khối 3.4.4 Lựa chọn chế độ lắc thích hợp Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng chế độ khuấy đến chủng Bacillus sp.VTPF4 với tốc độ lắc thực 0; 50; 100; 200 250 vòng/phút Kết thu hình 3.6 Mật độ tế bào (108CFU/ml) 4.39 4.5 3.35 3.5 2.5 2.41 2.05 1.91 1.5 0.5 0 50 100 200 250 Chế độ ắ (vòng/phút) Hình 3.6 Ảnh hƣởng chế độ lắ đến khả phát triển chủng vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 Với nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố lắc tới phát triển chủng Bacillus sp.VTPF4, quan sát thấy chủng Bacillus sp.VTPF4 phát triển tốt tốc độ lắc 200 vòng/phút đạt mật độ tế bào 4.39 x 109 CFU ml Như vậy, lựa chọn chế độ lắc cho chủng Bacillus sp.VTPF4 200 vòng/phút Kết tương tự công bố Felsenstein ảnh hưởng chế độ lắc đến phát triển chủng vi khuẩn (Felsenstein, 1985) Từ kết nghiên cứu, chọn chế độ lắc 200 vòng/phút nuôi cấy chủng Bacillus sp.VTPF4 Trần Thị Xuyến - 1202 43 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp 3.4.5 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp Thời gian lên men có ảnh hưởng lớn tới hiệu suất sinh tổng hợp sinh khối Nếu men sớm hiệu xuất thu hối sinh khối thấp, không tận dụng hết nguồn chất dinh dưỡng có môi trường, k o dài thời gian lên men nguồn dinh dưỡng bị cạn kiệt ảnh hưởng đến hiệu suất thu sinh khối Tiến hành nghiên cứu lên men chủng Bacillus sp.VTPF4 với khoảng thời gian từ đến nuôi cấy môi trường NB có bổ sung 5% muối nuôi cấy 37 oC, pH=7 Khả sinh trưởng chủng đánh giá thông qua số OD 62 nm thời điểm khác trình nuôi cấy Số liệu nghiên cứu thể OD 620nm hình 3.7 3.5 2.5 1.5 0.5 0 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Thời gi n ên men( giờ) Hình 3.7 Ảnh hƣởng thời gi n nuôi ấ đến trình phát triển ủ hủng vi huẩn Bacillus sp.VTPF4 Kết thí nghiệm cho thấy sinh khối thu tăng dần theo thời gian nuôi cấy Mật độ tế bào đạt cao sau 32-36 nuôi cấy với chủng Bacillus sp.VTPF4, đạt 5.51 x 109 CFU ml hàm lượng sinh khối thu 8.6g l Sau khoảng thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào tế bào chủng không tăng bắt đầu giảm Điều hàm lượng chất dinh dưỡng môi trường nuôi cấy ít, mật độ tế bào ml cao tế bào bắt đầu chết thiếu chất dinh dưỡng Kết phù hợp với lý thuyết Trần Thị Xuyến - 1202 44 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương tốc độ sinh trưởng chủng vi vật Như chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 36 nuôi cấy với chủng Bacillus sp.VTPF4 Trần Thị Xuyến - 1202 45 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Chủng Bacillus sp.VTPF4 có khả chịu mặn sinh hương tốt lên men sản xuất nước mắm - Chúng đ lựa chọn môi trường NB, môi trường thích hợp cho chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4 - Lựa chọn thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4: + Nguồn Cacbon chủ yếu vi khuẩn Bacillus sp.VTPF4 sử dụng cung cấp từ đường glucoza, lượng glocoza cần thiết bổ sung vào môi trường NB 2% + Lựa chọn nồng độ muối bổ sung vào môi trường nh n giống 5% NaCl + Không cần thiết bổ sung hàm lượng Nitơ vào môi trường nuôi cấy, mật độ tế bào vào hàm lượng sinh khối thu thay đổi không đáng kể so với không bổ sung Nitơ - Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn sinh hương Bacillus sp.VTPF4: + pH môi trường thích hợp 7.0 + Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 37oC + Tỷ lệ tiếp giống thích hợp 10% + Thời gian nuôi cấy 36 + Ở chế độ lắc tốt 200 vòng/phút Kiến nghị Do vi khuẩn sinh hương có vai trò quan trọng việc tạo hương vị đặc trưng cho nước mắm, nên muốn đề xuất số hướng nghiên cứu tiếp theo: - Nghiên cứu thêm chủng vi khuẩn khác có khả sinh hương sản xuất nước mắm Trần Thị Xuyến - 1202 46 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương - Nghiên cứu dạng chế phẩm từ vi sinh vật bổ sung trình