VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY VÀ TẠO MÀNG TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ TRÊN NỀN MÀNG POLYMER SINH HỌC PHB-V Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực : TS Đỗ Minh Trung : Nguyễn Thị Thuý Mai Lớp : YD - 1201 HÀ NỘI - 2016 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực khoá luận tốt nghiệp, với nỗ lực thân, đồng thời nhận giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ động viên từ quí thầy cô, từ gia đình bạn, em hoàn thành khoá luận mong muốn Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Đại uý, TS Đỗ Minh Trung, người thầy tận tình hướng dẫn bảo tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất, phòng thí nghiệm cho em trình em thực nghiên cứu khoá luận tốt nghiệp Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân y để em hoàn thành khoá luận Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội truyền đạt kiến thức quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ em để từ em phát triển thêm vốn hiểu biết vận dụng trình hoàn thành khoá luận công việc sau Em xin gửi lời cảm ơn tới cha mẹ, người sinh thành, dạy dỗ nuôi em khôn lớn, người bên cạnh em chia sẻ em gặp khó khăn sống Mặc dù có nhiều cố gắng để thực khoá luận cách hoàn chỉnh Song làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực tế hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên tránh khỏi thiếu sót định mà thân chưa thấy Em mong nhận góp ý quý Thầy, cô giáo bạn để khoá luận hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Thúy Mai SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TBG Tế bào gốc YHTT Y học tái tạo FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thành bê bào thai) PHB-V Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) PHB Polyhydroxybutyrate MSC Mesenchymal stem cell ( tế bào gốc trung mô) PBS Phosphate Buffered saline PLA Processed lipoaspirate NCKH Nghiên cứu khoa học CN-TBG Công nghê- Tế bào gốc CNSH Công nghệ sinh học PHA Polyhydroxyalkanoate SVF Stromal vascular fraction (phân đoạn mạch nền) ADSCs adipose derived stem cells (tế bào gốc mô mỡ) GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor ( bạch cầu hạt đại thực bào) SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Tế bào gốc ………………………………………………… Hình 1.2: Ứng dụng công nghệ TBG……………………………… Hình 1.3: Tế bào gốc toàn năng, vạn …………………………… Hình 1.4: Tế bào gốc đa năng………………………………………… Hình 1.5: Hình ảnh tế bào gốc mô mỡ ……………………………… 10 Hình 1.6: Cấu tạo PHB-V ( Poly 3- hydroxybutyrate-c0-3- 14 hydroxyvalerate) ………………………………………………… Hình 2.1: Tạo màng PHB V …………………………………………… 24 Hình 3.1: Nuôi cấy tăng sinh TBG từ mô mỡ ………………………… 26 Hình 3.2: Hình ảnh TBG mô mỡ nhuộm Giemsa …………………… 27 Hình 3.3 Hình ảnh kết tạo màng PHB-V ………………… 28 Hình 3.4: Nuôi cấy TBG màng PHB-V nồng độ 0,75% …… 29 Hình 3.5: Hình ảnh nuôi cấy TBG mô mỡ màng PHB-V 31 khảo sát nồng độ khác ………………………………… Hình 3.6: Kết nuôi cấy tạo màng tế bào gốc mô mỡ 36 màng PHB-V ………………………………………………………… SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Biểu đồ 3.1: Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ 32 khác ……………………………………………………………………… Bảng 