101 Chương Các Phương pháp Chọn giống Thực vật I Các phương pháp chọn lọc Chọn lọc phương pháp quan trọng ứng dụng rộng rãi chọn giống Có hai kiểu chọn lọc bản, là: chọn lọc theo kiểu hình chọn lọc theo kiểu gene; tất dựa sở nguồn biến dị di truyền sinh vật Ngày biết rằng, có biến dị di truyền (các đột biến, biến dị tổ hợp) đóng vai trò nguồn cung cấp nguyên liệu cho trình chọn lọc tiến hoá sinh vật Trong Darwin xây dựng thuyết chọn lọc tự nhiên chọn lọc nhân tạo, ông phân bịêt biến dị di truyền (biến dị không xác định) biến dị không di truyền (biến dị xác định), chưa giải thích nguyên nhân chúng Về vai trò sáng tạo chọn lọc, + Chọn lọc tự nhiên Theo quan điểm Darwin, sinh vật không ngừng phát sinh biến dị cá thể trình sinh sản tác dụng điều kiện môi trường sống Chỉ biến dị có lợi cho thân sinh vật giữ lại, biến dị lợi bị đào thải Chọn lọc tự nhiên thường xuyên diễn ra, giúp cho sinh vật mang biến đổi thích nghi thể ngày hợp lý Có trường hợp chọn lọc tự nhiên thúc đẩy hỗ trợ cho chọn lọc nhân tạo, làm cho trình chọn lọc phát huy nhanh Ví dụ, đặc tính chống chịu sâu bệnh, chịu hạn trồng vừa có lợi cho người, vừa có lợi cho sinh vật Ngược lại, số đặc tính rụng hạt ngũ cốc, chất lượng nông sản cao chọn lọc tự nhiên chọn lọc nhân tạo mâu thuẫn Do thúc đẩy trình hình thành giống xảy chậm Vì công tác chọn giống, chọn lọc nhân tạo có tác dụng vô quan trọng để tạo giống + Chọn lọc nhân tạo Darwin người tổng kết đầy đủ vai trò tác dụng tác dụng nhân tạo Theo Darwin, biến dị, di truyền chọn lọc ba yếu tố định tiến hoá sinh vật Chọn lọc nhân tạo tích luỹ biến dị có lợi loại bỏ biến dị lợi cho người Chính 102 chọn lọc nhân tạo tạo nên đặc điểm thích nghi kỳ diệu thể vật nuôi, trồng (phù hợp với thị hiếu thẩm mỹ nhu cầu kinh tế người) Nếu chọn lọc tự nhiên, động lực chọn lọc đấu tranh sinh tồn, chọn lọc nhân tạo động lực thúc đẩy lợi ích kinh tế người II Các nhân tố ảnh hưởng đến chọn lọc Hệ thống sinh sản trồng Ở tự thụ phấn(autogamous), đặc điểm sinh học cấu tạo hoa, việc lai tạo với trồng khác loài gặp nhiều khó khăn Mặt khác, phần lớn tự thụ phấn đồng hợp tử Hạt giống thương phẩm đựơc sản xuất phương pháp tự thụ phấn Còn giao phấn hay thụ phấn chéo, việc lai tạo tự nhiên xảy thuận lợi Đặc điểm dị giao dị hợp tử, hiệu ứng trội đóng góp việc hình thành tính trạng Phương pháp chọn giống sinh sản vô tính nói chung biến dị xảy tạo nên kiểu gene đồng hợp tử dị hợp tử Chọn kiểu gene mong muốn môi trường định tạo dòng vô tính phục vụ sản xuất Ở nhân tố môi trường có tác động định đến hệ thống sinh sản Hiện tượng ưu lai Ưu lai tượng thường gặp tất loài giao phấn số loài tự thụ như: đậu tương, cà chua, lúa mì, lúa Hạt lai thương mại áp dụng rộng rãi tự thụ phấn giao phấn (xem chương 4) Cấu trúc máy di truyền tế bào Mức độ đa bội có ảnh hưởng định đến chiến lược chọn giống trồng: tứ bội thể dùng thông dụng loài thức ăn gia súc nhằm làm tăng sản lượng chất khô đặc tính tốt khác Việc chọn lọc tính trạng khả chống chịu sâu bệnh củ cải đường, khoai tây cách chọn dạng tam bội tỏ có hiệu Tính trạng số lượng tính trạng chất lượng Tuỳ theo tính trạng nhà chọn giống quan tâm tính trạng số lượng hay tính trạng chất lượng mà có phương pháp chọn lọc khác Thông thường, tính trạng chất lượng kiểm tra gene, tính trạng số lượng nhiều gene kiểm tra chịu ảnh hưởng lớn môi trường tác động qua lại gene Đối với tính trạng số lượng, phương pháp chọn giống thường áp 103 dụng chọn lọc theo chu kỳ hay chọn lọc hồi quy Càng có nhiều gene tham gia có hôi tạo ngẫu nhiên để đạt tổ hợp gene tốt chu kỳ chọn lọc Do cần có phối hợp chọn lọc nhằm làm tăng tổ hợp tốt chu kỳ Trong trường hợp này, phương pháp chọn giống hồi quy giúp thu tính trạng tốt chu kỳ Sự hoạt động gene (xem sở di truyền học tượng ưu lai, chương 4) III Các nguyên tắc chọn lọc Ngoài nguyên nhân khách quan ảnh hưởng đến trình chọn lọc mức độ biến dị tính trạng chọn phương pháp chọn lọc, nguyên nhân chủ quan góp phần quan trọng mang tính định, cần tuân thủ nguyên tắc chọn lọc (1) Có mục tiêu phương hướng: Mục tiêu phương hướng nhà chọn giống cụ thể rõ ràng công tác chọn giống nhanh chóng có hiệu (2) Chọn vật liệu khởi đầu thích hợp: Nguyên tắc mang tính định công tác chọn giống Ví dụ, muốn tạo trồng có tính chịu rét, chịu hạn, chịu mặn khả chống chịu sâu bệnh v.v cần chọn vật liệu có gene chống chịu đặc tính cần thực tiễn sản xuất thừa nhận đặc tính quy mô lớn (3) Cần dựa vào tính trạng trực tiếp tính trạng tổng hợp: Các tính trạng có mối quan hệ mật thiết với nhau, tương quan phụ thuộc vào nhiều yếu tố Việc phát mối tương quan sớm kết chọn lọc nhanh nhiêu Ví dụ, tính trạng chịu hạn đặc điểm cấu tạo rễ đặc điểm kích thước lá, đường kính lá, đặc điểm hình dáng góp phần quan trọng cho tính trạng tổng hợp chịu hạn trồng (4) Vật liệu chọn giống cần đảm bảo trồng điều kiện đồng thích hợp: Đây nguyên tắc bắt buộc, có điều kiện phù hợp vậy, đặc tính hay tính trạng giống trồng biểu thông qua công việc đánh giá, trình chọn lọc đảm bảo tính khách quan xác (5) Ruộng chọn giống cần áp dụng biện pháp kỹ thuật phù hợp: Muốn đánh giá tiềm năng