VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP XENLULOZA CAO TỪ PHẾ THẢI NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn : TS Nguyễn Thế Trang Sinh viên thực :Nguyễn Thu Thủy Lớp : MT CNSH 12-01 Khóa :K19 HÀ NỘI - 2016 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Thế Trang, Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể khoa học Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, giúp đỡ thời gian thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện cho làm khóa luận này, hội tốt để thực hành kỹ học lớp giúp ích lớn để ngày tự tin thân Bên cạnh đó, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân ủng hộ, động viên khích lệ suốt trình học tập để có kết ngày hôm Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân trọng cảm ơn tất giúp đỡ quí báu ! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thu Thủy Nguyễn Thu Thủy i Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ vi MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP XENLULAZA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.1.1 Tình hình nghiên cứu chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp xenlulaza giới 1.1.2 Tình hình nghiên cứu chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp xenlulaza Việt Nam 1.2 NGUỒN PHÂN LẬP VÀ SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP XENLULAZA 1.3 THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA PHẾ PHẨM NÔNG NGHIỆP 1.3.1 Xenluloza phế thải nông nghiệp 1.3.2 Hemixenluloza phế thải nông nghiệp 1.3.3 Lignin 1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP XENLULAZA Ở XẠ KHUẨN 1.4.1 Ảnh hưởng thời gian 1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 1.4.3 Ảnh hưởng pH 1.4.4 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon 1.4.5 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ 1.4.6 Ảnh hưởng nguyên tố khoáng 10 Nguyễn Thu Thủy ii Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1.5 ỨNG DỤNG CỦA XENLULAZA TRONG XỬ LÝ PHẾ THẢI HỮU CƠ 10 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 12 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 12 2.1.2 Một số hóa chất 12 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 12 2.1.4 Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 12 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1 Phương pháp phân lập tuyển chọn 13 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học 13 2.2.3 Phương pháp giữ giống 14 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng xạ khuẩn 14 2.2.5 Phương pháp đường khử Bernfeld 15 2.2.6 Phương pháp phân loại xạ khuẩn tuyển chọn 16 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP XENLULAZA CAO 19 3.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN TUYỂN CHỌN 21 3.2.1 Đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc 21 3.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 21 3.3 PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN TUYỂN CHỌN 28 3.3.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 28 3.3.2 Phân loại theo phương pháp sinh học phân tử 29 3.3.3 Xác định trình tự gen 16S rARN hai chủng xạ khuẩn ĐA09 chủng ĐM03 30 KẾT LUẬN 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 Nguyễn Thu Thủy iii Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic ARN Acid Ribonucleic CMC Cacboxyl Methyl Cellulose IU International Unit (Đơn vị quốc tế) OD Optical Density (Mật độ quang) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Nguyễn Thu Thủy iv Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG BIỂU Tên bảng Trang Bảng 19 3.1 Khả phân giải CMC chủng tuyển chọn 28 3.2 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Mức độ tương đồng gen 16S chủng xạ khuẩn ĐA09 30 3.3 với trình tự chủng GenBank Mức độ tương đồng gen 16S chủng xạ khuẩn ĐM03 32 3.4 với trình tự chủng GenBank Nguyễn Thu Thủy v Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình Tên hình, đồ thị Trang 1.1 Hình ảnh hợp chất cao phân tử xenluloza 2.1 Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld 15 3.1 Vòng phân giải CMC chủng xạ khuẩn 20 3.2 Khả làm loãng gelatin chủng nghiên cứu 20 3.3 Hình thái khuẩn lạc tế bào hai chủng xạ khuẩn 21 3.4 Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn theo thời gian 22 3.5 Khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn theo thời gian 22 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 23 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn 23 3.8 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 24 3.9 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn 25 3.10 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 25 3.11 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 26 3.12 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn 26 3.13 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 27 3.14 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn 28 Nguyễn Thu Thủy vi Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.15 Điện di đồ sản phẩm PCR hai chủng xạ khuẩn 29 3.16 Trình tự nucleotit 16S rARN chủng xạ khuẩn ĐA09 30 3.17 Trình tự nucleotit 16S rARN chủng xạ khuẩn ĐM03 31 Nguyễn Thu Thủy vii Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Vi sinh vật đóng vai trò vô quan trọng trình phân hủy, chuyển hóa hợp chất phức tạp tự nhiên xenluloza; protein; pectin; lipit … Ngoài tự nhiên, vi sinh vật phân bố rộng khắp, phổ biến, đặc biệt nơi giàu nguồn hữu Vì vậy, việc xử lý chất hữu giàu xenluloza thông qua áp dụng công nghệ sinh học có nhiều ưu điểm mặt kỹ thật, kinh tế, môi trường Xenluloza thành phần quan trọng cấu tạo nên thành tế bào thực vật, polysaccharite có cấu trúc phức tạp gây khó khăn việc sử dụng phương pháp hóa lý để xử lý, nhiên mặt khoa học, lại dễ dàng bị thủy phân xenlulaza vi sinh vật sản sinh như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc Trong đó, xạ khuẩn xem đối tượng nhận quan tâm đặc biệt từ nhà khoa học Xenlulozalà chất có nhiều loại phế thải nông nghiệp: bã mía, rơm rạ kèm theo lượng thải gia tăng ngày nhiều nhu cầu sử dụng, sản xuất việc ứng dụng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp xenlulaza để phân giải xenluloza xem biện pháp hữu hiệu, an toàn nhanh chóng Từ thực tế trên, đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp xenlulaza cao từ phế phẩm nông nghiệp” thực cần thiết hợp lý” Mục tiêu đề tài: Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp mạnh xenlulaza từ phế phẩm nông nghiệp Nội dung đề tài: - Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp xenluloza - Xác định đặc điểm sinh học, đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng xạ khuẩn tuyển chọn - Phân loại đến loài chủng xạ khuẩn tuyển chọn Ý nghĩa đề tài: Đề tài góp phần bổ sung sử lý luận việc nghiên cứu ứng dụng xạ khuẩn vào đời sống xã hội Nguyễn Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP XENLULAZA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.1.1 Tình hình nghiên cứu chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp xenlulaza giới Trong nhiều năm trở lại đây, giới có bước ngoặt