3.1: Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ 32 khác …………………………………………………………………… Biểu đồ 3.2: Kết xác định mật độ tế bào gốc mô mỡ khảo sát tạo màng tế 34 bào thể tích PHB-V 0,75% khác ……………………………………… Bảng 3.2: Kết số lượng tế bào nuôi màng PHB-V 0,75% khảo sát 34 thể tích khác ………………………………………………………… SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào gốc công nghệ tế bào gốc 1.1.1 Tế bào gốc 1.1.2 Phân loại tế bào gốc 1.1.2.1 Phân loại theo đặc tính hay tiềm biệt hóa 1.1.2.2 Phân loại theo dựa theo nguồn gốc phân lập 1.1.3 Tế bào gốc mô mỡ 1.1.3.1 Ứng dụng tế bào gốc mô mỡ 11 1.2 Poly 3- hydroxybutyrate-c0-3-hydroxyvalerate (PHB- V) 13 1.2.1 PHB-V 13 1.2.2 Ứng dụng PHB-V 15 1.3 Bỏng, thực trạng Bỏng phương pháp điều trị 16 1.3.1 Thực trạng bỏng 16 1.3.2 Các phương pháp điều trị Bỏng 18 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nuôi cấy tăng sinh tế bào 21 2.2.2 Bảo quản tế bào 22 2.2.3 Giải đông tế bào 22 SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 2.2.4 Xác định mật độ tế bào 22 2.2.5 Tạo màng PHB V 23 2.2.6 Nuôi cấy cấy tế bào màng PHB-V 24 2.2.7 Địa điểm nghiên cứu 25 2.2.8 Xử lý số liệu 25 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mô mỡ 26 3.2 Kết tạo màng PHB-V 28 3.3 Nuôi cấy TBG mô mỡ màng PHB 29 3.3 Kết tạo màng tế bào gốc màng PHB-V 30 3.3.1 Kết khảo sát nuôi cấy TBG Mô mỡ màng PHB V khảo sát nồng độ khác 30 3.3.2 Kết nuôi cấy tế bào màng PHB-V 0,75% khảo sát thể tích khác 33 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Hằng năm giới có hàng triệu người bị bỏng Ở nước ta theo nghiên cứu Uỷ ban quốc gia phòng chống tai nạn thương tích, Cục Y tế dự phòng số liệu số sở chữa bỏng, tỷ lệ bỏng năm nước khoảng 20.000 đến 25.000 bệnh nhân bỏng năm [ 1] Bỏng tổn thương thể tác dụng trực tiếp với nguồn lượng sức nóng, điện, hóa chất xạ, để lại di chứng sẹo, tàn tật, chí dẫn đến tử vong Theo thống kê Tổ chức Y tế giới, bỏng gây gần 300.000 trường hợp tử vong năm giới nguyên nhân đứng hàng thứ nguyên nhân hàng đầu gây nên gánh nặng bệnh tật chấn thương toàn cầu nhóm trẻ từ 5-14 tuổi Ở Việt Nam, số lượng bệnh nhân bỏng năm có xu hướng tăng Bỏng gây ảnh hưởng trước mắt mà để lại hậu lâu dài, đặc biệt với trẻ em Tổn thương bỏng bên thể bỏng da gây ảnh hưởng đến ngoại tinh thần bệnh nhân, kéo theo tổn thất chi phí điều trị, làm ảnh hưởng đến kinh tế xã hội Từ đó, ta nhận thấy việc tìm phương pháp điều trị bỏng quan trọng Với vết thương bỏng (loét) da, việc tạo lớp màng che phủ bảo vệ vết thương giúp tình trạng bệnh nhân ổn định ngoại hình tinh thần Hiện nay, tế bào gốc (TBG) biết đến với nhiều tiềm ứng dụng lớn, đặc biệt ứng dụng lĩnh vực y học tái tạo TBG trưởng thành lấy nhiều nguồn khác nhau, phổ biến lấy từ tuỷ xương mô mỡ Kỹ thuật lấy TBG từ mô mỡ cho số lượng tế bào gốc tương đương lớn so với kỹ thật lấy TBG từ tuỷ xương, kỹ thuật xâm nhập gây đau cho bệnh nhân Chính mô mỡ coi nguồn tiềm dễ thực việc phân lập cung cấp nguồn TBG cho điều trị SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Để điều trị vết thương, vết bỏng hiệu quả, bên cạnh việc tạo nguồn ứng dụng tế bào gốc việc kết hợp với vật liệu giá thể (màng sinh học) vô quan trọng Giá thể vừa vật liệu để tế bào sinh trưởng phát