suất giống trồng, cần áp dụng biện pháp kỹ thuật tối ưu đất đai, thời vụ phân bón, tưới tiêu Còn muốn đánh giá giống điều kiện sản xuất áp dụng quy trình kỹ thuật sản xuất mà ưu tiên 104 việc chọn lọc cho giống ngày trở nên chủng (6) Cần chọn lọc theo mục tiêu đề phải chọn lọc môi trường phù hợp: Chẳng hạn, việc chọn giống chịu mặn, chịu úng, chịu hạn vật liệu chọn giống cần trồng điều kiện tự nhiên tương ứng như: mặn, úng, hạn Hoặc đánh giá khả kháng bệnh vậy, vật liệu chọn tạo cần gieo trồng mùa vụ có dịch bệnh phát sinh mạnh (7) Kết hợp chọn lọc phòng đồng ruộng suốt thời kỳ sinh trưởng giống, giống trồng chọn cách nhanh chóng chuẩn xác IV Sơ lược phương pháp chọn giống truyền thống đại thông dụng Một số phương pháp chọn giống truyền thống Chọn giống trình liên tục để thoả mãn nhu cầu thay đổi nông nghiệp Nói chung, phương pháp chọn giống truyền thống tương đối phổ biến, tái tổ hợp kiểu gene ưu tú khâu then chốt để tạo vật liệu chọn giống cho trình chọn lọc Các phương pháp chọn giống truyền thống dựa vào tái tổ hợp gene nhiễm sắc thể thông qua sinh sản hữu tính sinh vật (tuân theo nguyên lý di truyền cổ điển Mendel Morgan) Các quy trình chọn giống khác sử dụng cho kiểu trồng khác nhau, tuỳ thuộc vào phương thức sinh sản tự thụ phấn hay giao phấn Đối với lúa, phương pháp chọn giống theo phả hệ thông dụng Các bố mẹ chọn kỹ lưỡng lai thông qua thụ phấn tay (Hình 6.1) Trong chương trình chọn giống kháng, thông thường dạng bố mẹ giống cải tiến dạng giống kháng loài hoang dại Phải vài hệ lai chọn lọc để chuyển gene kháng cho dạng bố mẹ cải tiến phục hồi đặc tính mong muốn dạng bố mẹ cải tiến (năng suất, chất lượng hạt, v.v.) Tại Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI, đặt Manila - Philippines), năm có tới hàng chục ngàn dòng chọn giống kiểm tra lưu giữ khả kháng rầy nâu sâu hại Tại lai tạo phóng thích nhiều giống lúa (IR-8, IR-36, IR-64, ) góp phần tạo nên "cách mạng xanh" năm 1960 1970 nước phát triển 105 Hình 6.1 Hình trên: Hoa lúa, khử nhị đực tiến hành lai hai giống lúa thông qua thụ phấn tay Hình dưới: Một giống lúa bán lùn, suất cao gọi IR-8 (trái), phần cách mạng sanh lần thứ hai, IRRI tạo cách lai chéo hai dòng lúa bố mẹ: PETA từ Indonesia (giữa) DGWG từ Trung Quốc (phải) Với thân thấp cứng hơn, giống lúa mang to không bị đổ Một số phương pháp chọn giống đại Sự phát triển công nghệ sinh học (CNSH) vài thập niên gần đưa lại kiểu quy trình chọn giống Trong chọn lọc với hỗ trợ marker (marker-assisted selection), marker DNA liên kết với tính trạng quan tâm (ví dụ gene kháng côn trùng) sử dụng để cải tiến hiệu chọn giống Các marker DNA hỗ trợ cho việc phân tích số lượng, tác dụng đinh khu nhiễm sắc thể gene thứ yếu thực vật, thông qua trình gọi phân tích locus tính trạng số lượng (quantitative trait loci = QTL) Kỹ thuật di truyền (genetic engineering) cho phép sử dụng sinh vật để làm nguồn cung cấp tính kháng Chẳng hạn, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) nguồn cung cấp gene mã hoá độc tố diệt côn trùng dùng để tạo giống lúa chuyển gene kháng loại sâu đục thân (xem Hình 6.2) Vấn đề thảo luận kỹ chương CNSH bao gồm loạt phương pháp quy trình sử dụng thể sống hệ thống sinh học biến đổi để tạo sản phẩm tăng suất trồng, vật nuôi Trong trồng trọt cải 106 lương giống trồng, hầu hết quy trình CNSH sử dụng nuôi cấy mô tế bào in vitro từ mảnh mô, tế bào phân lập, mô sẹo, tế bào trần mô phôi để thực trình biến đổi, sau cho tái sinh hoàn chỉnh Điều cần thiết phải hiểu nắm vững tái sinh từ nuôi cấy mô loại xác định trước áp dụng để bổ sung cho phương pháp chọn tạo giống hành kết nuôi cấy mô tế bào chục năm qua cho thấy nuôi cấy tế bào từ loài trồng khác hay kiểu gene khác nội loài, chí từ phận khác có phản ứng khác kỹ thuật nuôi cấy cụ thể Điều cản trở việc xây dựng qui trình đồng để áp dụng thường xuyên chương trình chọn giống cho nhiều loài trồng Để ứng dụng kỹ thuật chương trình chọn tạo giống cần phải vạch quy trình cụ thể cho loại vật liệu di truyền môi trường nuôi cấy 2.1 Nuôi cấy mô tế bào Đầu kỷ 20, Haberlandt nhấn mạnh tính toàn tế bào soma thực vật khả tạo hoàn chỉnh đường nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc tái sinh hoàn chỉnh từ tế bào đơn tế bào trần (protoplast) trở thành thực Nuôi cấy mô tế bào kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật phân lập hay mảnh mô thực vật tách rời môi trường dinh dưỡng điều kiện vô trùng Sau đó, mô cấy cho tái sinh thành hoàn chỉnh Người ta xây dựng quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh cho số loài thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan, số ăn v.v Đối với phần lớn trồng đồng ruộng, đậu lấy hạt việc thiết lập quy trình để áp dụng rộng rãi khó nhiều Ở loài tần số tái sinh thấp kết tái sinh từ nuôi cấy không thay đổi theo loài mà phụ thuộc vào kiểu gene loài, nguồn mô cấy, tuổi sức khoẻ mô cấy, môi trường dinh dưỡng nhiều yếu tố khác Nhìn chung, công nghệ nuôi cấy mô tế bào cho phép nhân nhanh kiểu gene có giá trị hay vật liệu chọn giống môi trường có kiểm soát Một số khả ứng dụng nhân nhanh trồng là: Nhân quy mô