lên men để tạo hương nước mắm Trần Thị Xuyến - 1202 47 GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Việt Nam Nguyễn Thị Việt Anh, Bùi Thị Thúy Hà, Nguyễn Đình Thông Nguyễn Thanh Hùng (2013) Tuyển chọn vi khuẩn Lactic Bacillus có khả chịu muối cao ứng dụng cho trình sinh hương sản xuất nước mắm Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013 Quyển 2: 54-58 Nguyễn L n Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tập 2, 1976 Nguyễn Xuân Duy Nguyễn Anh Tuấn (2013) Thành phần axít amin chất bay có số loại nước mắm thương mại Việt Nam Tạp chí Khoa học Phát triển tập 11, số 7: 1030-1036 Tài liệu nƣớc Barker, H A (1956) In Bacterial Fermentation John Wiley & Sons, Inc New York: Oxford Univ Press Beddows, C G., Ardeshir, A G and Daud, W J (1979) Journal Science Food Agriculture 30: 1097 Chandrashekar, K and Deosthale, Y (1993) Proximate composition, amino acid, mineral, and trace element content of the edible muscle of 20 Indian fish species Journal of Food Composition and Analysis 6(2): 195-200 Cho, Y J and Choi, Y J (1999) Special Report for Quality Estimation of Anchovy Sauce Submitted to the Ministry of Marine and Fisheries, Korea Curioni, P and Bosset, J (2002) Key odorants in various cheese types as determined by gas chromatography-olfactometry International Dairy Journal 12(12): 959-984 Do-Won Jeong, Hye-Rim Kim, Gwangsick Jung, Seulhwa Han, CheongTae Kim and Lee, J.-H (2014) Bacterial Community Migration in the Trần Thị Xuyến - 1202 48 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Ripening of Doenjang, a Traditional Korean Fermented Soybean Food J Microbiol Biotechnol 24(5): 648-660 Fukami, K., Satomi, M., Funatsu, Y., Kawasaki, K.-I and Watabe, S (2004) Characterization and distribution of Staphylococcus sp implicated for improvement of fish sauce odor Fisheries Science 70(5): 916-923 Hiraga, K., Nishikata, Y., Namwong, S., Tanasupawat, S., Takada, K and Oda, K (2005) Purification and characterization of serine proteinase from a halophilic bacterium, Filobacillus sp RF2-5 Bioscience, biotechnology, and biochemistry 69(1): 38-44 Kanekar, P., Nilegaonkar, S., Sarnaik, S and Kelkar, A (2002) Optimization of protease activity of alkaliphilic bacteria isolated from an alkaline lake in India Bioresource Technology 85(1): 87-93 10 Ólafsdóttir, G and Fleurence, J (1998) Evaluation of fish freshness using volatile compounds- Classification of volatile compounds in fish In: Methods to Determine the Freshness of Fish in Research and Industry, Proceedings of the Final meeting of the Concerted Action "Evaluation of Fish Freshness" AIR3 CT94 2283.Nantes Nov, 1997 International Institute of Refrigeration, 55-69: 12-14 11 Robert, H., Le Marrec, C., Blanco, C and Jebbar, M (2000) Glycine betaine, carnitine, and choline enhance salinity tolerance and prevent the accumulation of sodium to a level inhibiting growth of Tetragenococcus halophila Appl Environ Microbiol 66(2): 509-17 12 Thongthai, C., McGenity, T J., Suntinanalert, P and Grant, W D (1992) Isolation and characterization of an extremely halophilic archaeobacterium from traditionally fermented Thai fish sauce (nampla) Letters in Applied Microbiology 14(3): 111-114 13 Yongsawatdigul, J., Rodtong, S and Raksakulthai, N (2007) Acceleration of Thai fish sauce fermentation using proteinases and bacterial starter cultures Journal of food science 72(9): M382-M390 Trần Thị Xuyến - 1202 49 [...]