triển tạo thành lớp màng tế bào bền chắc, dễ dàng sử dụng che phủ vết thương Hiện Poly (3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) - PHB-V, biết đến nguồn cung cấp vật liệu sinh học có nhiều tiềm ứng dụng, có khả tự phân huỷ, không độc hại, có tương thích sinh học cao tổng hợp từ vi khuẩn Do vậy, PHB-V ứng dụng nhiều lĩnh vực khác dược phẩm vật liệu che phủ Những đặc tính mong muốn mở tiềm ứng dụng PHB-V vào y học, sử dụng vật liệu có tính tương thích sinh học không độc hại thích hợp cho việc tạo vật liệu cấy ghép người Xuất phát từ vấn đề em tiến hành nghiên cứu đề tài: ” Nghiên cứu nuôi cấy tạo màng tế bào gốc mô mỡ màng polymer sinh học PHB-V” với mục tiêu sau: Mục tiêu: Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mô mỡ Tạo màng tế bào gốc màng polymer sinh học PHB-V SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào gốc công nghệ tế bào gốc 1.1.1 Tế bào gốc Tế bào gốc (TBG) tế bào chưa có chức chuyên biệt, có tiềm phát triển thành nhiều loại tế bào khác có khả tự thay (Self-Renewal) [50] Các tế bào tế bào chưa biệt hóa (Unspecialized Cell) giai đoạn khác chưa kết thúc trình biệt hóa (tế bào vạn tiềm năng, tế bào đa tiềm năng, tế bào tiềm năng, tế bào đơn tiềm năng), chúng theo nhiều hướng khác để tạo thành nhiều loại tế bào khác Hình 1.1: Tế bào gốc (Nguồn: http://nas-sites.org/stemcells) SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.2: Hình ảnh TBG mô mỡ nhuộm Giemsa A: sau 24 (40X); B: sau ngày (20X) Các TBG từ mô mỡ sau nuôi cấy có khả bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy, có dạng hình thoi giống nguyên bào sợi, có xu hướng mọc thành đám sau tạo lớp tế bào đơn bề mặt đĩa nuôi cấy Khi nhuộm bắt mầu thuốc nhuộm rõ với hình ảnh tế bào đơn nhân, bào tương trải rộng dạng hình thoi SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 27 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Nuôi cấy tăng sinh TBG bước khởi đầu công nghệ TBG Các kết có ý nghĩa việc tạo nguồn TBG làm nguyên liệu để cung cấp cho nghiên cứu ứng dụng Chính kết đủ điều kiện để sử dụng nguồn tế bào để sử dụng việc nuôi cấy tạo màng tế bào màng PHB-V 3.2 Kết tạo màng PHB-V Sau thực bước theo phương pháp Dung dịch PHB-V cho bay chloroform điều kiện tĩnh, Kết thu màng PHB-V, màng PHB-V tạo quan sát có mầu trắng đục, có độ dai, mềm Màng PHB-V gửi phân tích, đánh giá sử dụng cho nghiên cứu Hình 3.3 Hình ảnh kết tạo màng PHB-V (A: bóc tách màng PHB-V tạo được; B: màng PHB-V để sử dụng cho nuôi cấy tế bào) SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 28 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3 Nuôi cấy TBG mô mỡ màng PHB Để đánh giá màng PHB-V làm giá đỡ để nuôi cấy tế bào Tế bào sau cấy chuyển chuyển lên màng PHB-V có nồng độ 1% Nuôi cấy môi trường MSC bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, nuôi cấy nhiệt độ 37°C, 5% CO2 Kết sau 24 tế bào tế bào có khả bám dính bề mặt màng PHB-V (hình 3.4) sau 12 ngày tế bào tăng sinh che phủ 60% diện tích bề mặt màng PHB-V, kết thể thông qua nhuộm tế bào với giemsa (hình 3.4B) Như tế bào nuôi cấy màng PHB-V tiếp tục sử dụng màng PHB-V cho nghiên cứu Hình 3.4: Nuôi cấy TBG màng PHB-V nồng độ 0,75% (A: TBG mô mỡ nuôi cấy