lớn nghiên cứu ứng dụng khoa học vào thực tiễn.Trong công nghệ vi sinh đóng vai trò vô quan trọng, đặc biệt việcứng dụng vi sinh vật hữu ích vào xử lý môi trường mang lại cách mạng lớn.Hiện nay, sử dụng vi sinh vật xử lý môi trường hướng giới nước quan tâm với lợi ích thân thiện, không tạo sản phẩm độc hại cho môi trường, chi phí xử lý thấp [5, 9, 17, 18] Việc sử dụng chủng vi sinh vật xử lý môi trường coi biện pháp hữu hiệu nhằm giải triệt để vấn đề ô nhiễm nước thải, rác thải hoạt động sản xuất ngành nông nghiệp tạo [21, 22, 23] Xạ khuẩn chủng vi sinh vật phổ biến điển hình ứng dụng xử lý ô nhiễm hữu phần lớn nằm phế thải nông nghiệp Qua nhiều năm nghiên cứu, nhà khoa học giới tìm hàng trăm chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp xenlulaza Các chủng tiêu biểu kể đến như: Streptomyces, Nocardia, Micromonospora … Các chủng phân lập từ nhiều nguồn khác tự nhiên Hiện nay, giới ghi nhận nhiều thành công cho nghiên cứu khả sinh xenlulaza xạ khuẩn Ở Mỹ, năm 1983, phòng thí nghiệm quân đội Mỹ Natik Trường Đại học Rulgers nghiên cứu chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất xenlulaza Sau gây biến chủng chọn lọc biến chủng QM9414 có khả sinh xenlulaza cao Năm 1998, YU nuôi cấy Trichoderma reesei Rut 30 môi trường chứa 5% xenluloza 1% cám mì thu hoạt lực CMCaza đạt Nguyễn Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.2.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng sinh tổng hợp xenlulaza Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới trình xử lý phế thải đống ủ Quá trình xử lý phế thải phương pháp ủ cần nhiệt độ cao để trình phân hủy mạnh, tức chủng vi sinh vật sinh trưởng tốt phân giải chất xenluloza có đống ủ làm cho đống ủ nóng lên, cần lựa chọn chủng chịu nhiệt Các chủng xạ khuẩn nuôi môi trường Gauze 1, lắc 200 vòng/phút, nuôi dải nhiệt độ: 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 60 oC, tiến hành lọc, cân sinh khối khô sau ngày Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng sinh tổng hợp xenlulaza chủng trình bày hình 3.6 3.7 16 Sinh trưởng, mg/ml 14 12 10 ĐM03 ĐA09 25 30 35 40 45 50 55 60 Nhiệ t độ, oC Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn Hoạt tính xenlulaza, IU/ml ĐM03 ĐA09 25 30 35 40 45 50 55 Nhiệt độ, oC Hình 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn Nguyễn Thu Thủy 23 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Kết hình 3.6 cho thấy chủng sinh trưởng tốt từ 30 ÷ 55 oC, tốt 45 oC chủng ĐM03 sinh khối khô đạt 12,56 mg/ml, chủng ĐA09 đạt 14,83 mg/ml, 30 oC 55 oC chủng sinh trưởng yếu Để xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp xenlulaza, chủng xạ khuẩn nuôi môi trường Gauze 1, dải nhiệt độ 25, 30, 35, 40, 45, 50 55 o C, sau 96 lấy mẫu xác định hoạt lực enzym Kết trình bày hình 3.7 cho thấy điểm nhiệt độ 45 oC chủng sinh tổng hợp xenlulaza cao nhất, chủng ĐA09 đạt 5,79 IU/ml, chủng ĐM03 đạt 5,2 IU/ml 3.2.2.3 Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh trưởng sinh tổng hợp xenlulaza Dải pH ban đầu môi trường Gauze từ ÷ chọn để nghiên cứu tác động tới sinh trưởng chủng ĐM03 chủng ĐA09 Nuôi nhiệt độ 45 oC, sau 120 lấy dịch nuôi cấy xác định khả sinh trưởng phương pháp cân sinh khối khô Kết nghiên cứu trình bày hình 3.8 cho thấy chủng có khả sinh trưởng dải pH từ ÷ 9, sinh trưởng tốt pH ÷ Chủng ĐM03 sinh khối khô đạt 12,51 mg/ml pH 7, chủng ĐA09 đạt 14,8 mg/ml Việc nghiên cứu ảnh hưởng pH ban đầu có ý nghĩa lớn nhân giống nhằm tạo lượng sinh khối nhiều để sản xuất chế phẩm vi sinh vật 16 14 Sinh