lớn kiểu gene dị hợp tử, nhân kiểu gene tự bất hợp, nhân bố mẹ bất dục chương trình chọn giống lai, nhân vật liệu bệnh, bảo quản trao đổi nguồn gene quốc tế Ở giới thiệu sơ lược số kỹ thuật nuôi cấy in vitro liên quan trực tiếp tới trình chọn giống (1) Nuôi cấy phôi, noãn thụ phấn in vitro Các nhà chọn giống chủ yếu tận dụng biến dị di truyền 107 có nguồn gene trồng trọt cách sử dụng nhiều sơ đồ lai chọn lọc khác Tuy nhiên với thâm canh độc canh, kiểu gene chọn lọc tính trạng có ý nghĩa kinh tế biến dị di truyền ngày giảm nguồn gene trồng trọt Thậm chí số trường hợp, nguồn biến dị số tính trạng có ý nghĩa kinh tế không đủ thoả mãn, ví dụ: tính kháng bệnh vàng lụi, sâu đục thân, chịu mặn lúa Để khắc phục vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến suất, nhà chọn giống cần có nguồn gene kháng sâu bệnh từ loài hoang dại thân thuộc không thân thuộc Một khó khăn lớn sử dụng loài hoang dại để lai với trồng tính bất hợp lai Trong số trường hợp, phôi lai từ tổ hợp lai loài có quan hệ xa thường yếu khả sống cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ không đầy đủ chúng thường bị chết thời gian ngắn sau hình thành hợp tử phát triển thành hạt có khả sống Vì vậy, nuôi cấy phôi hay cứu phôi phương pháp để khắc phục hàng rào bất hợp, bảo đảm để phôi non sinh trưởng, nảy mần, phát triển thành Thông qua sử dụng phương pháp người ta tạo nhiều lai khác loài nhiều loại trồng lúa mì, lúa nước, đại mạch, bông, đậu, đỗ, loài ăn quả, cảnh nhờ nhiều gene có ích chuyển vào trồng Noãn thụ tinh nuôi cấy để cứu phôi từ tổ hợp lai xa mà không cần tách phôi khỏi noãn Noãn chứa phôi lai non tách sau thụ tinh điều kiện vô trùng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng Bằng đường nuôi cấy noãn phôi nuôi cấy giai đoạn sớm so với nuôi cấy phôi tách rời Hơn nữa, phôi phát triển noãn có môi trường hoá học lý học thuận lợi phôi nuôi cấy bên noãn Thụ phấn thụ tinh in vitro gồm việc thu nhập noãn chưa thụ tinh, cấy noãn môi trường dinh dưỡng điều kiện vô trùng, thụ phấn cho noãn với hạt phấn tươi Ống phấn xuyên qua thành noãn túi phôi thụ tinh cho tế bào trứng Phương pháp áp dụng để tạo lai loài mà ống phấn sinh trưởng xuyên vào noãn bình thường sau thụ phấn (2) Nuôi cấy bao phấn sản xuất đơn bội: Trong phần lớn chương trình chọn giống việc tạo giống cải tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F2 lớn chọn lọc dòng mong muốn hệ phân ly từ F2 đến F7 để cuối tạo dòng đồng hợp tử Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn kỹ thuật hữu hiệu để tạo dòng đồng hợp tử từ hệ (dòng đơn bội kép), 108 tiết kiệm nguồn lực rút ngắn thời gian cần thiết để tạo giống Nuôi cấy bao phấn kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục môi trường dinh dưỡng để tạo đơn bội Số nhiễm sắc thể đơn bội nhân đôi để tạo lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi thể đơn bội kép Việc nuôi cấy bao phấn có ích nhà chọn giống đơn bội kép sử dụng để làm dòng tự thụ phấn giao phấn Thời gian cần thiết để tạo giống hay dòng tự phối phương pháp đơn bội kép rút ngắn nhiều hệ so với phương pháp truyền thống Các dòng đơn bội kép tạo hội để cải thiện hiệu chọn lọc nhiều tính trạng quần thể phương sai trội, đồng thời gene lặn biểu kiểu hình Kỹ thuật áp dụng thành công Trung Quốc việc tạo giống lúa lúa mì Tuy nhiên, hạn chế việc áp dụng rộng rãi phương pháp khả nuôi cấy khó tính đặc thù cao kiểu gene Ví dụ, nhà chọn giống lúa Indica sử dụng kỹ thuật có hiệu nhà chọn giống lúa Japonica kiểu gene Indica khó nuôi cấy hạt phấn bị ảnh hưởng giai đoạn phát triển bao phấn, điều kiện sinh lý cho phấn, điều kiện xử lý trước nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy hiệu lưỡng bội hoá colchicine (3) Biến dị dòng soma chọn lọc dòng tế bào: Ban đầu nuôi cấy mô sử dụng làm kỹ thuật để tạo sinh khối phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt dồng bố mẹ ban đầu giống ưu tú Tuy nhiên, với thời gian công trình nghiên cứu nhiều loài trồng có giá trị kinh tế người ta thấy tế bào mô nuôi cấy môi trường nhân tạo thường xuất biến đổi di truyền bao gồm số lượng cấu trúc nhiếm sắc thể, xếp lại nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v Các biến dị truyền lại cho tái sinh Tập hợp biến dị di truyền hình thành trình nuôi cấy gọi biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin Scowcroft, 1983) Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng loài cây, kiểu gene loài mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, tính ổn định genome Như thân nuôi cấy mô tế bào nguồn biến dị di truyền quan trọng, mẻ phong phú điều kiện thích ứng có ích cho cải thiện giống trồng Một số thể biến dị dòng soma có ích phân lập, khả để kháng virus Fiji, bệnh đốm vàng viền nâu bệnh sương mai mía (Heinz cộng sự, 1977); khả kháng bệnh đốm nhỏ ngô (Bretell Ingram, 1979); kháng 109 sương mai khoai tây (Shepard cộng sự, 1980); chịu hạn chịu lạnh lúa (Lê trần Bình cs, 1996) Một ưu điểm biến dị di truyền trình nuôi cấy khả chọn lọc dòng tế bào in vitro Có thể nuôi cấy xử lý hàng triệu tế bào không gian hạn chế, chẳng hạn đĩa petri chọn