màng PHB-V chưa cố định nhuộm; B: TBG mô mỡ cố đinh nhuộm Giemsa, 10X) SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 29 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3 Kết tạo màng tế bào gốc màng PHB-V 3.3.1 Kết khảo sát nuôi cấy TBG Mô mỡ màng PHB V khảo sát nồng độ khác Kết khảo sát nồng độ PHB khác từ 0,5% 1,25% với mật độ tế bào thời điểm cho vào giếng nuôi cấy với mật độ 15.104 tế bào Kết quan sát kính hiển vi kiểm tra mật độ tế bào sau 11 ngày cho thấy: Tế bào có khả tăng bám dính màng PHB tăng sinh tốt, kết thể biểu đồ 3.1 bảng 3.1 SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 30 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.5: Hình ảnh nuôi cấy TBG mô mỡ màng PHB-V khảo sát nồng độ khác (A, A1: TBG mô mỡ nuôi cấy nồng độ PHB-V 0,5%; B, B1: TBG mô mỡ nuôi cấy nồng độ PHB-V 0,75%; C, C1: TBG mô mỡ nuôi cấy nồng độ PHB-V 1%; D, D1: TBG mô mỡ nuôi cấy nồng độ PHB-V 1,25%) SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 31 Số lượng tế bào (x105) Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 8,47 5,72 5,03 4,00 3,50 ĐC 0,5 0,75 1,0 1,25 Nồng độ PHB-V (%) Biểu đồ 3.1: Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ khác Bảng 3.1: Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ khác Nồng độ PHB-V (%) ĐC 0,5 0,75 1,0 1,25 Số lượng tế bào x 105 (Mean ± SD) (n=3) 8.46 ± 0,47 3,50 ± 0,81 5,71 ± 0,84 5,03 ± 0,47 4,00 ± 0,08 SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 32 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Mặc dù nuôi cấy thử tế bào nồng độ PHB 1% cho kết tế bào có khả bám dính nuôi cấy tăng sinh Nhưng phải nồng độ phù hợp chưa Chính vậy, nghiên cứu khảo sát nuôi cấy tế bào PHB-V nồng độ từ 0,5% 1,25% Kết nồng độ PHB-V 0,5% số lượng tế bào/giếng đạt là: 3,50 ± 0,81 x 105 tế bào; 0,75%: 5,71 ± 0,84 x 105 tế bào; 1%: 5,03 ± 0,47 x 105 tế bào; 1,25%: 4,00 ± 0,08 x 105 tế bào; mẫu đối chứng (ĐC): 8.46 ± 0,47 x 105 tế bào Kết cho thấy có nồng độ PHB-V 0,75% nuôi cấy tế bào cho kết số lượng cao Trong nghiên cứu tất mẫu có số lượng tế bào thấp so với mẫu đối chứng nuôi cấy thông thường plate nhựa nuôi cấy, chưa phải điều kiện chọn tối ưu màng PHB-V Một số công trình khác giới công bố cho thấy sử dụng màng polymer sử dụng PHB nồng độ 1% Tuy nhiên nghiên cứu sử dụng màng PHB-V lại cho kết tối ưu Chính chọn nồng độ PHB-V nồng độ 0,75 % sử dụng cho nghiên cứu 3.3.2 Kết nuôi cấy tế bào màng PHB-V 0,75% khảo sát thể tích khác Sau thử nghiệm tạo màng PHB-V nồng độ 0,75% với thể tích khác từ 4ml, 5ml, 6ml, 7ml, 8ml, 9ml, 10ml đĩa có đường kính d = 10cm Kết đánh giá thông qua số lượng tế bào sau 12 ngày nuôi cấy thể biểu đồ 3.2 bảng 3.5 SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 33 Khóa luận tốt nghiệp Số lượng tế bào 1.400.000 Viện Đại học Mở Hà Nội 1.333.333 1.265.000 1.200.000 1.000.000 785.833 778.333 800.000 706.667 676.667 581.667 558.333 600.000 400.000 200.000 ĐC 10 Thể tích PHB-V (ml) Biểu đồ 3.2: Kết xác định mật độ tế bào gốc mô mỡ khảo sát tạo màng tế bào thể tích PHB-V 0,75% khác Bảng 3.2: Kết số lượng tế bào nuôi màng PHB-V 0,75% khảo sát thể tích khác PHB-V 0,75 % Tổng số tế bào thể tích khác (ml) ĐC 1.333.333 ± 24.664 558.333 ± 