... nuôi cấy đạt khoảng 105CFU ml Điều kiện nuôi cấy 35oC, thời gian 48 giờ Dựa vào khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus sp. VTPF4 trên các nồng độ muối khác nhau sẽ lựa chọn được môi trường nuôi cấy tối ưu 2.2.1.2 Khảo sát sơ bộ khả năng tạo hương của chủng vi khuẩn Bacillus sp. VTPF4 Lấy 1 vòng que cấy sinh khối của chủng vi khuẩn Bacillus sp. VTPF4 bổ sung vào ống nghiệm (giống cấp 1) chứa 5ml môi trường. .. que cấy, đèn cồn, que trang 2 2 Phƣơng pháp nghiên ứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh 2.2.1.1 Đánh giá khả năng phát triển của chủng Bacillus sp. VTPF4 trên môi trường nồng độ muối cao Lấy 1 vòng que cấy sinh khối của chủng vi khuẩn Bacillus sp. VTPF4 bổ sung vào ống nghiệm (giống cấp 1) chứa 5 ml môi trường lỏng NB Sau 24 giờ, nhiệt độ 35oC, bổ sung 5ml dịch nuôi cấy chủng vào bình tam giác chứa 100ml môi trường. .. (Bannerman và cs, 1991) 1.1.5 Vai trò của vi sinh vật trong quá trình lên men và tạo hương nước mắm Nước mắm có nồng độ muối rất cao 25-30%, do vậy hệ vi sinh vật phân lập từ nước mắm đều ưa muối hoặc chịu muối (Thongthai và cs, 1992) Vi khuẩn đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình thủy phân và tạo hương nước mắm Do vậy, nếu lên men nước mắm trong điều kiện vô trùng sẽ không tạo được hương Vi khuẩn. .. chế biến từ cá như nước mắm, mắm tôm và cá lên men (cá muối) Vi khuẩn trong lên men nước mắm có thể chia làm 2 nhóm chính: - Vi khuẩn tạo enzyme thủy phân protein: Bacillus sp, Pseudomonas sp, Micrococcus sp, Staphylococcus sp, Pediococcus sp, Tetragenococcus halophililus, Streptococcus sp, Halococcus sp, Halobacterium salinarium, Halobacterium cutirubrum - Vi khuẩn tạo hương cho nước mắm: Micrococcus,... GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp vi lượng từ các chất dinh dưỡng hữu cơ thiên nhiên, các hóa chất vô cơ, nước máy hay ngay từ trong các dụng cụ nuôi cấy bằng thủy tinh Chỉ trong những trường hợp đặc biệt mới cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật 1.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bacillus sp 1.2.3.1 Ảnh hưởng của... một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá thành thấp nhất đối với chủng vi sinh vật cho trước Vi khuẩn muốn sinh trưởng phát triển tốt thì trong môi trường phải có đầy đủ các thành phần chủ yếu như C, H, N, O Mặt khác trong thành phần cũng phải có các nguyên tố vi lượng và một số tiền chất khác để kích thích sự... Hồng Phương PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về nƣớc mắm 1.1.1 Giới thiệu về nước mắm Nước mắm được đặc trưng bởi hương và vị, thường sử dụng làm gia vị khi nấu ăn và nước chấm Nếu định nghĩa theo hóa sinh thì nước mắm là dung dịch muối và protein hòa tan ở dạng acid amin và các peptid Nước nắm tạo thành nhờ quá trình lên men của vi sinh vật ưa muối, chúng tạo nên hương và vị cho nước. .. GVHD: ThS Bùi Thị Hồng Phương Khóa luận tốt nghiệp PHẦN III: KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu á định khả năng hịu muối, khả năng sinh hƣơng và đặ điểm hình thái của chủng Bacillus sp. VTPF4 3.1.1 Nghiên cứu khả năng chịu muối của chủng vi khuẩn Bacillus sp. VTPF4 Muối là thành phần quan trọng và không thể thiếu được trong nước mắm Muối có vai trò ức chế vi sinh vật gây thối rữa và bảo quản sản phẩm, hàm... 5 nhóm chính: Vi khuẩn phát triển ở nồng độ: nhỏ hơn 2M hoặc ~1% muối là vi khuẩn không ưa muối; 0.2-0.5M hoặc ~1-3% là vi khuẩn ưa muối nhẹ; 0.5-2.5M hoặc ∼3-15% là vi khuẩn ưa muối trung bình; 1.5-4.0M hoặc ∼9-23% là vi khuẩn khá ưa muối; 2.5-5.2M hoặc ∼15-32% là vi khuẩn rất ưa muối Vi khuẩn ưa muối có thể phát triển ở cả môi trường có nồng độ muối cao và môi trường không có muối Vi khuẩn ưa muối... phụ thuộc vào nhiều yếu tố Độ dài pha lag chủ yếu phụ thuộc vào ba yếu tố chính là độ tuổi của chủng giống, lượng giống, thành phần môi trường Enzyme vi sinh vật được sinh ra ở pha lũy thừa Protease ngoại bào của vi khuẩn Bacillus được tăng cường sản xuất và tiết ra ở cuối pha lũy thừa 1.2.3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn Bacillus sp chịu tác động của ion H+ và OH-