lọc cách xử lý tế bào nuôi cấy điều kiện bất lợi tác nhân chọn lọc Cũng kết hợp xử lý đột biến nuôi cấy để tăng tần số biến dị di truyền Tuy nhiên, tính trạng biểu mức tế bào xác định cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm đặc tính kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại sắt, nhôm, axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, yếu tố dinh dưỡng khả kháng độc tố tác nhân gây bệnh tạo Các kiểu gene phân lập kháng với điều kiện bất lợi sử dụng trực tiếp chương trình chọn giống 2.2 Lai tế bào soma hay dung hợp tế bào trần Trong phương pháp chọn tạo giống truyền thống lai hữu tính phương pháp để tạo biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử Tuy nhiên, việc lai hữu tính thực cá thể loài hay loài có quan hệ thân thuộc Lai loài có quan hệ xa thường khó khăn hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính hữu dụng kỹ thuật lai việc tăng nguồn biến dị di truyền cần thiết cho việc cải lương trồng Vì phương pháp đề xuất Keller Melchers (1973) nhằm khắc phục hàng rào lai hữu tính loài có quan hệ họ hàng xa phương pháp dung hợp tế bào soma hay dung hợp tế bào trần Đó kỹ thuật cho phép hợp tế bào soma thành tế bào cá thể hoặ loài khác nhau, sau cho tái sinh lai từ tế bào dung hợp Trong lai hữu tính, tính trạng liên quan DNA bào quan kiểm soát hoàn toàn giống mẹ tổ hợp quan tử bố mẹ Trong dung hợp tế bào trần, khả dung hợp nhân, có khả xảy hỗn hợp tế bào chất, hình thành tổ hợp di truyền hoàn toàn Ty thể lạp thể hai tế bào khác hợp tái tổ hợp tạo tế bào dị tế bào chất, gọi cybrid Như vậy, đường lai soma người ta thu tổ hợp lạp thể hay ty thể tương tác nhân tế bào chất Dung hợp tế bào trần trình nhiều giai đoạn, bao gồm việc phân lập tế bào trần từ loài khác nhau, dung hợp tế bào trần từ hai loài khác nhau, giám định, nhân sản phẩm dung hợp cuối tái sinh lai hữu dục sản phẩm dung hợp 110 Lai soma sử dụng có hiệu để kết hợp khả kháng bệnh virus khoai tây từ kiểu gene loài từ loài khác (Venzen, 1994) Lai soma phương tiện có hiệu để chuyển bất dục đực tế bào chất đa dạng hoá nguồn bất dục việc tạo giống lai 2.3 Chuyển gene hay kỹ thuật di truyền Kỹ thuật di truyền thực vật chuyển đoạn DNA lạ, thường gene có chức mã hoá cho thông tin hay đặc điểm có lợi định vào tế bào thực vật khả kháng sâu hại, kháng virus hay kháng thuốc trừ cỏ Cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gene lạ lồng vào genome, biểu kiểu hình va di truyền ổn định gọi chuyển gene Gene lạ có nguồn gốc từ vi sinh vật thực vật, động vật, chí gene tổng hợp Quá trình chuyển gene bao gồm nhiều bước: xác định phân lập gene có ích, nhân gene, chuyển gene vào tế bào thực vật, tái sinh tế bào chuyển nạp thành hoàn chỉnh đánh giá biểu gene Trong bước trên, kỹ thuật chuyển gene đóng vai trò định kết chuyển gene Chuyển gene vào tế bào thực vật thực gián tiếp thông qua vector hay trực tiếp Sau ví dụ chuyển qua thông qua Ti-plasmid vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens A tumefaciens vi khuẩn gây khối u hai mầm phản ứng hình thành khối u kết kiện chuyển gene tự nhiên Mấu chốt hình thành khối u Ti-plastmid (Ti: tumor inducing) vi khuẩn chứa gene mã hoá sinh tổng hợp horrmon (auxin cytokinin) chịu trách nhiệm cho hình thành khối u Các gene nằm vùng T-DNA (transfered DNA) plasmid Khi plasmid xâm nhập vào tế bào cây, T-DNA chuyển vào genome Đoạn T-DNA yếu tố di truyền vận động trình chuyển gene Ý nghĩa Agrobacterium kỹ thuật di truyền khả chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật Lợi dụng phương thức chuyển gene tự nhiên nhà khoa học thực vật dựa vào kỹ thuật phân tử điều khiển T-DNA để thiết kế hệ vector cách lồng đoạn DNA cần chuyển gắn vào T-DNA vi khuẩn, sau cho nhiễm vi khuẩn chứa plasmid biến đổi Để lây nhiễm người ta nuôi cấy tế bào trần thực vật, tế bào đơn trong mooi trường lồng, đặt mô cấy dung dịch huyền phù chứa vi khuẩn có plasmid biến đổi thời gian định Quá trình chuyển nạp thông qua Agrobacterium gồm bước sau đây: 200 mồi ủ hỗn hợp này, sợi bổ sung tổng hợp Sau đun nóng hỗn hợp 940C sợi tạo nên tách từ sợi khuôn làm nguội chúng trở lại phân tử mồi gắn vào vị trí nó, sợi tạo thành Điện di sản phẩm PCR gel agarose Lượng DNA tạo nên đủ để nhận vạch sau nhuộm ethidiumbromide Người ta gắn sản phẩm PCR với vector plasmid phage để tạo dòng nghiên cứu ví dụ xác định trình tự DNA 1.1 Nguyên tắc PCR Taq polymerase loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus loại deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) primer, , nhờ đủ số lượng 3’ 5’ (reverse primer-ký hiệu R) Nguyên tắc PCR trình bày hình 9.10 9.11 Theo đó, từ chu kỳ thứ Taq polymerase bắt đ (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide Nếu biết trình tự đoạn gene cần khuếch đại tổng hợp nhân tạo primer tương ứng đ 25-35 chu kỳ, qua từ 10-6 g DNA ban đầu khuếch đại (amplification) lên tới g (khoảng kb) Mỗi chu kỳ PCR bao gồm giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: - Gây biến tính 90-95oC vài giây vài phút Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu dạng xoắn kép tách thành sợi