VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ75 NỘI SINH Giáo viện hướng dẫn 1: NCS ThS Vũ Thị Hạnh Nguyên Giáo viên hướng dẫn 2: TS Phí Quyết Tiến Họ tên sinh viên: PHÙNG THỊ HƯỜNG Lớp: 1203-K19 Hà Nội - 2016 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ75 NỘI SINH Giáo viện hướng dẫn 1: NCS ThS Vũ Thị Hạnh Nguyên Giáo viên hướng dẫn 2: TS Phí Quyết Tiến Họ tên sinh viên: PHÙNG THỊ HƯỜNG Lớp: 1203-K19 Hà Nội - 2016 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết báo cáo trung thực chưa sử dụng báo khoa học Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực báo cáo cảm ơn ghi rõ nguồn gốc Hà nội, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh viên Phùng Thị Hường SV: Phùng Thị Hường Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trước hết , với tất lòng, xin chân thành cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến NCS ThS Vũ Thị Hạnh Nguyên tận tình hướng dẫn dìu dắt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Đồng thời cảm ơn cán phòng công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, người giúp đỡ bảo tận tình trình thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập thực tập Bên cạnh đó, xin cảm ơn người thân gia đình, bạn bè người tạo điều kiện giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần để hoàn thành luận văn Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quí báu đó! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Phùng Thị Hường SV: Phùng Thị Hường Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG PHẦN I: MỞ ĐẦU Bảng 2.1: Các kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh dược liệu 14 Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái chủng S cavourensis YBQ75 môi trường nuôi cấy khác 29 Bảng 4.2: Ảnh hưởng nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng chủng S cavourensisYBQ75 30 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 35 Bảng 4.4 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 36 SV: Phùng Thị Hường Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Ảnh quét hiển vi điện tử bề mặt dưa chuột sau ngày gây nhiễm với Streptomyces sp MBCu-56 (A) Hệ sợi bề mặt (B) Hệ sợi xạ khuẩn xâm nhập phát triển trên, bề mặt lớp biểu bì 13 Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc (A) môi trường YIM38 hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử kính hiển vi quang học có độ phóng đại 2.500 lần (B) 20.000 lần (C) chủng chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 30 Hình 4.2: Khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn MRSA MRSE chủng S.cavourensis YBQ75 môi trường khác 32 Hình 4.3: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 33 Hình 4.4: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 34 Hình 4.5: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 36 Hình 4.5: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh MRSA, MRSE 37 Hình 4.6: Ảnh hưởng độ thông khí đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng YBQ75 nội sinh 38 Hình 4.8: Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 39 Hình 4.9: Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng VSV kiểm định MRSA, MRSE chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 40 SV: Phùng Thị Hường Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tên đầy đủ ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylate CKS Chất kháng sinh ĐKVKK Đường kính vòng kháng khuẩn ISR Hệ thống miễn dịch Kb Kilo bazơ HGT Hệ thống chuyển gen ngang KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh MRSA 10 MRSE 11 NRPS Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 25923 Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) ATCC 35984 nonribosomal peptide synthetases 12 PKS-II Polyketide synthase II 13 PKS-I Polyketide synthases I 14 RA xoắn đơn giản hình móc câu 15 RF dạng thẳng hay cong 16 S dạng xoắn thật hay dạng lò xo 17 VSV Vi sinh vật SV: Phùng Thị Hường Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH .4 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 10 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 2.1 Xạ khuẩn nội sinh dược liệu 11 2.1.1 Xạ khuẩn nội sinh mối tương quan xạ khuẩn với chủ 11 2.1.2 Khả sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn nội sinh 14 2.1.2 Tiềm ứng dụng xạ khuẩn nội sinh 14 2.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 16 2.2.1 Đặc điểm hình thái phân bố tự nhiên 16 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn 18 2.2.3 Một số nghiên cứu chi Streptomyces 19 2.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 20 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 20 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 21 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Vật liệu 23 3.1.1 Chủng giống vi sinh vật 23 SV: Phùng Thị Hường Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học 3.1.2 Hóa chất 23 3.1.3 Thiết bị 23 3.1.4 Môi trường 23 3.2 Phương pháp nghiên cứu 24 3.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng S.cavourensis YBQ75 24 3.2.2 Bảo quản giống 25 3.2.4 Lựa chọn môi trường lên men 26 3.2.5 Xác định thành phần môi trường lên men 27 3.2.6 Ảnh hưởng điều kiện lên men: 27 3.2.7 Đông thái trình lên men: 28 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn S cavourensis YBQ75 nội sinh 29 4.1.1 Đặc điểm hình thái bề mặt chuỗi bào tử xạ khuẩn S cavourensis YBQ75 nội sinh 29 4.4.2 Ảnh hưởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn S cavourensis YBQ75 30 4.2 Lựa chọn môi trường lên men 31 4.3 Ảnh hường thành phần môi trường đề khả sinh chất kháng khuẩn chủng YBQ75 nội sinh 32 4.3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 32 4.4 Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh môi trường thay 34 4.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi 34 4.3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu 35 4.3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống 36 SV: Phùng Thị Hường Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học 4.3.4 Ảnh hưởng độ thông khí 37 4.4 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh………………………………………… 39 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 SV: Phùng Thị Hường Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học Hình 4.2: Khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn MRSA MRSE chủng S.cavourensis YBQ75 môi trường khác Kết hình 4.2 cho thấy, chủng S.cavourensis YBQ75 có khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn cao nuôi cấy môi trường MT3 với đường kính vòng vô khuẩn MRSA MRSE đạt 23-23,3 mm 22.522.8 mm Các môi trường lại cho hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn, đường kính vòng vô khuẩn dao động khoảng từ 8,3-21,8 mm Như MT3 môi trường thích hợp cho khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 MT3 có thành phần(g/l): CaCO31, casein thủy phân 2, dextrin12,5, NH4Cl 1,5, bột đậu tương 12,5, pH=7, nước cất 1000 ml lựa chọn làm môi trường lên men chủng YBQ75 nghiên cứu 4.3 Ảnh hường thành phần môi trường đề khả sinh chất kháng khuẩn chủng YBQ75 nội sinh 4.3.1.Ảnh hưởng nguồn cacbon Trên sở môi trường MT3 lựa chọn, thay đổi nguồn cacbon khác nhau.Glucose, rỉ đường, bột đao,saccaroza, dextriose, tinh bột tan, glycerin dextrin, manitol để xác định mức độ ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả sinh trưởng hình thành chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh Kết trình bày hình 4.3 SV: Phùng Thị Hường 32 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học Hình 4.3: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh Dựa vào kết cho ta thấy chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh phát triển tốt sinh tổng hợp kháng kháng khuẩn tất nguồn cacbon nghiên cứu Chủng phát triển tốt với nguồn cacbon manitol, thể qua đường kính vòng vô khuẩn MRSA MRSE đạt 24,1 mm, 23,3 mm,tiếp đến nguồn cacbon dextrose hai chủng kiểm định, chủng phát triển tương đối đồng môi trường có nguồn cacbon tinh bột tan, glucose, bột đao, rỉ đường MRSA có đường kính vòng kháng khuẩn khoảng 17,4-19,9 mm, phát triển môi trường có nguồn cacbon glycerol, saccarose Đối với MRSE chủng phát triển tương đối đồng môi trường có nguồn cacbon glucose, bột đao, rỉ đường MRSA có đường kính vòng kháng khuẩn khoảng 15,2-17,2 mm, phát triển môi trường có nguồn cacbon glycerol, saccarose tinh bột tan Như vậy, nguồn cacbon sử dụng chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh phát triển sinh kháng sinh cao môi trường có nguồn cacbon manitol cho nghiên cứu 4.3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ Nguồn nitơ có ảnh hưởng lớn đến trình sinh tổng hợp vancomyxin chủng S cavourensis YBQ75, nên tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ khác như: cao ngô, bột lạc, bột đậu tương, cao nấm mem, pepton, trypton, cao malt, cao thịt SV: Phùng Thị Hường 33 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học Hình 4.4: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh Kết hình 4.4 cho thấy, chủng S cavourensis YBQ75 phát triển tốt sinh tổng hợp kháng sinh tất nguồn nito nghiên cứu Chủng phát triển tốt với nguồn nito bột đậu tương, với đường kính vòng kháng khuẩn MRSA MRSE đạt 24,3 -23,7mm,các môi trường chứa bột lạc, cao nấm men, trypton, cao malt, cao thịt phát triển đồng có đường kính vòng kháng khuẩn đạt từ 13,1-21,5 mm, phát triển môi trường có nguồn nitơ cao ngô pepton hai chủng kiểm định Như vậy, nguồn nito sử dụng S cavourensisYBQ75 phát triển sinh kháng sinh cao môi trường có nguồn nito bột đậu tương cho nghiên cứu 4.4 Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh môi trường thay Từ MT3 chọn thay đổi nguồn cacbon nguồn nito thích hợp nhất, tiếp tục lựa chọn điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 4.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi Để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 tiến hành lên men môi trường thay với nhiệt độ ban đầu thay đổi từ 20-40˚C Kết trình bày bảng 4.3 SV: Phùng Thị Hường 34 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học Bảng 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh Nhiệt độ ˚C 20 MRSA (ĐKVKK) (mm) 12,6±0,25 MRSE (ĐKVKK) (mm) 10,5±0,35 25 18,0±0,20 17,6±0,20 30 23,8±0,10 23,3±0,15 37 22,3±0,25 21,6±0,25 40 18,7±0,20 16,6±0,15 Kết thu bảng 4.3 cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho chủng sinh trưởng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn 30°Cvới đường kính vòng kháng khuẩn đạt tới 23, mm MRSA 23,35 mm MRSE Ở nhiệt độ 25, 37 40°C cho hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn.Ở 20°C chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh sinh tổng hợp chất kháng khuẩn thấp 4.3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu Để nghiên cứu ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 tiến hành lên men môi trường thay với pH ban đầu thay đổi từ 6-8 Kết trình bày bảng 4.4.Dựa vào kết cho ta thấy chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh sinh trưởng tốt dải pH khảo sát (Bảng 4.4) Chủng YBQ75 nội sinh phát triển tốt môi trường trung tính acid, hoạt tính kháng khuẩn đạt cao nhất, đường kính vòng vôn khuẩn đạt 24,8, 24,0 mm VSV kiểm định MRSA, MRSE Ở pH kiềm acid khả sinh tổng hợp chất kháng MRSA, MRSE chủng YBQ75 nội sinh hẳn, đường kính vòng kháng khuẩn thấp pH đạt 8,8 13,5 mm MRSA, MRSE Như pH ban đầu thích hợp cho môi trường lên men chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh SV: Phùng Thị Hường 35 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học Bảng 4.4 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh STT pH MRSA (ĐKVKK) (mm) MRSE (ĐKVKK) (mm) 8,8±0,21 13,5±0,21 18,2±0,25 19,5±0,21 24,8±0,07 24,0±0,07 23,25±0,21 23,0±0,07 21,6±0,25 20.3±0,14 18,4±0,28 17.05±0,11 4.3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống Tỷ lệ tiếp giống ban đầu có ảnh hưởng đến trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng xạ khuẩn Giống nhân 48 đạt lượng sinh khối 20 mg/ml tiếp cho lên men Lượng giống tỷ lệ:1, 3, 5, 7, 9% theo thể tích dịch lên men Sau lên men với thời gian 72 xác định hoạt tính kháng khuẩn MRSA MRSE.Kết thể hình 4.5, 4.6 Hình 4.5: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh SV: Phùng Thị Hường 36 Khóa luận tốt nghiệp MRSE Khoa công nghệ sinh học MRSA Hình 4.5: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh MRSA, MRSE Ghi chú: 1,2:tỷ lệ giống 1%; 3,4: 3%; 5,6: 5%; 7,8: 7%; 9,10:9% Kết cho thấy tỷ lệ tiếp giống cho trình lên men thích hợp 5% với đường kính vòng vô khuẩn đạt 25,1 mm MRSA 24,4 mm MRSE Ở tỷ lệ tiếp giống lớn nhỏ 5% cho hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn, đường kính vòng kháng khuẩn dao động khoảng từ 18,3-23,7 mm Như chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh cho hoạt tính kháng khuẩn cao với tỷ lệ tiếp giống 5% 4.3.4 Ảnh hưởng độ thông khí Chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh vi sinh vật hiếu khí, nhu cầu oxy môi trường nhân giống lên men đóng vai trò quan trọng trình sinh tổng hợp chất kháng sinh Độ thông khí được khảo sát cách lên men chủng S cavourensis YBQ75nội sinhtrong bình tam giác 500 ml có tỷ lệ thể tích dịch lên men so với thể tích bình khác Kết thể hình 4.6 hình 4.7 SV: Phùng Thị Hường 37 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học Hình 4.6: Ảnh hưởng độ thông khí đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng YBQ75 nội sinh Trong đó: v: thể tích môi trường lên men (ml); V: thể tích bình lên men (ml) MRSA MRSE Hình 4.7: Ảnh hưởng độ thông khí đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng YBQ75 nội sinh MRSA, MRSE Ghi chú: 1,2: độ thông khí5%; 3,4: 10%; 5,6: 15%; 7,8: 20%; 9,10: 25% Kết hình 4.6, 4.7 cho thấy, nhu cầu sử dụng oxy hòa tan chủng S cavourensis YBQ75 cao, độ thông khí cao chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh sinh trưởng phát triển chủng tốt Ở độ thông khí 10% chủng phát triển sinh chất kháng khuẩn mạnh nhất, ĐKVKK MRSA MRSE đạt khoảng 25,2 24,5 mm Ở độ thông khí khác chủng phát SV: Phùng Thị Hường 38 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học triển đồng kháng sinh không cao 10% Như vây độ thông khí 10% (v thể tích dịch/V thể tích bình) lựa chọn cho nghiên cứu 4.4 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh Từ kết nghiên cứu điều kiện lên men, thành phần môi trường lên men, tiến hành nghiên cứu động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh môi trường điều kiện lựa chọn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh Chủng lên men bình tam giác lít với thể tích môi trường 50 ml, tỷ lệ tiếp giống 5%, pH ban đầu 6, nhiệt độ nuôi 30°C, thời gian nhân giống 48 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh sinh khối ướt sau 12 sau tiếp giống cách giờ/1 lần lần tiếp theo, lên men 120 Kết trình bày hình 4.8 4.9 Hình 4.8: Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh SV: Phùng Thị Hường 39 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học MRSE MRSE MRSA MRSA Hình 4.9: Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng VSV kiểm định MRSA, MRSE chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh Ghi chú: 1: lên men; 2: 12 sau lên men, sau cách lấy mẫu lần từ mẫu số đến mẫu 18(từ 16 đến 120 lên men) Khả sinh chất kháng khuẩn tăng mạnh sau 36 lên men đạt cao sau 48 lên men ĐKVKK VSV kiểm định MRSA MRSE đạt 27,1 29,9 mm Sau thời điểm đó, hoạt tính kháng khuẩn giảm nhanh Như vậy, thu hồi chất kháng khuẩn thích hợp sau 48 lên men SV: Phùng Thị Hường 40 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã nghiên cứu đặc điểm hình thái điều kiện nuôi cấy chủngS.cavourensis YBQ75trên môi trường thạch YIM38 Chủng sinh trưởng phát triển tốt nhiệt độ 28-30oC, pH 6-8 Lựa chọn môi trường lên men nguồn cacbon, nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S.cavourensis YBQ75 (g/l): Bột đậu tương 12,5; casein thủy phân 2,0; manitol 1,5; CaCO3 1,0; NH4Cl 1,5 Đã nghiên cứu điều kiện ban đầu thích hợp cho trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S.cavourensis YBQ75 môi trường lựa chọn là: nhiệt độ 30°C, pH6, độ thông khí 10%, tỷ lệ tiếp giống 5%, chủng cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất, cực đại chủng S.cavourensis YBQ75 nội sinh thu hồi 48 lên men KIẾN NGHỊ Xây dựng quy trình lên men chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh sinh chất kháng khuẩn quy mô Phòng thí nghiệm Tinh xác định cấu trúc chất kháng khuẩn từ dịch lên men chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh SV: Phùng Thị Hường 41 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Nguyễn Minh Khởi, Đào Văn Đôn, Hoàng Văn Lương, Trần Minh Ngọc, “Chiết xuất phân lập số phenollic glycosid từ quế chi Việt Nam (cinnamomum cassia blume)” Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kỳ Sơn, Phạm Thanh Huyền, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Trương Quốc Phong, Nguyễn Tiến Thành, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đa dạng di truyền xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ quế tỉnh Hòa Bình”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 52 (5B), 577-582 Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kỳ Sơn, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đánh giá sang lọc xạ khuẩn nội cộng sinh quế có khả kháng vi sinh vật gây bệnh”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12 (2), 365-371 Văn Thị Phương Như, Cao Ngọc Điệp (2013), “Phân lập đặc tính vi khuẩn nội cộng sinh lúa (Oryza sativa L.) trồng đất tỉnh Phú Yên, Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, (2), 450-454 Egorov N X (1976) Thực tập vi sinh vật học (Nguyễn Lân Dũng dịch) NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội; Lê Gia Hy (1994), "Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam Luận án Phó tiến sĩ sinh học" Biền Văn Minh (2000), "Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội" Tài liệu tiếng Anh Bérdy J (2005), “Bioactive microbial metabolites”, JAntibiot, (58), 1-26 10 Bacon CW, White JF (2000), Microbial endophytes, New York, Marcel Dekker SV: Phùng Thị Hường 42 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học 11 Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005), “Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects” Appl Environ Microbiol, (71), 4951-4959 12 Duong Minh Lam, Nguyen Dinh Viet and Tong Thi Mo (2014), “Screening for anticancer producing endophytic actinomycetes in three mangrove plant species”, Chemical and Biological Sci, 59 (9), 114-122 13 Franco C, Michelsen P, Percy N, Conn V, Listiana E, Moll S, Loria R, Coombs J (2007), “Actinobacterial endophytes for improved crop performance”, Australas Plant Pathol, (36), 524-531 14 Gangwar M, Dogra S and Sharma N (2011), “Antagonistic Bioactivity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plants”, Journal of Advanced Laboratory Research in Biology, 2(4), 154-157 15 Gewirtz DA (1999), “A critical evaluation of the mechanism of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin”, Biochem Pharmacol, (57), pp 727-741 16 Giorgio M, Pierantonio M, Emanuela S, Gaetano C, Luca G (2004), “Anthracycline: Molecular Advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotixicity”, Pharmacol Rew, (56), 185-229Robert EW, Hancock, Daniel S Chapple (1999) Peptite antibiotics Antimicrobial agents and chemotherapy: 131-1323 17 Robert EW, Hancock, Daniel S Chapple (1999) Peptite antibiotics Antimicrobial agents and chemotherapy: 131-1323 18 Furumai TK, Saitoh, Kakushima M, Yamamuto S, Suzuki K, Ikeda S, Kobara S, Hatori H, Oki T (1993) BMS-181184, A new pradimixin deverative Journal Antibiotic 46 (2): 265-274 19 Higashide E, Asai M, OotsuK TS, Kozay Y, Hasegawa T, Kishi T, Sugino Y, Yoneda M (1977), “Ansamitocins, a group of novel maytansinoid antibiotics with antitumour properties from Nocardia”, Nature (270), 721722 SV: Phùng Thị Hường 43 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học 20 Turkbiol (2003) Investigation of the Antimicrobial Acivity of some Streptomyces Isolates 27: 79-84 21 Jung HM, Kim SY, Hyun HH, Lee JK (2002) Ca2+ and Cu2+ supplementation augments vancomyxin production by Amycolatoppsis orientalis Biotechnology Letters 24: 293-296 22 Medical Microbioloy (2003) Inhibition of bacterial cell wall synthesis "The University of Texas Medical Branch at Galveston", 45-54 23 Kupchan SM, Komoda Y, Court WA, Thomas GJ, Smith RM, Karim A, Gilmore CJ, Haltiwanger RC, Bryan RF (1972), “Maytansine, a novel antileukaemic ansa macrolide from Maytenus ovatus”, J Am Chem Soc (94), 1355-1356 24 Li J, Zhao GZ, Chen HH, Wang HB, Qin S, Zhu WY,Xu LH, Jiang CL, Li WJ (2008), “Antitumour and antimicrobial activities of endophytic Streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest”, Lett Appl Microbiol (47), 574-580 25 Medical Microbioloy (2003) Inhibition of bacterial cell wall synthesis The University of Texas Medical Branch at Galveston: 45-54 26 Loria R, Bukhalid RA, Fry BA, King RR (1997), “Plant pathogenecity in the genus Streptomyces”, Plant Dis (81), 836-846 27 Lu CH, Shen YM (2007), “A novel ansamycin, naphthomycin K from Streptomyces sp J”, Antibiot (60), 649-653 28 Xin Xuan Wang,China doi:10.1155/2010/141876, Optemization of the Fermentation process of Actinomycetes strain 29 Yun Huong,china, Optimization of fermention Condition for Antibiotic production by Actinomycetes YJ1 strain against sclerotion sclerotiorum Doi:10.5539/Jas.v4n.7p95 30 Matsukuma S, okuda T, Watanabe J (1994), “Isolation of actinomycetes from pine litter layers”, Actinomycetologica (8) 57-65 31 Meguro A; Ohmura Y, Hasegawa S, Shimizu M, Nishimura T & Kunoh H (2006), “An endophytic actinomycete, Streptomyces sp MBR-52, that SV: Phùng Thị Hường 44 Khóa luận tốt nghiệp accelerates emergence Khoa công nghệ sinh học and elongation of plant adventitious roots”, Actinomycetologica (20), 1-9 32 Jeffrey.E.Janso, Biosynthetic Potential of phylogetically Unique Endophytic Actinomycetes from tropical plants 33 Jahis Alam, Extration puryication of antibacterial metabolites from actinomycetes spp.isotated from soil sample 34 Nimnoi P, Pongsilp N, Lumyong S (2010), “Endophytic actinomycetes isolated from Aquilaria crassna Pierre ex Lec and screening of plant growth promoters production”, World J Microbiol Biotechnol (26), 193-203 35 Hema shepagam N, Isolation of endoactino from medicinal plants 36 Endophytic micro ỏ ganisms from laves of spermacoce verticillato diversity antimi crobial activity: Raphael conti Ivana Cr.B.Cunha 37 Qin S, Xing K, Jiang JH, Xu LH, Li WJ (2011), “Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria”, Appl Microbiol Biotechnol (89), 457-473 38 ISP2M broth -ISP2 MB ,2% malt extract broth -MEB MPE 39 Sambrook J, Russell DW (2001), “Molecular cloning A laboratory manual, 3rded”, Cold Spring Harbor laboratory, NY 40 Shimizu M, Yazawa S, Ushijima Y (2009), “A promising strain of endophytic Streptomyces sp for biological control of cucumber anthracnose”, J Gen Plant Pathol (75), 27-36 41 Shirling EB, Gotilieb D (1972), “Cooperative deription of type cultures of Streptomyces” V.Additional descriptions, International journual of systematic Bacteriology (22), 265-394 42 Skarbek JD, Brady LR (1978), “Streptomyces cavourensis sp nov (nom Rev.) and Streptomyces cavourensis subsp Washingtonensis subsp Nov., a Chromomycin-producing subspecies”, International Journal of Systematic Bacteriology 28(1), 45-53 SV: Phùng Thị Hường 45 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học 43 Snipes CE, Duebelbeis DO, Olson M, Hahn DR, Dent WH, Gilbert JR, Werk TL, Davis GE, Lee-Lu R, Graupner PR (2007), “The endophytes in the stems and roots of rice”, MicrobEcol (53), 700-707 44 Sun Y, Cheng Z, Glick BR (2009), “The presence of a 1-aminocyclopropane-1carboxylate (ACC) deaminase deletion mutation alters the physiology of the endophytic plant growth promoting bacterium”, Burkholderia phytofirmans PsJN FEMS Microbiol Lett (296), 131-136 45 Suwanborirux K, Chang CJ, Spjut RW, Cassady JM (1990), “Ansamitocin P-3, a maytansinoid from Claopodium crispifolium and Anomodon attenuatus or associated actinomycetes”, Experientia (46), 117-120 46 Suzuki T, Shimizu M, Meguro A, Hasegawa S, Nishimura T, Kunoh H (2005), “Visualization of infection of an endophytic actinomycete Streptomyces galbus in leaves of tissue-cultured rhododendron”, Actinomycetologica (19),7-12 47 Thomson CJ, Bialphos SH (1995), “Genetics and Biochemistry of antibiotic production”, 197-222 48 Trease GE, Evans WC (1996), “A textbook of Pharmacognosy 14th ed Bailliere Tindall Ltd, London”, 832 49 Trenser HD and Danga F (1958), “Hydrogen sulfide production by Streptomyces as criteria for species differentiation”, J Bacteriol (76), 239 50 Munumbicin"Wide-spectrum antibiotics produced by Streptomycessp.NRRL30562 endophytics on Kenndia nigriscans" Mcrobiology 2675-2685 51 Pullen C, schmitz P, meurer K, bamberg DD , Lohmann S, Franc SDC, Groth I, Schlegel B, Mollmann U, Gollmick F, Grafe U, Leistner E(2002) "New and bioactive compounds from Streptomycesstrains residing in the wood of celastraceae" Planta 162-167 SV: Phùng Thị Hường 46 [...]... điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ75 nội sinh" 1.2 Mục đích và yêu cầu của nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ75 nội sinh có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao Lựa chọn môi trường và điều kiện thích hợp cho lên men lên men xạ khuẩn nội sinh Streptomyces cavourensis YBQ75 được phân lập từ... 4.1 Đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn S cavourensis YBQ75 nội sinh 4.1.1 Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử của xạ khuẩn S cavourensis YBQ75 nội sinh Màu sắc của khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất là tiêu chuẩn cơ bản để phân loại xạ khuẩn. Kết quả nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy của chủng S cavourensis YBQ75 được trình bày trong bảng 4.1 Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái của chủng S cavourensis YBQ75. .. đến quá trình tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn Đa số chất kháng sinh được dùng hiện nay là do xạ khuẩn sinh ra Sự sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần môi trường, điều kiện lên men * Thành phần môi trường Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như pH, nhiệt độ… và thành phần của môi trường lên men Để đảm bảo cho xạ khuẩn có thể... chọn và thay đổi các nguồn cacbon và nguồn nito thích hợp nhất, chúng tôi tiếp tục lựa chọn các điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 4.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng S cavourensis YBQ75 chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường thay thế với nhiệt độ ban đầu... cavourensis YBQ75 nội sinh Kết quả được trình bày ở hình 4.3 SV: Phùng Thị Hường 32 Khóa luận tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học Hình 4.3: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh Dựa vào kết quả trên cho ta thấy chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh có thể phát triển tốt và sinh tổng hợp kháng kháng khuẩn trên tất cả các nguồn cacbon nghiên cứu Chủng. .. năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh Nhiều loại xạ khuẩn nội sinh có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như Vi khuẩn, Virus và nấm đặc biệt là xạ khuẩn được phân lập từ các cây dược liệu.Vì vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới Phần lớn các chất kháng sinh được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn. .. cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường ái lực với các điều kiện sống khác nhau Những hiểu biết về sinh lý và mối tương tác phân tử giữa xạ khuẩn và thực vật là chìa khóa để sử dụng những đặc tính có lợi của xạ khuẩn nội sinh trong kích thích sinh trưởng ở thực vật Những nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh Sự đa dạng của xạ khuẩn sinh trong cơ thể... cao ngô và pepton đối với cả hai chủng kiểm định Như vậy, trong các nguồn nito sử dụng S cavourensisYBQ75 phát triển và sinh kháng sinh cao nhất trong môi trường có nguồn nito là bột đậu tương cho các nghiên cứu tiếp theo 4.4 Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh trên môi trường thay thế Từ MT3 đã chọn và thay đổi các nguồn cacbon và nguồn... dưỡng hơn môi trường lên men sẽ cho hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao Lượng giống, tuổi giống cũng có ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng sinh tổng hợp và thời gian sinh tổng hợp, thông thường lượng giống bổ sung vào môi trường lên men từ 2-10 % [18, 25] Ngoài ra, sự sinh tổng hợp chất kháng sinh từ vi sinh vật còn chịu ảnh hưởng của cơ chế điều hoà ngược Chất kháng sinh do chúng sinh ra tích luỹ trong... đến hiệu suất của quá trình lên men [22] c) Độ pH: pH thích hợp cho tổng hợp kháng sinh thường là trung tính Đối với chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces thì pH thích hợp là 6,5-8,0 Môi trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng đến quá trình này d) Nhân giống: sinh tổng hợp chất kháng sinh không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng giống Môi trường nhân giống giàu chất dinh dưỡng