BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP PECTINASE CỦA HANSENIASPORA UVARUM VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN CÀ PhÊ GVHD: TS LÊ HỒNG PHÚ SVTH: VÕ HƯỜNG VI MSSV: 11116080 SKL 0 Tp Hồ Chí Minh, tháng 7/2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2015-11116080 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP PECTINASE CỦA HANSENIASPORA UVARUM VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN CÀ PHÊ GVHD: TS LÊ HỒNG PHÚ SVTH: VÕ HƢỜNG VI MSSV: 11116080 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Võ Hƣờng Vi MSSV: 11116080 Ngành: Công nghệ Thực phẩm Tên khóa luận: Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp pectinase Hanseniaspora uvarum ứng dụng lên men cà phê Mã số khóa luận: 2015-11116080 Nhiệm vụ khóa luận: (1) Sinh viên khảo sát điều kiện nuôi cấy đối tƣợng Hanseniaspora uvarum để sinh tổng hợp pectinase (2) Bƣớc đầu ứng dụng enzim xử lý cà phê tăng chất trích hòa tan Ngày giao nhiệm vụ khóa luận: 20/01/2015 Ngày hoàn thành khóa luận: 15/07/2015 Họ tên ngƣời hƣớng dẫn: TS Lê Hồng Phú Nội dung yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đƣợc thông qua Trƣởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Tp.HCM, ngày… tháng… năm 2015 Trƣởng Bộ môn Ngƣời hƣớng dẫn i LỜI CẢM ƠN Chúng xin chân thành cảm ơn đến trƣờng đại học Sƣ Phạm Kỹ Thuật TPHCM, khoa Công nghệ Hóa học Thực phẩm, môn Công nghệ Thực phẩm, quý Thầy/Cô khoa tạo môi trƣờng, điều kiện cho học tập nghiên cứu tận tình bảo, truyền đạt kiến thức cho suốt năm qua Đó hành trang quý giá cho sau Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Hồng Phú tận tình hƣớng dẫn, hỗ trợ hết lòng trình thực đồ án tốt nghiệp giúp hoàn thành đồ án tốt nghiệp Dù cố gắng tìm hiểu, học hỏi kiến thức mà Thầy/Cô truyền đạt nhƣng thời gian hạn chế, kiến thức chuyên môn chƣa nhiều thân thiếu kinh nghiệm công tác nghiên cứu khoa học nên nội dung đề tài tránh khỏi sai sót Rất mong đóng góp ý kiến quý Thầy/Cô để đồ án tốt nghiệp đƣợc hoàn thiện Chúng xin chân thành cám ơn Tác giả khóa luận Võ Hƣờng Vi ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn nội dung đƣợc trình bày khóa luận tốt nghiệp riêng Tôi xin cam đoan nội dung đƣợc tham khảo khóa luận tốt nghiệp đƣợc trích dẫn xác đầy đủ theo qui định Ngày 15 tháng 07 năm 2015 Ký tên iii iv v vi vii viii ix x MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP i LỜI CẢM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iii PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN iv PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƢỜI PHẢN BIỆN vi PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA HỘI ĐỒNG XÉT BẢO VỆ KHÓA LUẬN viii MỤC LỤC xi DANH MỤC HÌNH xiii DANH MỤC BẢNG BIỂU xiv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xv TÓM TẮT KHÓA LUẬN xvi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở lý thuyết 1.1.1 Tổng quan cà phê 1.1.2 Tổng quan pectic 1.1.3 Tổng quan pectinase 11 1.1.4 Tổng quan Hanseniaspora uvarum 14 1.2 Cơ sở thực nghiệm 16 1.2.1 Nghiên cứu nƣớc trình lên men cà phê 16 1.2.2 Nghiên cứu giới trình lên men cà phê 16 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 2.1 Nguyên vật liệu 18 2.1.1 Cà phê 18 2.1.2 Vi sinh vật 18 2.2 Hóa chất 18 2.3 Thiết bị - dụng cụ 18 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp cấy truyền giữ giống 19 xi 2.4.2 Phƣơng pháp hoạt hóa giống nuôi cấy tăng sinh khối 19 2.4.3 Phƣơng pháp quan sát đặc điểm hình thái tế bào nấm men 19 2.4.4 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào nấm men 19 2.4.5 Phƣơng pháp làm dịch malt 20 2.4.6 Phƣơng pháp định lƣợng pectin 20 2.4.7 Phƣơng pháp xác định hoạt độ pectinase 21 2.4.8 Phƣơng pháp lên men 22 2.4.9 Phƣơng pháp xác định độ ẩm 22 2.4.10 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro tổng số (TCVN 5253-90) 22 2.4.11 Phƣơng pháp trích chất hòa tan 22 2.4.12 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng khử 23 2.4.13 Phƣơng pháp xử lý số liệu 23 2.5 Bố trí thí nghiệm 23 2.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ chất cảm ứng thời gian nuôi cấy tối ƣu cho tổng hợp pectinase 23 2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát số điều kiện môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu cho tổng hợp pectinase 24 2.5.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát xác định lƣợng chế phẩm enzim tối ƣu dùng cho lên men cà phê 24 2.5.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát xác định thời gian lên men tối ƣu sử dụng chế phẩm enzim 25 2.5.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra độc tố, hàm lƣợng caffeine 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 26 3.1 Một số thành phần vật liệu 26 3.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng, thời gian nuôi cấy tối ƣu cho tổng hợp pectinase 27 3.3 Khảo sát số điều kiện môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu cho tổng hợp pectinase 31 3.4 Khảo sát xác định lƣợng chế phẩm enzim tối ƣu dùng cho lên men cà phê 34 3.5 Khảo sát xác định thời gian lên men tối ƣu sử dụng chế phẩm enzim 36 3.6 Kiểm tra độc tố, hàm lƣợng caffeine 39 CHƢƠNG KẾT LUẬN 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC A xii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mặt cắt dọc cà phê Hình 1.2 Quy trình sản xuất cà phê nhân phƣơng pháp ƣớt Hình 1.3 Mô hình chuỗi mạch trung tâm pectin Hình 1.4 Sơ đồ pectate lyase phân cắt α-1,4-polygalacturonic axit chế βelimination 13 Hình 1.5.Hanseniaspora uvarum 15 Hình 3.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ cà rốt đến hoạt độ pectinase H uvarum 27 Hình 3.2 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase H uvarum 29 Hình 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến tổng hợp pectinase H uvarum 32 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ muối (NH4)2SO4 đến tổng hợp pectinase H uvarum 33 Hình 3.5 Ảnh hƣởng tỉ lệ chế phẩm đến hiệu lên men 35 Hình 3.6 Ảnh hƣởng thời gian lên men đến hiệu lên men 37 Hình 3.7 Biến thiên pH dịch lên men theo thời gian 38 xiii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Dự báo khả tiêu thụ cà phê giới đến năm 2015 Bảng 1.2 Thành phần lớp nhớt Bảng 1.3 Thành phần hóa học cà phê tƣơi Bảng 1.4 Thành phần pectin loại rau khác 11 Bảng 3.1 Thành phần pectin có nguyên vật liệu 26 Bảng 3.2 Thành phần hóa học có cà phê nguyên liệu 26 Bảng 3.3 Sự thay đổi hoạt độ pectinase mẫu chế phẩm enzim từ H uvarum đƣợc nuôi cấy tỷ lệ bột cà rốt/ MT 27 Bảng 3.4 Sự thay đổi hoạt độ pectinase mẫu chế phẩm enzim từ H uvarum đƣợc nuôi cấy theo thời gian 29 Bảng 3.5 Sự thay đổi hoạt độ pectinase mẫu chế phẩm enzim từ H uvarum đƣợc nuôi cấy nồng độ đƣờng/MT 31 Bảng 3.6 Sự thay đổi hoạt độ pectinase mẫu chế phẩm enzim từ H uvarum đƣợc nuôi cấy nồng độ muối (NH4)2SO4/MT 33 Bảng 3.7 Sự thay đổi tỉ lệ tách nhớt nồng độ chất hòa tan dịch trích mẫu cà phê lên men có bổ sung chế phẩm tỉ lệ 35 Bảng 3.8 Sự thay đổi tỉ lệ tách nhớt nồng độ chất hòa tan dịch trích mẫu cà phê lên men có bổ sung chế phẩm theo thời gian lên men 36 Bảng 3.9 So sánh sản phẩm cà phê lên men tự nhiên lên men có bổ sung chế phẩm 40 xiv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ nguyên ĐC Đối chứng H uvarum Hanseniaspora uvarum MT Môi trƣờng TN Thí nghiệm VSV Vi sinh vật xv TÓM TẮT KHÓA LUẬN Lớp nhớt thành phần vỏ cà phê chứa tỉ lệ cao hợp chất pectin khó phân hủy tự nhiên, gây trở ngại trình xử lý cà phê sau thu hoạch trình tách chiết chất hòa tan có hạt cà phê Chúng nghiên cứu việc sử dụng chủng nấm men Hanseniaspora uvarum để sinh tổng hợp pectinase làm cho trình phân hủy diễn nhanh Hoạt độ pectinase đƣợc đo thông qua sản phẩm tạo thành axit galacturonic cho pectinase tác dụng với chất pectin Kết cho thấy chế phẩm pectinase đƣợc sản xuất từ chủng nấm menHanseniaspora uvarum môi trƣờng dịch malt 8oBrix, có chứa(NH4)2SO4 0,08%, chất cảm ứng bột cà rốt 4%, sau 36 đạt hoạt độ cao Ứng dụng vào trình lên men cà phê có bổ sung chế phẩm 11 với tỉ lệ chế phẩm 5% cho hiệu cao so sánh với mẫu lên men tự nhiên: tỉ lệ tách nhớt tăng 156,47%,nồng độ chất hòa tan dịch trích tăng 32,73%, hàm lƣợng caffeine tăng 3,21% Bƣớc đầu ứng dụng chế phẩm pectinase thô vào trình lên men cà phê khắc phục đƣợc nhƣợc điểm lên men tự nhiên, làcơ sở tiền đề cho nghiên cứu sâu hơn, đóng góp phần giá trị hƣớng phát triển nâng cao chất lƣợng cà phê công nghệ lên men Từ khóa:cà phê; Hanseniaspora uvarum; lên men; pectinase xvi MỞ ĐẦU Hiện nay, cà phê Việt Nam có diện tích gieo trồngđạt 653.000 (2014), sản lƣợng đạt 1,74 triệu (mùa vụ 2013/14) có xu hƣớng tăng nhẹ mùa vụ 2014/15, đứng thứ hai giới lƣợng xuất khẩu, nhƣng chủ yếu cà phê vối dạng nguyên liệu, chƣa qua chế biế n sâu Vì vậy, Việt Nam không thiệt hại giá trị, chịu nhiều thiệt thòi chƣa xây dựng đƣợc thƣơng hiệu ngƣời tiêu dùng giới, nhƣ không cạnh tranh đƣợc với sản phẩm nhập Theo Tổ chức cà phê quốc tế (ICO), năm tới, lƣợng tiêu thụ cà phê hoà tan tăng nhanh nƣớc phát triển Nhu cầu loại cà phê chất lƣợng cao tăng lên khuyến khích nƣớc sản xuất nhƣ Việt Nam cần điều chỉnh lại cấu sản xuất loại cà phê Trong nƣớc nay, công nghệ lên men cà phê (chế biến cà phê phƣơng pháp ƣớt) đƣợc nghiên cứu ứng dụng nhằm nâng cao khả khai thác thành phần hòa tan hạt cà phê, nhằm cải thiện hƣơng vị cà phê Các nghiên cứu cho thấy trình lên men cà phê hoạt động loại nấm sợi, vi khuẩn, nấm men enzim chúng, phân giải pectin để loại bỏ lớp vỏ nhớt khỏi hạt cà phê Trong đó, nấm men có ƣu điểm sản xuất pectinase, chúng sinh vật đơn bào, sinh trƣởng tƣơng đối đơn giản môi trƣờng phát triển không đòi hỏi chất cảm ứng dễ nuôi cấy quy mô lớn Ngoài ra, việc nhân gen xử lý gen cải thiện sản xuất enzim, điều cho thấy sản xuất enzim thƣơng mại nấm men khả thi Xuất phát từ đó, tiến hành thực đề tài: “Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp pectinase Hanseniaspora uvarum ứng dụng lên men cà phê” Nội dung đề tài: Nuôi cấy chủng Hanseniaspora uvarum môi trƣờng nuôi cấy khác nhau, khảo sát nồng độ chất cảm ứng thời gian nuôi cấy tối ƣu cho việc sinh tổng hợp pectinase cao Khảo sát điều kiện môi trƣờng nuôi cấy khác (nguồn carbon, nguồn nitơ) ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp pectinase Khảo sát khả xử lý lớp nhớt hạt cà phê enzim tổng hợp từ chủng Hanseniaspora uvarum (về tỉ lệ enzim, thời gian) Khảo sát hiệu suất trích chất hòa tan cà phê đƣợc lên men (về tỉ lệ enzim, thời gian) Kiểm tra mức độ an toàn cà phê đƣợc lên men tiêu vi sinh, tiêu độc tố nấm mốc Những đóng góp đề tài thành công: Chứng minh đƣợc Hanseniaspora uvarum có khả sinh tổng hợp pectinase có khả ứng dụng lên men cà phê Tìm thấy đƣợc điều kiện tối ƣu cho H uvarum sinh tổng hợp pectinase có hoạt độ cao Xây dựng đƣợc quy trình lên men cà phê sử dụng chế phẩm enzim từ H uvarum cho chất lƣợng cà phê tối ƣu Từ kết đạt đƣợc quy mô phòng thí nghiệm cho thấy tiềm nghiên cứu quy mô lớn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở lý thuyết 1.1.1 Tổng quan cà phê 1.1.1.1 Giới thiệu Cà phê thuộc họ Rubiaceae, chi Coffea, có nguồn gốc từ vùng cao nguyên Ethiopia khu vực lân cận vùng cao nguyên Sudan Kenya (Charrier Berthaud, 1985) Cà phê đƣợc trồng ngƣời Ả Rập vào kỷ 14, sau đƣợc giới thiệu đến vùng nhiệt đới vào kỷ 17 (Smith, 1985) Hiện cà phê chủ yếu đƣợc trồng vùng nhiệt đới cận nhiệt đới đƣợc tiêu thụ toàn giới Một số khu vực đƣợc biết đến sản xuất cà phê chất lƣợng cao, nhƣ vùng xích đạo châu Phi, Java, Sumatra đảo khác Đông Ấn, Tây Ấn, Ấn Độ, Arabia, đảo Thái Bình Dƣơng, Mexico, Trung Nam Mỹ (Anzueto cộng sự, 2005) 1.1.1.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ Theo Tổ chức cà phê quốc tế (ICO), năm tới, tiêu thụ cà phê giới đạt mức tăng trƣởng bình quân 1,3- 1,5%/năm Theo đó, đến năm 2015, lƣợng cà phê tiêu thụ toàn cầu đạt 145 triệu bao Lƣợng tiêu thụ cà phê hòa tan tăng nhanh nƣớc phát triển Nhu cầu loại cà phê chất lƣợng cao tăng lên khuyến khích nƣớc sản xuất điều lại cấu sản xuất loại cà phê, phát triển cà phê hữu Bảng 1.1 Dự báo khả tiêu thụ cà phê giới đến năm 2015 Năm 2010(*) 2015(*) Tăng bình quân 2010-2015 (%) Thế giới 130,73 145,00 2,10 Các nƣớc sản xuất 33,54 33,82 0,50 Các nƣớc nhập 97,19 102,88 1,40 (*) Đơn vị triệu bao Việt Nam thành viên quan trọng Tổ chức Cà phê giới (ICO) Cà phê Việt Nam đƣợc xuất sang thị trƣờng 70 quốc gia vùng lãnh thổ giới Đức, Hoa Kỳ, Bỉ, Tây Ban Nha, Italia, Nhật Bản thị trƣờng xuất cà phê Việt Nam Theo báo cáo hàng tháng Trung tâm Tin học Thống kê trực thuộc Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn cho biết xuất cà phê tháng 4/2015 ƣớc đạt 112.000 tấn, S K L 0