đơn (single strands) dùng làm khuôn cho đoạn mồi bám enzyme RNA polymerase xúc tác tổng hợp Tất phản ứng enzyme giai đoạn bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó) - Ủ với mồi (annealing) 50-55oC Trong giai đoạn primer gắn vào vị trí có trình tự tương đồng DNA khuôn mẫu Các primer bị lắc nhẹ chung quanh chuyển động Brown liên kết ion tạo thành bị đứt gãy liên tục primer sợi đơn DNA khuôn mẫu sợi đơn Các liên kết ion ổn định t đoạn nhỏ (các primer lắp ráp xác) đoạn nhỏ DNA sợi đôi (khuôn mẫu primer) enzyme polymerase bắt đầu trình chép khuôn mẫu - Tổng hợp (synthesis) 70-72oC vài chục giây 201 vài chục phút Đây khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA vị trí có primer theo chiều 5’ 3’ Các primer t gãy Các primer vị trí không bắt cặp xác lại bị rời (do nhiệt đ Enzyme Taq polymerase bổ sung dNTP từ 5’ 3’ Hình 9.10 Sơ đ phản ứng trùng hợp DNA polymerase (PCR) Hình 9.11 Các chu kỳ phản ứng PCR Phản ứng PCR nguyên tắc đơn giản, để đạt kết tốt cần phải thực cẩn thận Trình tự đoạn mồi kết thí nghiệm quan trọng đảm bảo nhiệt độ giai đoạn chu kỳ phản ứng Cuối vấn đề quan trọng sau sử dụng sản phẩm khuếch đại PCR - Cấu trúc mồi oligonucleotide cho phản ứng PCR Mồi định thành công hay thất bại thí nghiệm PCR Khi thiết kế xảy khuếch đại đoạn DNA mong muốn Nếu đoạn mồi thiết kế sai không xảy phản ứng không xảy tổng hợp tổng hợp đoạn không mong muốn, chí nhiều đoạn 202 DNA khuếch đại (Hình 9.12) Hình 9.12 Kết PCR với cặp primer khác Giếng thể đoạn gene khuếch đại với độ lớn mong muốn Ở giếng sản phẩm khuếch đại primer không lai với DNA khuôn Giếng chứa sản phẩm có độ lớn sai hỗn hợp phân tử (1 vạch vạch sai), kết primer gắn sai vị trí DNA khuôn Trình tự đoạn mồi phải tương ứng với trình tự hai đầu đoạn DNA mong muốn đoạn mồi phải bổ sung với sợi khuôn xảy phản ứng lai Hình 9.13 Độ dài primer đinh tính chất đặc biệt PCR - Kích thước đoạn DNA Đoạn DNA muốn khuếch đại không nên dài kb, trường hợp lý tưởng độ lớn nên nhỏ kb Bằng kỷ thuật PCR thông 203 thường người ta khuếch đại đoạn có độ lớn 10 kb độ dài lớn hiệu phản ứng thấp khó khăn để thu kết Có thể khuếch đại đoạn dài (cho đến 40 kb) người ta phải sử dụng phương pháp đặc biệt - Kích thước primer Đoạn mồi nên dài bao nhiêu? Nếu đoạn mồi ngắn thi gắn vào vị trí không mong muốn, nhu đoạn không mong muốn khuếch đại lên Chẳng hạn, DNA tổng số người sử dụng với hai mồi có độ dài nucleotide Kết hình 9.13 Nhiều đoạn khác khuếch đại, người ta tính toán trung bình 65 536 bp (= 84) có ví trí gắn cho mồi Tổng số có khoảng 46 000 vị trí hệ gen người có 000 000 kb Vì khó tin cặp mồi tạo nên sản phẩm PCR đồng với khuôn mẫu DNA người Hình 9.14 Nhiệt độ có tác dụng quan trọng lên phản ứng lai primer DNA khuôn Khi sử dụng mồi có 17 nucleotide, với trình tự 17 179 869 184 bp có vị trí gắn (= 417) Số lớn lần base tổng số hệ gen người, người ta chờ đợi nhiều có vị trí gắn Với cặp mồi có độ dài 17 nucleotide sản phẩm khuếch đại xuất (Hình 9.13) 204 Độ dài mồi ảnh hưởng đến gắn với DNA khuôn nhanh hay chậm, mồi dài trình chậm Hiệu phản ứng PCR số lượng tạo thí nghiệm, giảm mồi dài, với thời gian cho phép chu kỳ phản ứng không xảy phản ứng lai đầy đủ Trong thực tế mồi dài 30 nucleotide sử dụng Quan trọng nhiệt độ gắn ảnh hưởng đến tính đặc hiệu phản ứng Nếu nhiệt độ cao quá, không xảy gắn kết, mồi khuôn đứng riêng lẽ (Hình 9.14a) Nếu nhiệt độ thấp thể lai không đặc hiệu bền vững, tất cặp base bắt cặp xác (Hình 9.14b) Trong trường hợp ý độ dài mồi ý nghĩa, từ xuất thể lai xác mồi khuôn Khi base bắt cặp không tương ứng số lượng vị trí lai với mồi tăng lên nhiều dẫn đến nhân lên đoạn không mong muốn Nhiệt độ lai lý tưởng mặt phải thấp để xảy phản ứng lai mồi sợi khuôn, mặt khác phải cao để không tạo nên thể lai không đặc hiệu Người ta xác định nhiệt độ dựa nhiệt độ phân ly (Tm) thể lai mồi khuôn Ở nhiệt độ Tm thể lai hoàn toàn phân ly, nhiệt độ thấp Tm 1-2 độ tạo nên thể lai xác mồi khuôn, không tồn thể lai không đặc hiệu Người ta biết Tm thực nghiệm, phần lớn tính theo công thức: Tm = (4 x G + C ) + (2 x A + T ) 0C Trong G + C số lượng nucleotide G C trình tự mồi A + T số lượng A T Để xác định nhiệt độ lai cho phản ứng PCR người ta tính Tm cho hai mồi để nhiệt độ thấp Tm 1-2 độ Các mồi nên thiết kế để hai có Tm Nếu không nhiệt độ lai mồi cao với mồi thấp Cách tính Tm cho primer 1.2 Phân tích sản phẩm PCR Sau tiến hành PCR, có nhiều phương pháp để phân tích sản phẩm PCR, quan trọng phương pháp sau - Điện di - Phân tích trình tự sản phẩm PCR - Phân tích tạo dòng sản phẩm PCR 205 Phần lớn việc kiểm tra kết thí nghiệm PCR thực cách lấy phần sản phẩm PCR cho chạy điện di Sau nhuộm màu với ethidiumbromide nhận vạch Nếu sản phẩm thu chứng minh phản ứng lai Southern blot Nếu thiếu vạch mong đợi xuất nhiều vạch khác thí nghiệm phải làm lại Trong số trường hợp, điện di khẳng định phản ứng PCR đạt kết hay không mà từ thu thông tin khác Ví dụ khẳng định, đoạn DNA khuếch đại có tồn vị trí cắt enzym giới hạn hay không Nhằm mục đích sản phẩm PCR xử lý enzym giới hạn sau cho chạy điện di Và người ta khẳng định dựa độ dài sản phẩm PCR, DNA khuôn vùng khuếch đại có chứa đoạn chèn loại bỏ đoạn không (hình 9.15) Trong hai trường hợp đề cập đến dạng biến đổi phân tích RFLP phản ứng PCR So với với phương pháp nguyên thuỷ có ưu điểm cần nguyên liệu ban đầu Hình 9.15 Thông qua điện di sản phẩm PCR, thu thông tin phân tử DNA khuôn Giếng Chỉ sản phẩm PCR không cắt Giếng Sản phẩm cắt enzyme vị trí R Giếng DNA khuôn vùng nhân có chứa đoạn DNA đưa vào Khi địện di không cung cấp đủ thông tin bước xác định trình tự sản phẩm PCR Nhằm mục đích người ta tạo dòng sản phẩm PCR sau sử dụng phương pháp xác định trình tự thông thường xác định trực tiếp trình tự sản phẩm PCR Ứng dụng PCR tách dòng đoạn DNA Khi muốn có thêm thông tin sản phẩm PCR người ta gắn 206 đoạn vào vector nghiên cứu phương pháp tiêu chuẩn ưa thích để phân tích DNA tạo dòng Tuy nhiên có khó khăn Vấn đề gặp phải đầu cuối sản phẩm PCR Những đoạn xuất phản ứng PCR có đầu gắn đầu vào vector nối thêm linker adapter để tạo đầu dính Hình 9.16 Khuếch đại DNA tạo dòng vector Trong thực tế, Taq polymerase gắn với đầu cuối sợi tạo thành thường nucleotide bổ sung thêm, phần lớn adenosin Sản phẩm PCR mạch kép đầu dính, mà đầu cuối 3’ có nucleotide (Hình 9.17) Người ta cắt nucleotide bổ sung exonuclease tạo phân tử có đầu Phương pháp hạn chế cắt tiếp tục exonuclease đầu cuối bị ảnh hưởng Hình 9.17 Polynucleotide tổng hợp từ Taq polymerase thường mang đầu cuối 3’ adenosine Để giải khó khăn người ta sử dụng vector tạo dòng đặc biệt với nucleotide T đứng đối diện, gắn kết với DNA khuếch đại (Hình 9.18) Để tạo vector thông thường người ta 207 tạo vector với đầu cuối cắt enzyme giới hạn sau xử lý với Taq polymerase bổ sung thêm ATP Vì hỗn hợp không chứa mồi, nên Taq polymerase gắn nucleotide T vào đầu vector cắt Một vector có đầu cuối T gắn với sản phẩm PCR Hình 9.18 Tạo dòng sản phẩm PCR vector với nucleotide đầu cuối Phương pháp thứ hai sử dụng nhiều thiết kế mồi có chứa vị trí cắt giới hạn Sau phản ứng PCR người ta xử lý phân tử tạo enzyme giới hạn DNA trình tự mồi cắt xuất đầu dính, đưa chúng có hiệu vào vector tạo dòng bình thường (Hình 9.19) Phương pháp không hạn chế trường hợp, đoạn mồi trùm lên vị trí cắt giới hạn có DNA khuôn Người ta gắn trình tự nhận biết enzyme đoạn ngắn vào đầu 5’ mồi (Hinh 9.20) Những đoạn không lai với khuôn chép phản ứng PCR, sản phẩm PCR mang đầu cuối vị trí cắt enzyme giới hạn Những khó khăn khiếm khuyết Taq polymerase: Tất DNA polymerase có lỗi tổng hợp, nghĩa gắn nucleotide sai vào sợi DNA tổng hợp Tuy nhiên phần lớn DNA-polymerase sửa chữa lỗi này, 208 quay lại để cắt nucleotide gắn vào sai gắn vào nucleotide Đặc tính có “chức sửa chữa” phụ thuộc vào hoạt tính exonuclease theo hướng 3’ 5’ polymerase Hình 9.19 Tạo sản phẩm PCR có đầu dính nhờ sử dụng primer, có vị trí enzyme cắt giới hạn Hình 9.20 Primer PCR với vị trí cắt đầu 5’ kéo dài Taq polymerase thiếu chức sửa chữa này, nghĩa chúng sửa lỗi DNA tổng hợp từ enzyme luôn xác phân tử khuôn Lỗi gặp phải theo ước đoán khoảng nucleotide 9000, thể lỗi ít, sau 30 chu kỳ phản ứng lỗi lên đến 300 bp Vì phản ứng PCR nhiều thường xuyên xuất từ nên lỗi PCR-polymerase gây tăng dần xuất cuối PCR mang nucleotide gắn vào sai từ chu kỳ trước lỗi thêm vào chu kỳ tổng hợp cuối 209 Hình 9.21 Tần suất lỗi cao Taq polymerase tạo dòng sản phẩm PCR Trong nhiều lĩnh vực ứng dụng lỗi tổng hợp vấn đề lớn Đặc biệt phân tích trình tự trực tiếp sản phẩm PCR cung cấp trình tự xác có lỗi Taq polymerase gây ra, theo phân bố thống kê base gắn sai nhiều phân tử khác xuất đoạn với lỗi vị trí định có trình tự vị trí xác Trong trường hợp mắc lỗi ý nghĩa Mặt khác sản phẩm PCR tạo dòng Mỗi dòng chứa nhiều đoạn khuếch đại phản ứng PCR DNA tạo dòng không thiết có trình tự phân tử khuôn mà người ta cho vào để khuếch đại (Hình 9.21) Điều dẫn đến không chắn tất thí nghiệm với sản phẩm PCR tạo dòng Vì nghiên cứu DNA khuếch đại trực tiếp không tạo dòng 210 PCR vào lập đồ di truyền PCR (random amplified polymorphic DNA analysis-RAPD) Trong phương pháp RAPD, PCR thực với primer chọ triển đa hình đoạn cắt giới hạn (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), vi vệ tinh (microsatellite) hay gọi lặp lại đoạn nucleotid (amplified fragment lenght polymorphism, AFLP) Các kỹ thuật xây dựng sở PCR có triển vọng lớn nghiên cứu da dạng di truyền (genetic diversity), địn Nguyên tắc sở di truyền phương pháp chọn lọc nhờ thị (MAS-marker aided-selection) dựa vào PCR Một thị di truyền cần có hai yêu cầu bản: thứ phải có khác biệt thể bố thể mẹ thứ hai phải truyền lại xác cho thể hệ sau Người ta phân kiểu thị di truyền sau: 4.1 Chỉ thị hình thái Về mặt nguyên tắc, tính trạng locus kiểm soát mà biểu không bị ảnh hưởng tác động môi trường, dùng làm thị hình thái cho trình chọn lọc 4.2 Chỉ thị phân tử: Chỉ thị phân tử đặc điểm khía cạnh hóa học hay cấu trúc phân tử di truyền lại cho hệ sau giống nhân tố di truyền Mendel lại định lượng Có hai loại thị phân tử bản: Chỉ thị isozyme: isozyme dạng enzyme có phản ứng hóa học lại bị ức chế phân tử khác Về mặt di truyền chia isozyme làm hai dạng: isozyme đơn gene isozyme đa gene Chỉ thị phân tử DNA: Chỉ thị phân tử DNA phong phú, đa dạng DNA, tính ổn định không lệ thuộc chúng vào yếu tố môi trường Các thị di truyền phân tử sử dụng để xác định mối quan hệ cá thể loài loài, sở cho việc phân loại loài, phát loài mối quan hệ tiến hóa loài Chúng dùng để chọn tổ hợp lai Kiểu thị sử dụng có hiệu để lập đồ phân tử cho 211 trồng có phương thức sinh sản sinh dưỡng hay sinh sản vô tính khó khăn Chỉ thị phân tử chia làm hai nhóm lớn: - Chỉ thị dựa sở lai DNA hay thị RFLP - Chỉ thị dựa sở nhân DNA kỹ thuật PCR Cho đến có nhiều thị phân tử phát triển dựa sở nhân DNA kỹ thuật PCR như: AFLP (Amplified fragment length polymorphism), RAPD (Random amplified polymorphism DNA), SSR (Simple sequence repeats), STS (sequence tagged site) … Chọn lọc nhờ thị dựa vào PCR Tính biến dị di truyền giống loài phát sai khác chiều dài đoạn DNA đích nhân nhờ PCR sử dụng cặp primer Đó thay base điểm liên kết primer xếp lại trật tự DNA vùng chứa điểm Những thay đổi phản ảnh tính đa dạng chiều dài đoạn DNA nhân (amplicon length polymorphism) – ALP Các primer dùng phương pháp chọn lọc nhờ thị dựa PCR thường vào điểm có trật tự nucleotide xác định, gọi thị điểm trật tự đánh dấu - STS (sequence tagged site) Chỉ thị STS sử dụng phổ biến lập đồ geneome STS đoạn DNA ngắn khoảng 60-1000 bp phát kỹ thuật PCR Nó cho phép xác định vị trí đánh dấu cách sử dụng trình tự nucleotide biết trước DNA geneome Hai đoạn mồi thiết kế dựa trình tự nucleotide biết giúp ta xác định vùng DNA cần tìm Các đoạn mồi STS thường chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR Một lượng lớn STS tạo nhờ sử dụng kỹ thuật RFLP dòng cDNA làm mẫu dò Mỗi STS xác định điểm đồ mốc genome Dựa kết phân tích thị STS, RAPD, xây dựng đồ di truyền liên kết giống trồng Nhờ việc tìm kiếm gene kiểm soát liên quan chặt chẽ đến tính trạng di truyền tiến hành cách dễ dàng - Chỉ thị AFLP cho phép phát tính đa dạng chiều dài đoạn DNA nhân chọn lọc Kỹ thuật đánh giá nhanh chóng có hiệu việc xác định tính đa dạng trồng lúa, lạc, … - Chỉ thị SSR: SSR đoạn DNA có lặp lại trật tự nucleotide đơn giản Do khác số lượng nucleotide đơn vị lặp lại số đơn vị lặp lại mà độ dài SSR nhân phát sau trình điện di Chỉ thị SSR dùng để chọn lọc tính kháng bệnh khảm virus đậu tương, số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với suất lúa xác lập mối quan hệ thân thuộc 212 giống trồng cà chua, lúa, đậu tương, mía, … - Chỉ thị RAPD cho phép phát tính đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên việc dùng mồi đơn (thường chứa 1012 nucleotide, tối thiểu bp) chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên Chỉ thị RADP thường dùng để phân tích xác định mối quan hệ thân thuộc thứ trồng hay cá thể phục vụ cho công tác lai tạo phân loại Chúng sử dụng để xác định gene kiểm soát có liên quan đến tính trạng trồng tính trạng chất lượng, tính kháng virus, … V Một số kỹ thuật khác ứng dụng chúng chọn giống thực vật giới Việt Nam Trong năm qua, phương pháp biến nạp gene thực vật bậc cao có nhiều tiến Hiện phòng thí nghiệm công nghệ gene bắt tay vào việc cải thiện có ý nghĩa cho số loại trồng nhờ công cụ sinh học tế bào sinh học phân tử Trong vài trường hợp đặc biệt (đậu tương, lúa, ngô bông) phương pháp biến nạp gene bị giới hạn genotype Một số trồng quan trọng cần thiết cho nhu cầu sử dụng người dân nước phát triển ý Một số trồng quan trọng biến nạp gene, vài vấn đề kỹ thuật tồn tại, chúng giải Để có kết cần phải thay đổi sang phạm vi khác, phát tạo dòng gene mang tính trạng đa gene (multigeneic traits) Một điều quên vấn đề nhận thức xã hội dự báo nguy tác động xấu đến môi trường sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA mang lại Hiện công nghệ biến nạp gene quan tâm thông qua quỹ tài trợ quan quốc tế chương trình Rockefeller Foundation (Mỹ), vấn đề thảo luận nhiều cần thiết xác định phương thức tốt để chuyển lợi ích công nghệ biến nạp gene mang lại đến nước phát triển 1983 Điều cho phép nhận xét hai thập niên, công cụ công nghệ DNA tái tổ hợp sinh học tế bào giúp ích nhiều cho nhà tạo giống thực vật Việc lựa chọn phương thức sử dụng trồng thu từ công nghệ DNA tái tổ hợp cung cấp thêm nguồn tài nguyên cho công nghiệp người tiêu dùng, mở rộng sở kinh tế nước công nghiệp lẫn nước phát triển 213 Câu hỏi ôn tập Nêu nguyên tắc chung kỹ thuật chuyển gene Trình bày phương pháp chuyển gene vào trồng Ứng dụng kỹ thuật RFLP chọn giống thực vật PCR gì? Các giai đoạn phản ứng PCR Ứng dụng PCR tách dòng đoạn DNA Tài liệu tham khảo Nguyễn Hoàng Lộc 1998 Bài giảng Công nghệ gene thực vật Đại học Khoa học Huế Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989) Molecular Cloning (A laboratory manual) Cold Spring Habor Laboratory USA Newton CR and Graham A 1994 PCR BIOS Scientific Publishers Limited Lê Duy Thành 2000 Cơ sở di truyền chọn giống thực vật NXB Khoa học Kỹ thuật Wiser MF 2002 Lecture notes for method in cell Spring TRANG WEB : http://www.appliedplantsciences.umn.edu/Plant_Breeding_Molec ular_Genetics.html http://www.irri.org/irrc/hybridrice/Marker.asp http://www.plantsciences.ucdavis.edu/plantsciences/ http://alpinmack.wordpress.com/2008/08/21/geneticllyengineered-food/ http://www.irri.org/rg5/Cooperative.htm http://www.sciencedaily.com/articles/g/genetically_modified_foo d.htm http://rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/index.html http://www3.interscience.wiley.com/cgibin/abstract/112506342/ABSTRACT (Giải mã Bộ gen lúa) http://www.aphis.usda_gov/biotechnology/ http://www.agbioworld.org TỪ KHOÁ : 214 Kỹ thuật di truyền : Genetic engineering Gen thị : Marker gene / Chỉ thị phân tử : Molecular maker (phương pháp) Vi tiêm : Microinjection Công nghệ tế bào thực vật : Plant cell biotechnology Đa hình độ dài phân đoạn cắt hạn chế : Restriction fragment length polymorphism (RFLP) - Phản ứng dây chuyền polymerase : Polymerase chain reaction (PCR) - Công nghệ sinh học nông nghiệp : Agricultural Biotechnology - Thực vật biến đổi gene : Genetically modified organisms (GMO plants) - [...]... ngô (bắp): - Phương pháp chuẩn: chọn các cây khỏe mạnh và điển hình cho quần thể của vật liệu ban đầu rồi cho tự phối bằng phương pháp cách ly Các bắp tốt được lựa chọn theo kiểu bắp/hàng Sự chọn lọc được lặp lại như vậy ở các thế hệ tiếp theo - Phương pháp hốc đơn: đây là một biến dạng của phương pháp chuẩn, hàng được thay thế bằng hốc đơn 3 cây trong mỗi chu kỳ chọn lọc Vì thế phương pháp này có ưu... cây chọn tùy thuộc vào nguồn giống có được + Gieo cây đời con trên ô gồm 3-4 hàng và quan sát độ đồng đều của các tính trạng kiểu hình khác nhau + Trộn hạt các đời con có dạng giống và đồng đều lại để nhân giống Chọn lọc quần thể được xem như là một phương pháp chọn tạo giống để cải lương các giống cây trồng tự thụ phấn 1.3.2 Chọn lọc cá thể - Giống dòng thuần Chọn lọc cá thể với mục đích tạo ra giống. .. rất ít 1.3 Chọn lọc Chọn lọc là một quá trình nhờ đó cá thể hay một nhóm cá thể được chọn ra từ một quần thể hỗn hợp và không đồng nhất Chọn tạo giống cây trồng tự thụ phấn bằng chọn lọc hàng loạt hay chọn lọc hõn hợp (chọn lọc quần thể) và chọn lọc cá thể hay dòng thuần (chọn lọc phổ hệ) 1.3.1 Chọn lọc quần thể Ở phương pháp chọn lọc quần thể, người ta chọn bông hay cây tốt rồi trộn lẫn hạt giống của... lớn trong cấu trúc của một quần thể toàn phối Trong thực tế, cây trồng thụ phấn chéo rất thuận tiện cho việc sử dụng các phương pháp chọn giống mới để đạt hiệu quả tối đa bằng cách kết hợp các chu kỳ tự phối và ngoại phối với nhau Các phương pháp chọn tạo giống hiện nay đối với cây giao phấn chéo có thể chia ra hai nhóm: tạo các thể lai và cải tiến các quần thể Hai nhóm này tuy độc lập với nhau nhưng... sau: - Trường hợp các giống địa phương hình thành từ các quần thể bằng phương pháp chọn lọc quần thể, mang ít cây dị hợp, số lớn cây là đồng hợp tại nhiều locus - Trường hợp của quần thể đang phân ly, từng cây riêng rẽ ban đầu dị 116 hợp trở thành đồng hợp sau các đời liên tiếp Nhiều chương trình chọn tạo giống cây trồng tự thụ phấn quan tâm đến việc chọn tạo các giống dòng thuần vì: (i) Giống dòng thuần... gene kháng sâu có thể cơ mặt trên một giống nhất định của một loại cây trồng nào đó Trong trường hợp này, việc chọn lọc là để phân lập được các kiểu gene kháng Đối với cây tự thụ phấn, sử dụng phương pháp chọn hỗn hợp hoặc chọn dòng thuần để chọn giống kháng Đối với cây giao phấn, thường dùng phương pháp chọn lọc hỗn hợp và chọn lọc hồi quy Cây giao phấn có hiệu quả chọn lọc cao hơn cây tự thụ phấn vì... giống ngoại lai hoặc ở các loài thân thuộc Các giống địa phương đã thích ứng là nguồn đề kháng tốt chống các bệnh đã trở nên trầm trọng bất ngờ được nhập vào khi cải lương một tính trạng có giá trị kinh tế nào đó Các giống địa phương đã thích ứng cũng là nguồn đề kháng có giá trị để chống lại các bệnh ít quan trọng hay chỉ có giá trị địa phương Sức đề kháng của các giống địa phương được chú ý vì: `+... một số lượng lớn các cá thể có hiệu lực, có thể do nhiều gene điều khiển có tác dụng cộng tính hoặc do gene tế bào chất 3.1 Các nguồn gene kháng sâu và côn trùng Nguồn gene kháng sâu và côn trùng có thể tìm thấy ở: + Các giống cây trồng + Nguồn tài nguyên di truyền của các loài + các loài hoang dại có quan hệ huyết thống với cây trồng 3.2 Các phương pháp tạo giống kháng sâu Các phương pháp thường được... đều về các tính trạng nông học quan trọng như màu hạt, kích cỡ hạt, chiều cao cây, thời gian sinh trưởng và khả năng chống chịu bệnh Chọn lọc quần thể chủ yếu được dùng để lọc các giống lẫn hoặc lọc các lô hạt giống lẫn của các chương trình sản xuất hạt giống Việc lọc các giống lẫn bằng chọn lọc quần thể được tiến hành như sau: + Chọn lọc từ 200 đến 2.000 cây (cá thể) đúng dạng hình chính của giống. .. bằng phương pháp vô tính nên qua các đời trồng của hệ vô tính không xảy ra phân ly và tái tổ 120 hợp Điều này đã dẫn đến: - Các hệ vô tính dần dần tích lũy các đột biến tự nhiên, làm độ dị hợp tăng lên - Các gene có hại cũng được tích lũy dần - Các cơ quan sinh sản thường xuyên không hoạt động nên dần dần đưa đến bất dục đực và cái Bất dục đực thường xảy ra nhiều hơn 1.1 Phương pháp chọn tạo Chọn tạo giống