7.637 676.667 ± 7.637 778.333 ± 15.275 1.265.000 ± 10.000 785.833 ± 4.041 581.667 ± 2.886 10 706.667 ± 11.547 SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 34 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Độ dày mỏng màng PHB-V không phụ thuộc vào nồng độ PHB – V hòa tan dung môi mà phụ thuộc vào thể tích đổ màng Độ dày mỏng của màng PHB-V có ảnh hưởng đến khả bám dính nuôi cấy tăng sinh tế bào màng hay không Vì thế, tiến hành thí nghiệm tạo màng PHB-V có nồng độ 0,75% với thể tích khác 4ml, 5ml, 6ml, 7ml, 8ml, 9ml, 10ml đĩa có đường kính d = 10cm Kết thu màng có độ dày khác Các màng sau hấp tiệt trùng 1210C, 15 phút tiến hành thử nghiệm làm giá thể nuôi TBG mô mỡ để tìm màng PHB-V 0,75% thể tích cho kết tăng sinh TBG mô mỡ tốt Kết thống kê cho thấy TBG nuôi màng PHB-V 0,75% thể tích 7ml cho kết cao 1.265.000 ± 10.000 tế bào, ỏ thể tích lớn như: 8ml (785.833 ± 4.041), PHB-V 0,75% 9ml (581.667 ± 2.886), PHB-V 0,75% 10ml (706.667 ± 11.547) cho số lượng tế bào thấp Điều nồng độ màng PHB đổ với thể tích lớn màng PHB-V tạo thành dày hơn, ảnh hưởng đến tính bám dính tăng sinh TBG mô mỡ Kết TBG mô mỡ nuôi màng PHB-V 0,75% 4ml, PHB-V 0,75% 5ml, PHB-V 0,75% 6ml khác biệt với khác biệt so với đối chứng Từ kết nghiên cứu đánh giá thông qua phân tích số lượng tế bào chọn thể tích đổ màng PHB-V 0,75% 7ml thể tích tối ưu để tiến hành thí nghiệm Sau khảo sát điều kiện tối ưu tiến hành nuôi cấy tạo màng tế bào Kết thu tế bào gốc có khả bám dính tốt khả tăng sinh mạnh, sau 12 ngày đạt mật độ 60-80% diện tích bề mặt màng PHB-V Sau cố định nhuộm màng với Giemsa cho thấy PHB-V có lớp tế bào bắt mầu với thuốc nhuộm Như nuôi cấy màng tế bào gốc mô mỡ màng polymer sinh học PHB-V, kết thể hình SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 35 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.6: Kết nuôi cấy tạo màng tế bào gốc mô mỡ màng PHB-V SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 36 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội KẾT LUẬN Đã nuôi cấy tăng sinh dòng tế bào gốc mô mỡ có mã số BV103-37: - Các TBG từ mô mỡ sau nuôi cấy môi trường MSC bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, nuôi cấy nhiệt độ 37°C, 5% CO2 Kết sau 24 tế bào tế bào có khả bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy, có dạng hình thoi giống nguyên bào sợi, có xu hướng mọc thành đám sau tạo lớp tế bào đơn bề mặt đĩa nuôi cấy - Khi nhuộm bắt mầu thuốc nhuộm rõ với hình ảnh tế bào đơn nhân, bào tương trải rộng dạng hình thoi - Sau ngày nuôi cấy đạt mật độ 60-80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy, Kết có ý nghĩa đạt yêu cầu việc tạo nguồn TBG mô mỡ làm nguyên liệu để cung cấp cho việc tạo màng tế bào gốc màng PHB-V Đã tạo màng tế bào gốc mô mỡ màng polymer sinh học PHB-V: - Đã tạo màng PHB-V, quan sát màng có mầu trắng đục, có độ dai, mềm màng PHB-V sử dụng làm giá đỡ nuôi cấy tế bào - Môi trường nuôi cấy màng tế bào PHB-V môi trường MSC bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, nuôi cấy nhiệt độ 37°C, 5% CO2 - Sau 24 tế bào tế bào có khả bám dính bề mặt màng PHBV, sau 12 ngày tế bào tăng sinh che phủ 60% diện tích bề mặt màng PHB-V - Với nồng độ tạo màng PHB-V 