trưởng, mg/ml 12 10 ĐM03 ĐA09 4 pH Hình 3.8 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn Nguyễn Thu Thủy 24 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hoạt tính xenlulaza, IU/ml ĐM03 ĐA09 pH Hình 3.9 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn Ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn theo dõi dải pH ÷ 9, nuôi môi trường Gauze1 có bổ sung CMC, lắc 200 vòng/phút, sau 96 lấy mẫu xác định hoạt tính xenlulaza chủng nghiên cứu Kết hình 3.9 cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu sinh tổng hợp xenlulaza cao pH 7, ĐM03 đạt 5,25 IU/ml ĐA09 đạt 5,8 IU/ml Như vậy, pH tối ưu cho sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn nghiên cứu pH 3.2.2.4 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn Để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn nuôi môi trường Gauze bổ sung nồng độ NaCl: 1, 3, 5, 7, 11 %, 0,5 % mẫu đối chứng, lắc 200 vòng/phút, 45 oC, sau 120 nuôi cấy lấy dịch xác định sinh trưởng phương pháp cân sinh khối khô Kết trình bày hình 3.10 16 Sinh trưởng, mg/ml 14 12 10 ĐM03 ĐA09 0.5 11 Nồng độ NaCl, % Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến sinh trưởng hai chủng xạkhuẩn Nguyễn Thu Thủy 25 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.10 cho thấy chủng xạ khuẩn có khả sinh trưởng tốt nồng độ NaCl từ ÷ % Từ % chủng không sinh trưởng 3.2.2.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng sinh tổng hợp xenlulaza Các chủng xạ khuẩn nuôi cấy môi trường Gauze thay nguồn cacbon tinh bột nguồn cacbon khác như: glucoza, saccaroza, lactoza, rỉ đường cho lượng cacbon cho vào tương đương với lượng cacbon có môi trường Nuôi 45 oC sau 96 lấy mẫu xác định hoạt lực xenlulaza khả sinh trưởng chủng Kết trình bày hình 3.11 16 Sinh trưởng, mg/ml 14 12 10 ĐM03 ĐA09 Saccaroza Lactoza Glucoza Rỉ đường Tinh bột Nguồn cacbon Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn Hoạt tính xenlulaza, IU/m l ĐM03 ĐA09 Saccaroza Lactoza Glucoza Rỉ đường CMC Tinh bột Nguồn cacbon Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn Kết hình 3.12 cho thấy thay tinh bột nguồn cacbon khác chủng xạ khuẩn sinh trưởng sinh tổng hợp enzym yếu nhiều Nguyễn Thu Thủy 26 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.2.2.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng sinh tổng hợp xenlulaza Để phân giải đượcxenluloza vi sinh vật cần phải tổng hợp lượng lớn xenlulaza, có chủng sử dụng 60 % tổng nhu cầu nitơ cho việc sinh enzym ngoại bào Chính cần nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng sinh xenlulaza chủng nghiên cứu Các chủng xạ khuẩn nuôi môi trường Gauze nguồn nitơ môi trường thay nguồn nitơ khác với lượng tương ứng ban đầu: (NH4)2SO4, KNO3, pepton, CMC, cao thịt, cao men Nuôi nhiệt độ 45 oC, lắc 200 vòng/phút, sau 120 thu kết Kết hình 3.13 3.14 cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu sinh trưởng sinh tổng hợp xenlulaza môi trường thay nguồn nitơ: cao men, pepton bột đậu tương cao Trong môi trường có chứa nguồn nitơ vô chủng xạ khuẩn sinh trưởng sinh xenlulaza yếu S in h t rư n g , m g /m l 25 20 15 ĐM03 ĐA09 10 Pepton Cao men Bột đậu tương KNO3 (NH4)2SO4 Urê Cao thịt Nguồn nitơ Hình 3.13 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn Nguyễn Thu Thủy 27 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 10 Hoạt tính xenlulaza, IU/ml ĐM03 ĐA09 Pepton Cao men Bột đậu tương KNO3 (NH4)2SO4 Urê Cao thịt Nguồn nitơ Hình 3.14 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn 3.3 PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN TUYỂN CHỌN 3.3.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống Các đặc điểm hình thái tế bào, khuẩn lạc, đặc điểm sinh lý sinh hóa số đặc điểm sinh học khác chủng xạ khuẩn ĐM03 ĐA09 trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Đặc điểm Ký hiệu chủng xạ khuẩn ĐM03 ĐA09 Màu khuẩn ty khí sinh Trắng xám Trắng sữa, nâu Màu khuẩn ty chất Không Không Sắc tố tan Không Không Thẳng lượn, xoắn Thẳng lượn, xoắn Nhẵn Nhẵn Làm loãng gelatin Có Có Phân giải tinh bột 28 30 Phân giải CMC 30 Hình thái cuống sinh bào tử Bề mặt bào tử 31 30 ÷ 55 C 30 ÷ 55 oC pH thích hợp 5÷9 5÷9 Khả chịu NaCl (g/l) 1÷7 1÷8 Nhiệt độ thích hợp Nguyễn Thu Thủy o 28 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Kết bảng 3.2 cho thấy chủng xạ khuẩn có khả phân giải nguồn chất tinh bột, CMC, gelatin, cazein tốt Dải nhiệt độ thích hợp30 ÷ 55 oC, pH thích hợp ÷ Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý hai chủng xạ khuẩn, theo khóa phân loại Waksman, Krasilnikov Gauze sơ xếp chủng vào giống Streptomyces 3.3.2 Phân loại theo phương pháp sinh học phân tử Hai chủng xạ khuẩn tiến hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp Masterson cộng sự, sau thực nhân đoạn gen 16S rARN phản ứng PCR Kết điện di đồ sản phẩm PCR từ ADN tổng số chủng xạ khuẩn ĐA09 chủng ĐM03 trình bày ởhình 3.15 M ĐA09 ĐM03 1,5 kb Hình 3.15 Điện di đồ sản phẩm PCR hai chủng xạ khuẩn Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 16F 16R thu gen mã hóa 16S rARN hai chủng xạ khuẩn ĐA09 ĐM03 Kết điện di đồ hình 3.15 cho thấy sản phẩm PCR thu băng đặc hiệu Kích thước phân tử vào khoảng 1,5 kb Nguyễn Thu Thủy 29 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3.3 Xác định trình tự gen 16S rARN hai chủng xạ khuẩn ĐA09 chủng ĐM03 Sản phẩm PCR sau tinh dùng để xác định trình tự nucleotit gen 16S rARN Truy cập ngân hàng gen để tìm loài đăng ký có trình tự tương đồng Trình tự gen 16S rARN chủng xạ khuẩn ĐA09 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 AGGGTGGATT CAAGCCCTGG GAAAGCTCCG TCACCAAGGC CACGGCCCAG GATGCAGCGA AAGAAGCGAA CGGTAATACG GCTTGTCGCG AGGCTAGAGT CAGGAGGAAC AGCGTGGGGA AGGTGTGGGC GGGGAGTACG GAGCATGTGG AAACGTCCAG AGCTCGTGTC TTGCCAGCAG GAAGGTGGGG AATGGCCGGT CAGTTCGGAT TCAGCATTGC AAGTCGGTAA AGTGGCGAAC AAACGGGGTC GCGGTGCAGG GACGACGGGT ACTCCTACGG CGCCGCGTGA AGTGACGGTA TAGGGCGCGA TCGGTTGTGA TCGGTAGGGG ACCGGTGGCG GCGAACAGGA GACATTCCAC GCCGCAAGGC CTTAATTCGA AGATGGGCGC GTGAGATGTT GCCCTTGTGG ACGACGTCAA ACAATGAGCT TGGGGTCTGC TGCGGTGAAT CACCCGAAGC GGGTGAGTAA TAATACCGGA ATGAGCCCGC AGCCGGCCTG GAGGCAGCAG GGGATGACGG CCTGCAGAAG GCGTTGTCCG AAGCCCGGGG AGATCGGAAT AAGGCGGATC TTAGATACCC GTCGTCCGTG TAAAACTCAA CGCAACGCGA CCCCTTGTGG TGGGTTAAGT TGCTGGGGAC GTCATCATGC GCGATACCGC AACTCGACCC ACGTTCCCGG CGG CACGTGGGCA TACTGATCGC GGCCTATCAG AGAGGGCGAC TGGGGAATAT CCTTCGGGTT AAGCGCCGGC GAATTATTGG CTTAACCCCG TCCTGGTGTA TCTGGGCCGA TGGTAGTCCA CCGCAGCTAA AGGAATTGAC AGAACCTTAC TCGGTGTACA CCCGCAACGA TCACGGGAGA CCCTTATGTC GAGGTGGAGC CATGAAGTCG GCCTTGTACA ATCTGCCCTG CTTGGGCATC CTTGTTGGTG CGGCCACACT TGCACAATGG GTAAACCTCT TAACTACGTG GCGTAAAGAG GGTCTGCAGT GCGGTGAAAT TACTGACGCT CGCCGTAAAC CGCATTAAGT GGGGGCCCGC CAAGGCTTGA GGTGGTGCAT GCGCAACCCT CCGCCGGGGT TTGGGCTGCA GAATCTCAAA GAGTCGCTAG CACCGCCCGT CACTCTGGGA CTTGGTGATC AGGTAATGGC GGGACTGAGA GCGAAAGCCT TTCAGCAGGG CCAGCAGCCG CTCGTAGGCG CGATACGGGC GCGCAGATAT GAGGAGCGAA GGTGGGCACT GCCCCGCCTG ACAAGCGGCG CATACACCGG GGCTGTCGTC TTGTCCCGTG CAACTCGGAG CACGTGCTAC AAGCCGGTCT TAATCGCAGA CACGTCACGA Hình 3.16.Trình tự nucleotit 16S rARN chủng xạ khuẩn ĐA09 Bảng 3.3.Mức độ tương đồng gen 16S chủng xạ khuẩn ĐA09 với trình tự chủng GenBank Mã Thông tin chủng % tương đồng EU593734.1 Streptomyces althioticus 173997 100 KJ093396.1 Streptomyces sp SCAUEG1 99 KJ019009.1 Streptomyces thermocarboxydus SDT99 99 KJ019002.1 Streptomyces thermocarboxydus SDT89 99 Kết phân tích cho thấy chủng ĐA09 thể mức độ tương đồng trình tự nucleotit đoạn gen 16S rARN so với loài Streptomyces althioticuslà 100 % Căn vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá, trình tự gen 16S rARN kết hợp với hệ thống phân loại xạ khuẩn Waksman, Nguyễn Thu Thủy 30 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Krasilnikov Gauze, chủng ĐA09 xác định loài Streptomyces althioticus, ký hiệu làS.althioticusĐA09 Trình tự gen 16S rARN chủng xạ khuẩn ĐM03 Trình tự đoạn gen 16S rARN chủng xạ khuẩn ĐM03 thể hình 3.17 bảng 3.14 acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg atgaagccct tcggggtgga 61 ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc tgcactctgg gacaagccct 121 ggaaacgggg tctaataccg gatatgacca tcttgggcat ccttgatggt gtaaagctcc 181 ggcggtgcag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt gaggtaatgg ctcaccaagg 241 cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca 301 gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg 361 acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcga 421 aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 481 gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcac 541 gtcggttgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcag tcgatacggg caggctagag 601 ttcggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa 661 caccggtggc gaaggcggat ctctgggccg atactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 721 agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cggtgggcac taggtgtggg 781 caacattcca cgttgtccgt gccgcagcta acgcattaag tgccccgcct ggggagtacg 841 gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggcg gagcatgtgg 901 cttaattcga cgcaacgcga agaaccttac caaggcttga catacaccgg aaagcattag 961 agatagtgcc ccccttgtgg tcggtgtaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1021 gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gtcccgtgtt gccagcaggc 1081 ccttgtggtg ctggggactc acgggagacc gccggggtca actcggagga aggtggggac 1141 gacgtcaagt catcatgccc cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa tggccggtac 1201 aatgagctgc gataccgtga ggtggagcga atctcaaaaa gccggtctca gttcggattg 1261 gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc agcattgctg 1321 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa gtcggtaaca 1381 cccgaagccg gtggcccaac cccttgtggg agggagctgt cgaaggtggg actggcgatt 1441 gggacgaagt cgtaacaagg tagccgtacc ggaa Hình 3.17.Trình tự gen 16S rARN chủng xạ khuẩn ĐM03 Sau trình phân tích, kết cho thấy chủng xạ khuẩn ĐM03 thể mức độ tương đồng trình tự nucleotit đoạn gen rARN so với loài Streptomyces misionensis 100 % Như khẳng định chủng ĐM03 thuộc loài Streptomyces misionensis, ký hiệu làS.misionensis ĐM03 Nguyễn Thu Thủy 31 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng 3.4 Mức độ tương đồng gen 16S chủng xạ khuẩn ĐM03 với trình tự chủng GenBank Mã Thông tin chủng % tương đồng JN869290.1 Streptomyces misionensis PESB 25 100 AB184285.1 Streptomyces misionensis NBRC 13063 99 JQ768264.1 Streptomyces costaricanus NA13 99 JQ768263.1 Streptomyces costaricanus NA12 99 JQ768262.1 Streptomyces costaricanus NA10 99 JQ768261.1 Streptomyces costaricanus NA9 99 JQ388677.1 Streptomycetaceae bacterium A6 99 JQ388676.1 Streptomycetaceae bacterium A3 99 NR_044138.1 Streptomyces misionensis NRRL B-3230 AB184760 AB184515.1 Nguyễn Thu Thủy 99 Streptomyces hygroscopicus subsp hygroscopicus NBRC 3401 99 Streptomyces owasiensis NBRC 13832 99 32 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội KẾT LUẬN Đã phân lập lựa chọn 12 chủng xạ khuẩn từ mẫu rơm rạ Đông Anh, Đại Mỗ, Đan Phượng, Bắc Từ Liêm phế thải rau chợ Nghĩa Tân, Cầu Giấy (Hà Nội) Các chủng phân lập có khả sinh tổng hợp xenlulaza cao, có khả phân giải xenluloza, CMC, làm loãng gelatin phù hợp với định hướng nghiên cứu Đã tuyển chọn chủng xạ khuẩn ĐM03, ĐA09 cho nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, đặc điểm sinh lý sinh hóa khả sinh tổng hợp enzym chủng tuyển chọn Đã lựa chọn số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp xenlulaza chủng xạ khuẩn sinh trưởng tốt khoảng nhiệt độ 30 ÷ 50 oC sau 72 nuôi cấy, điều cho thấy chúng vi sinh vật ưa nhiệt, có khả sinh trưởng pH rộng từ ÷ 9, khả chịu NaCl từ ÷ Sinh trưởng đạt cực đại sau 42 sinh tổng hợp xenlulaza đạt cực đại chủng ĐM03 đạt 3,9 IU/ml chủng ĐA09 đạt 4,4 IU/ml sau 108 nuôi Đã phân loại đến loài đến loài chủng xạ khuẩn có khả sinh enzym cao trình tự gen 16S cho thấy:chủng ĐA09 xác định loài Streptomyces althioticus, ký hiệu làS.althioticus ĐA09 Chủng xạ khuẩn ĐM03 thuộc loài Streptomyces misionensis, ký hiệu làS.misionensis ĐM03 Nguyễn Thu Thủy 33 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Tăng Thị Chính (2001) Nghiên cứu vi sinh vật phân giải xenluloza phân hủy rác thải hiếu khí ứng dụng, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Khoa học tự nhiên & Công nghệ quốc gia Tăng Thị Chính, Đặng Thị Mai Anh, Nguyễn Thị Hòa, Trần Văn Tựa, (2013) Ứng dụng chế phẩm vi sinh (SAGI – BIO) để xử lý chất thải rắn chăn nuôi lợn, Báo cáo khoa học sinh thái tài nguyên sinh vật,NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội,80-84 Hoàng Kim Cơ (chủ biên), Trần Hữu Uyển, Lương Đức Phẩm, Lý Kim Bảng, Dương Đức Hồng (2000) Kỹ thuật môi trường, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch Phạm Văn Ty (1977) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Minh Hằng, Đỗ Văn Bút (2013) Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân hủy xenluloza cao từ đất trồng rừng, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội,656-664 Đào Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Thiên Trang Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng xử lý vỏ cà phê làm phân bón cho trồng, Kết nghiên cứu khoa học công nghệ 2006-2010, NXB Nông nghiêp, Hà Nội, 676 – 680 Lê Gia Hy, Đặng Tuyết Phương (2010) Enzym vi sinh vật chuyển hóa sinh học, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (1996) Nghiên cứu tính chất số vi sinh vật có khả tổng hợp xenlulaza cao ứng dụng công nghệ xử lý Nguyễn Thu Thủy 34 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội chất thải hữu cơ, Luận án Phó tiến sĩ Khoa học kỹ thuật, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Trần Đình Mấn, Nguyễn Thế Trang, Phan Thị Tuyết Minh, Nguyễn Văn Xuân (2009) Xây dựng mô hình xử lý rác thải sinh hoạt công nghệ vi sinh thị trấn Lâm - Ý Yên - Nam Định, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Đại học Thái Nguyên, Thái Nguyên, 924 - 927 10 Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Thị Thịnh, Đặng Thị Cẩm Hà (2006) Nghiên cứu phân loại xác định hoạt tính xenluloza chủng xạ khuẩn XKS2, Tạp chí Công nghệ sinh học,4(3),389 - 396 11 