0,75% số lượng tế bào đạt 5,71 ± 0,84 x 105 tế bào/giếng, thể tích dung dịch tạo màng ml số lượng tế bào đạt 1.265.000 ± 10.000 tế bào SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 37 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội KIẾN NGHỊ Đề tài nuôi cấy tăng sinh TBG mô mỡ đủ điều kiện để tạo nguồn sử dụng cho nghiên cứu nuôi cấy tạo màng tế bào màng PHB-V Kết bước đầu khảo sát điều kiện nuôi cấy tạo màng tế bào màng polymer sinh học PHB-V Tuy nhiên khuôn khổ thời gian có hạn để hoàn thiện đề tài cần tiếp tục theo dõi nuôi cấy màng tế bào màng PHB-V với thời gian dài Nghiên cứu cần phải đánh giá khả kích ứng đánh giá hiệu màng tế bào mô hình động vật SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 38 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: Lê Năm, Nguyễn Gia Tiến (2011) Phát triển kỹ thuật công nghệ ứng dụng điều trị thảm họa bỏng, Báo Khoa học - Công nghệ Margie Peden (2008) Báo cáo Thế giới thương tích trẻ em Tổ Chức Y tế Thế Giới Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009) Công nghệ Tế Bào Gốc Nhà xuất giáo dục Việt Nam Đỗ Minh Trung (2013) Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương Luận án tiến sĩ Tài liệu nước Gunalp Uzun, Abdul Kerim Yapıcı, Yasin Ilgaz (2014) Adipose-derived mesenchymal stem cells in wound healing: A clinical Review Dis Mol Med 2: 57-64 Dominici M, Le Blanc K, et al., (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement Cytotherapy, 8(4):315-317 Mitchell JB, McIntosh K, Zvonic S et al (2006) Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers Stem Cells 24: 376 Zhu Y, Liu T, Song K, Fan X, Ma X, Cui Z (2008) Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC Cell Biochem Funct 26 (6): 664-75 Pak J et al (2011) Regeneration of human bones hip osteonecrosis and human cartilage in knee osteoarthritis with autologous adipose-tissue-derived stem cells: a case series Journal of Medical case reports 5: 296 SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 39 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 10 Patricia A Zuk, Min Zhu, Hiroshi Mizuno (2001) Multilineage Cells from Human Adipose Tissue: Implications for Cell-BasedTherapies Tissue Engineering 7(2):211-228 11 Fereydoun D., Bahar S-A., Mandana M., Farhad S., Behrooz N Mesenchymal stemm cell therapy for knee osteoarthritis Preliminary report of four patients International Journal of Rheumatic Disease, 2011, 14: 211 215 12 Kevin B.L., James H.P., Im Chim S., Lenny A., Engh Hin L Injectable mesenchymal stem cell therapy for large cartilage defects – a porcine model Stem Cells, 2007, 25: 2964-2971 13 P Koenen, T A Spanholtz, M Maegele et al., “Acute and chronic wound fluids inversely influence adipose-derived stem cell function: molecular insights into impaired wound healing,” International Wound Journal, vol 12, no 1, pp 10–16, 2015 14 Y Wu, S Huang, J Enhe et al., “Bone marrow-derived mesenchymal stem cell attenuates skin fibrosis development in mice,” International Wound Journal, vol 11, no 6, pp 701–710, 2014 15 V I Shumakov, N A Onishchenko, M F Rasulov, M E Krasheninnikov, and V A Zaidenov, “Mesenchymal bone marrow stem cells more effectively