Nguyễn Xuân Nguyên, Trần Quang Huy (2004) Công nghệ xử lý nước thải chất thải rắn, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 12 Nguyễn Thị Quên, Nguyễn Văn Sinh (2014) Nghiên cứu số nhóm vi sinh vật trình phục hồi rừng huyện Sông Mã, tỉnh Sơn La, Tạp chí sinh học, 36(4),495-500 13 Nguyễn Thế Trang, Phạm Thị Thu Hương, Nguyễn Thúy Nga (2015) Nghiên cứu khả sinh trưởng sinh tổng hợp xenluloza số chủng Streptomyces phân lập Việt Nam, Báo cáo khoa học sinh thái tài nguyên sinh vật, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 6,NXB Khoa học tự nhiên Công Nghệ,Hà Nội, 1744-1748 14 Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Văn Thao, Đỗ Thị Gấm, Trần Đình Mấn, Nguyễn Thế Trang, Phạm Thanh Hà, Trần Thị Hoa (2013) Đánh giá thành phần vi sinh vật đất trồng chè, cà phê, hồ tiêu tây nguyên tuyển chọn tổ hợp vi sinh vật đa chức để tạo chế phẩm vi sinh sử dụng cho phát triển bề vững loại trồng, Báo cáo khoa học sinh thái tài nguyên sinh vật, Hội nghị khoa học toàn quốc, 2, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội,568-572 Nguyễn Thu Thủy 35 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 15 Lê Thị Thanh Xuân, Nguyễn Thế Trang, Trần Thị Hoa, Hoa Thị Minh Tú, Nguyễn Kim Thoa, Nguyễn Thúy Nga, Lê Quang Sáng, Trần Đình Mấn (2013).Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh xenluloza cao định hướng xử lý phế thải rau hữu cơ,Báo cáo khoa học sinh thái tài nguyên sinh vật, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, 2, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội,668-672 Tài liệu tiếng nước 16 Bernfeld, A P(1995) Methods in Enzymology, 1, 149-158 17 Bhat, M.K(2000).Cellulases and related enzyms in biotechnology Biotech, Adv, 18, 355-383 18 Choppra, S and Methta (1985) Inffluence of various nitrogen and cacbon sources on the production of pect - cellulose and proteolitic enzyms by A niger, J Microbiol, Folia Microbiol, 30, 117-125 19 Coral G, Arikan B, Unaldi M, Guvenmes H (2002) Some properties of crude carboxymethyl cellulose of Aspergillus niger Z10 wild-type Strain, Turk J Biol, 26, 209-213 20 Dong-Shan An, Wan-Taek Im, Hee-Chan Yang, Myung Suk Kang, Kwang Kyu kim, Long Jin, Myung Kyum Kim and Sung-Taik Lee (2005) Cellulomonasterrae sp Nov, a cellulolytic and xylanolytic bacterium isolated from soil International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55,1705-1709 21 Forgaty W.M and Kelly C T(1990) Amylases Amyloglucosidase and related glucanase, In : Microbial enzym and Biotechnology 2nd Ed, ed By W.M Forgaty W.M and Kelly C.T, Elsevier Applied Science, London and NewYork, 22, 71-183 22 Gauze G.F; Preobrajenskaja T.P; Sveshnicova M.A; Tegekhova L.P;Maximova T.S(1983).Opgedelited aktinomycetov uzd “NaukaMoskava” 23 Immanuel, G., R Dhanusa, P Prenma and A Palavesam(2006).Effect of different growth parameters on endoglucanases enzym activity by bacteria isolated from coir retting effluents of estuarine environment Int J Environ Sci Tech, 3(1), 25-34 24 Krasilnikov N.A (1970) Lutchistuc gripki, nauka, M, 73-78 Nguyễn Thu Thủy 36 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 25 Waksman S.A (1961) The actinomycetes, classification, identilication ADN descriptions of genra ADN species, 2, the williams & wilkins Co,baltimore, USA 26 Yung-Chung Lo, Ming-Der Bai, Wen-Ming Chen and Jo-Shu Chang(2008).Cellulosic hydrogen production with a sequencing bacterial hydrolysis and dark fermentation strategy,Bioresource Technology, 94(17), 8299-8303 Nguyễn Thu Thủy 37