stimulate regeneration of deep burn wounds than embryonic fibroblasts,” Bulletin of Experimental Biology and Medicine, vol 136, no 2, pp 192–195, 2003 16 M F Rasulov, A V Vasilchenkov, N A Onishchenko et al., “First experience of the use bone marrow mesenchymal stem cells for the treatment of a patient with deep skin burns,” Bulletin of Experimental Biology and Medicine, vol 139, no 1, pp 141–144, 2005 17 M F Rasulov, V T Vasilenko, V A Zaidenov, and N A Onishchenko, “Cell transplantation inhibits inflammatory reaction and stimulates repair processes in burn wound,” Bulletin of Experimental Biology and Medicine, vol 142, no 1, pp 112–115, 2006 SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 40 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 18 CHAW SU THWIN (2004) Fabrication, characterization and degradation ò PHB and PHB-V microspheres for liver cell growth 19 Avella, M.; Immirzi, B., Malinconico, M.; Martuscelli, E.; Volpe, M.G (1996) Reactive blending methodologies for Biopol Polym Int., 39, 191-204 20 Parikh, M.; Gross, R.A.; MacCarthy, S.P (1998) The influence of injection molding conditions onbiodegradable polymers J Injection Molding Technol 1998, 2, 30 21 Isabelle Vroman and Lan Tighzert (2009) Biodegradable Polymers, Materials 2009, 2, 307-344 22 Bonartsev A.P, Myshkina1 V.L, Nikolaeva1 D.A, Furina1 E.K,Makhina1 T.A, Livshits V.A, Boskhomdzhievl A.P, Ivanov1 E.A, Iordanskii A.L, and Bonartseva G.A (2007) Biosynthesis, biodegradation, and application of poly(3hydroxybutyrate) and its copolymers - natural polyesters produced by diazotrophic bacteria 23 Doyle, C., E.T Tanner and W Bonfield (1991) In vitro and in vivo evaluation of polyhydroxybutyrate and of polyhydroxybutyrate reinforced with hydroxyapatite, Biomaterials, 12, pp 841-847 24 Kassab, A.C., K Xu, E.B Denkbas, Y Dou, S Zhao and E Piskin (1997) Rifampicin carrying polyhydroxybutyrate microspheres as a potential chemoembolization agent, J Biomater Sci Polym Ed., 8, pp 947-961 SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 41 [...]... tăng sinh che phủ trên 60% diện tích bề mặt màng PHB- V, kết quả được thể hiện thông qua nhuộm tế bào v i giemsa (hình 3.4B) Như v y tế bào có thể nuôi cấy được trên màng PHB- V v tiếp tục sử dụng màng PHB- V cho các nghiên cứu tiếp theo Hình 3.4: Nuôi cấy TBG trên nền màng PHB- V nồng độ 0,75% (A: TBG mô mỡ nuôi cấy trên màng PHB- V chưa cố định v nhuộm; B: TBG mô mỡ được cố đinh v nhuộm Giemsa, 10X) SVTH:... được màng PHB SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 23 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 2.1: Tạo màng PHB V (A: Cân xác định khối lượng PHB- V; B: khuấy tan bột PHB- V; C: tạo màng PHB- V) 2.2.6 Nuôi cấy cấy tế bào trên màng PHB- V Để nuôi cấy được tế bào trên nền màng PHB- V Mẫu tế bào gốc được nuôi cấy trong đĩa nhựa có môi trường MSC bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, nuôi cấy. .. nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3 Nuôi cấy TBG mô mỡ trên nền màng PHB Để đánh giá được màng PHB- V có thể làm giá đỡ để nuôi cấy được tế bào Tế bào sau khi cấy chuyển được chuyển lên màng PHB- V có nồng độ 1% Nuôi cấy trong môi trường MSC bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C, 5% CO2 Kết quả sau 24 giờ tế bào tế bào có khả năng bám dính trên bề mặt màng PHB- V (hình 3.4) sau 12 ngày tế bào. .. Hà Nội Để điều trị v t thương, v t bỏng hiệu quả, bên cạnh việc tạo nguồn v ứng dụng tế bào gốc thì việc kết hợp v i v t liệu như giá thể (màng sinh học) cũng v cùng quan trọng Giá thể v a là v t liệu để tế bào sinh trưởng v phát triển trên đó v tạo thành lớp màng tế bào bền chắc, dễ dàng sử dụng v che phủ v t thương Hiện nay Poly (3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) - PHB- V, được biết đến như... máu, tế bào nội mô mạch máu, tế bào quanh mạch, các đại thực bào v tế bào lympho Trong số các tế bào của mô mỡ, phân đoạn tế bào nền mạch máu (stromal-vascular fraction: SVF) được quan tâm nhiều trong nghiên cứu tế bào gốc, v đây là nguồn cung cấp các tế bào gốc đa tiềm năng Hình 1.5: Hình ảnh tế bào gốc mô mỡ ( Nguồn: https://en.wikipedia.org/Adipose_tissue.png ) Năm 2001, Patricia Zuk v nhóm nghiên. .. khi các tế bào phát triển huyền phù như tế bào tạo máu không có khả năng tăng sinh v bị loại bỏ trong quá trình nuôi Sau v i lần cấy chuyền, các tế bào không phải tế bào gốc như tế bào nội mô có khả năng tăng sinh v chu kỳ sống có giới hạn không thể duy trì trong điều kiện nuôi cấy v v y mất đi trong quá trình nuôi Lượng tế bào gốc mô mỡ (adipose derived stem cells- ADSCs) thu nhận từ mô mỡ tương... nghiên cứu v PHB v PHB- V PHB v PHB- V được coi như một v t liệu thích hợp được sử dụng như một giá đỡ hay chất nền trong công nghệ mô [Sodian v CS.,2000; Kose v CS.,2003; Nebe v CS.,2001] Nghiên cứu của Nebel v CS đã công bố cho thấy PHB- V là v t liệu không gây độc tế bào Trong số các PHAs, polime phân huỷ sinh học được nghiên chính là một copolimer của hydroxybutyrate v hydroxyvalerate (HV) Nó... khi tế bào tăng sinh v che phủ khoảng 80% diện tích bề mặt nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển nuôi cấy tăng sinh tiếp v một phần được nuôi cấy trên màng PHB- V (PHB- V được khảo sát ở các tỷ lệ, nồng độ khác nhau, màng PHB- V được hấp v trùng ở 1210C, thời gian 15 phút trước SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 24 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội khi tiến hành nuôi cấy tế bào) , màng. .. pháp trên Dung dịch PHB- V cho bay hơi chloroform ở điều kiện tĩnh, Kết quả thu được màng PHB- V, màng PHB- V tạo được khi quan sát có mầu trắng đục, có độ dai, mềm Màng PHB- V được gửi đi phân tích, đánh giá v được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Hình 3.3 Hình ảnh kết quả tạo được màng PHB- V (A: bóc tách màng PHB- V tạo được; B: màng PHB- V để sử dụng cho nuôi cấy tế bào) SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD:... hợp cho việc tạo v t liệu cấy ghép ở người SVTH: Nguyễn Thị Thúy Mai GVHD: TS Đỗ Minh Trung 20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN II: V T LIỆU V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 V t liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: - Bột PHB- V là sản phẩm thuộc đề tài được sử dụng để tạo màng PHB- V - Mẫu tế bào gốc có ký hiệu BV103-37 được cung cấp từ Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân