ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Dung NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ASPARAGINASE CỦA ASPERGILLUS ORYZAE TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Dung NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ASPARAGINASE CỦA ASPERGILLUS ORYZAE TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Thị Huyền TS Đinh Nho Thái Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Huyền trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, GS TS Trương Nam Hải nguyên trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, ThS Nguyễn Thị Hương Trà, Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch TS Đinh Nho Thái, Bộ môn Di truyền, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn Trong thời gian học tập nghiên cứu phòng Kỹ thuật Di truyền, tập thể cán nghiên cứu phòng, đặc biệt ThS Nguyễn Thanh Ngọc, CN Lê Tùng Lâm bảo giúp đỡ nhiệt tình Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội giảng dạy bảo cho kiến thức kỹ cần thiết Lời cuối cùng, xin chân thành cảm ơn cha mẹ, người thân gia đình đồng nghiệp ủng hộ, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn thời gian qua Xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Dung MỤC LỤC MỞ ĐẦU 10 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM Error! Bookmark not defined 1.1.1 Khả gây bệnh acrylamide Error! Bookmark not defined 1.1.2 Cơ chế tạo acrylamide sản xuất bánh nƣớngError! Bookmark not defined 1.1.3 Hàm lƣợng acrylamide số thực phẩmError! Bookmark not defined 1.2 ASPARAGINASE Error! Bookmark not defined 1.2.1 Asparaginase Error! Bookmark not defined 1.2.2 Ứng dụng asparaginase để làm giảm acrylamide thực phẩmError! Bookmark 1.2.3 Công nghệ sản xuất asparaginase Error! Bookmark not defined 1.2.3.1 Sản xuất asparaginase từ chủng E coli tái tổ hợp Error! Bookmark not defined 1.2.3.2 Sản xuất asparaginase từ chủng đƣợc chứng nhận an toàn (chủng GRAS) tái tổ hợp Error! Bookmark not defined 1.3 HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Error! Bookmark not defined 1.3.1 Những đặc điểm chung hệ biểu nấm menError! Bookmark not defin 1.3.2 Những ƣu điểm hệ biểu nấm menError! Bookmark not defined 1.3.3 Hệ biểu P pastoris Error! Bookmark not defined 1.3.3.1 Promoter AOX1 Error! Bookmark not defined 1.3.3.2 Chủng biểu Error! Bookmark not defined 1.3.3.3 Vector biểu gen Error! Bookmark not defined 1.3.3.4 Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P pastoris Error! Bookmark not defined 1.3.4 Quá trình tiết protein ngoại bào P pastorisError! Bookmark not defined Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 VẬT LIỆU Error! Bookmark not defined 2.1.1 Chủng vi sinh vật plasmid Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất, enzyme, máy móc thiết bị Error! Bookmark not defined 2.1.3 Dung dịch môi trƣờng sử dụng Error! Bookmark not defined 2.1.3.1 Môi trƣờng dung dịch sử dụng để biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH10b Error! Bookmark not defined 2.1.3.2 Dung dịch đƣợc sử dụng để tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli Error! Bookmark not defined 2.1.3.3 Dung dịch đƣợc sử dụng điện di DNA gel agarose Error! Bookmark not defined 2.1.3.4 Môi trƣờng biến nạp biểu gen ngoại lai tế bào nấm men P pastoris Error! Bookmark not defined 2.1.3.5 Dung dịch sử dụng điện SDS-PAGE Error! Bookmark not defined 2.1.3.6 Dung dịch sử dụng nhuộm bạc Error! Bookmark not defined 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.2.1 Nghiên cứu phân tích cải biến trình tự gen công cụ tin sinhError! Bookm 2.2.2 Phƣơng pháp PCR Error! Bookmark not defined 2.2.3 Điện di DNA gel agarose Error! Bookmark not defined 2.2.4 Quy trình biến nạp sốc nhiệt Error! Bookmark not defined 2.2.5 Quy trình tách DNA plasmid Error! Bookmark not defined 2.2.6 Kiểm tra DNA thu đƣợc enzyme hạn chếError! Bookmark not defined 2.2.7 Tinh DNA plasmid để gửi giải trình tự cột QiagenError! Bookmark no 2.2.8 Phản ứng nối ghép gen Error! Bookmark not defined 2.2.9 Biến nạp DNA vào tế bào nấm men phƣơng pháp xung điệnError! Bookmark 2.2.10 Lên men chủng P Pastoris Error! Bookmark not defined 2.2.11 Điện di SDS – PAGE Error! Bookmark not defined 2.2.12 Thử hoạt tính asparaginase phƣơng pháp điện di không biến tính thử hoạt tính đặt gel đĩa thạch Error! Bookmark not defined Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬNError! Bookmark not defined 3.1 CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN ASPARAGINASE CỦA A ORYZAE 3.1.1 Lựa chọn vùng gen thích hợp để biểu asparaginase tái tổ hợpError! Bookmark 3.1.2 Cải biến sơ gen asparaginse Error! Bookmark not defined 3.1.3 Đánh giá số phù hợp mã ba gen asp1 chủng biểu hiệnError! Bookm 3.1.4 Thiết kế vùng gen để biểu asp1 P pastorisError! Bookmark not defined 3.2 NHÂN DÒNG GEN ASP1 Error! Bookmark not defined 3.2.1 Kiểm tra dòng plasmid tái tổ hợp enzyme hạn chếError! Bookmark no 3.2.2 Giải trình tự gen asp1 Error! Bookmark not defined 3.3 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN pPIC-ASP1 Error! Bookmark not defined 3.3.1 Ghép nối gen asp1 vào vector biểu pPIC9Error! Bookmark not defined 3.3.2 Kiểm tra gen asp1 plasmid tái tổ hợp pPIC-asp1 PCRError! Bookmark 3.3.3 Tách lƣợng lớn vector biểu tái tổ hợp mang gen asp1Error! Bookmark not def 3.4 TẠO CHỦNG NẤM MEN P PASTORIS MANG ASP1 Error! Bookmark not defined 3.5 BIỂU HIỆN PROTEIN ASP1 TRONG NẤM MEN P PASTORIS SMD1168 TRONG BÌNH TAM GIÁC Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 11 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ Hình Sơ đồ minh họa hình thành acrylamide chế biến thực phẩm Error! Bookmark not defined Hình Sơ đồ minh họa chế phản ứng L-asparaginaseError! Bookmark not defined Hình Bản đồ vector biểu pPIC9 ngoại lai nấm men P pastoris Error! Bookmark not defined Hình Sự tích hợp vector biểu vào hệ gen P pastoris locus his4 Error! Bookmark not defined Hình Sơ đồ tóm tắt trình thiết kế vector biểu để biểu gen asp1 tế bào nấm men P pastoris SMD1168 Error! Bookmark not defined Hình Đồ thị dự đoán có mặt, vị trí điểm cắt tín hiệu tiết có asparaginase A oryzae Error! Bookmark not defined Hình Trình tự đoạn gen asp đƣợc sử dụng để cải biến biểu nấm men P pastoris Error! Bookmark not defined Hình Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp định biểu P pastoris (A) Biểu đồ mức độ phù hợp mã asp so với mã chủng biểu P pastoris (B) Error! Bookmark not defined Hình Đồ thị so sánh tần suất sử dụng codon hai chủng A oryzae (đỏ) P pastoris (đen) Error! Bookmark not defined Hình 10 So sánh trình tự protein đƣợc dịch mã từ gen asp asp1Error! Bookmark not defin Hình 11 So sánh trình tự gen asp1 đƣợc cải biến trình tự gen asp chƣa cải biến Error! Bookmark not defined Hình 12 Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp1 định biểu P pastoris (A) Biểu đồ phần trăm phù hợp mã gen asp1 đƣợc biểu chủng biểu P pastoris (B)Error! Bookmark not defined Hình 13 Trình tự gen asp1 cần đặt có chứa thêm trình tự mã hóa cho vị trí cắt tín hiệu tiết nấm men (trình tự đƣợc gạch chân), vị trí cắt enzyme giới hạn XhoI, NotI (đƣợc tô đậm) Error! Bookmark not defined Hình 14 Phân tích dòng plasmid pUC-asp1 gel điện di agarose 1% Error! Bookmark not defined Hình 15 Phân tích sản phẩm cắt plasmid pUC-asp1 cặp enzyme XhoI NotI gel agarose 1% Error! Bookmark not defined Hình 16 Sơ đồ vector pPIC9 (trái) ảnh điện (phải) kết cắt pPIC9 NotI (đƣờng chạy 1) XhoI ( đƣờng chạy 2) Error! Bookmark not defined Hinh 17 Phân tích gen asp1, pPIC9 sau đƣợc cắt cặp enzyme NcoI+XhoI đƣợc tinh chế gel agarose 1% Error! Bookmark not defined Hình 18 Ảnh điện di kết PCR kiểm tra có mặt gen asp1 vector pPIC9 cặp mồi AOX1 Error! Bookmark not defined Hình 19 Phân tích plasmid pPIC-asp1 sản phẩm cắt kiểm tra pPIC-asp1 NotI XhoI gel điện di agarose 1% Error! Bookmark not defined Hình 20 Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pPUC-asp1 StuIError! Bookmark not defined Hình 21 Sản phẩm biến nạp pPIC-asp1 vào nấm men P pastoris Error! Bookmark not defined Hình 22 Phân tích sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc chủng tái tổ hợp P pastoris SMD1168 mang gen asp1 với cặp mồi AOX1.Error! Bookmark not defined Hình 23 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng P pastoris tái tổ hợp theo thời gian Error! Bookmark not defined Hình 24 Phân tích protein ngoại bào từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp thời điểm khác gel polyacrylamide 12,6% Error! Bookmark not defined Hình 25 A: Gel không biến tính nhuộm Commassie; B: Xác định hoạt tính ASP gel thẩm thấu gel điện di không biến tính xuống đĩa thạch có 1% asparagine Error! Bookmark not defined Bảng Một số chủng P pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu protein tái tổ hợp Error! Bookmark not defined Bảng Khả sinh trƣởng dòng nấm men tái tổ hợp đƣợc giám sát thông qua OD600 theo thời gian lên men Error! Bookmark not defined BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic AOX Alcohol oxidase APS Ammonium persulfate ARN Axit ribonucleic ASP Asparaginase Amp Ampicillin BMGY Buffered Minimal Glycerol Yeast BMMY Buffered Minimal Methanol Yeast bp Base pair dNTP 2’- deoxyribonucleotide 5’ – triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ETBr Ethidium bromide E coli Escherichia coli GRAS Generally Recognized as Safe kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani MCS Multiple cloning site ( vị trí đa nối) MD Minimal Dextrose mARN Messenger RNA (ARN thông tin) P pastoris Pichia pastoris PCR Polymerase Chain Reaction ( phản ứng chuỗi trùng hợp) SDS Sodium dodecyl sunfat TAE Tris-acetate-EDTA TE Tris-EDTA MỞ ĐẦU Hiện tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ ngày tăng Một yếu tố dẫn đến bệnh ung thƣ chế độ ăn uống Những thực phẩm chứa nhiều mỡ, ƣớp muối, hun khói đƣợc coi thực phẩm dẫn đến bệnh chết ngƣời Tuy vậy, ngƣời dân nhận thức đƣợc thực phẩm tƣởng chừng vô hại nhƣ loại bánh nƣớng lại chứa acrylamide, chất có khả gây ung thƣ Năm 2002 nhà khoa học Thụy Điển tìm chất sản phẩm thực phẩm nhƣ khoai tây chiên, bánh mỳ, bánh quy, ngũ cốc [10] Acrylamide hình thành thực phẩm giàu tinh bột đƣợc chiên rán nhiệt độ 120oC Nguyên nhân nhiệt độ cao, asparagine bột làm bánh phản ứng với đƣờng khử tạo thành hợp chất có màu vàng nâu chứa acrylamide [29] Các nhà khoa học giới làm sáng tỏ sở khoa học việc sử dụng asparaginase để làm giảm lƣợng acrylamide thực phẩm giàu tinh bột nhờ việc loại bỏ asparagine Enzyme asparaginase xúc tác thủy phân asparagine thành axit aspartic ammonia, không cho asparagine tham gia phản ứng Maillard để hình thành acrylamide [8] Trên giới hãng Novozymes A/S Denmark sản xuất thƣơng mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi A oryzae ứng dụng công nghiệp thực phẩm với tên thƣơng mại Acrylaway®L (2007) [24] Trong dƣợc phẩm asparaginase đƣợc sử dụng điều trị bệnh ung thƣ máu với tên thƣơng mại Elspar [11] Hiện giá thành asparaginase thị trƣờng cao nên việc ứng dụng enzyme để làm giảm acrylamide trình chế biến thực phẩm chiên nƣớng Việt Nam hạn chế Với mong muốn tạo chủng sản xuất asparaginase tái tổ hợp giống với asparaginase thƣơng mại để sử dụng nƣớc, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu biểu gen mã hóa asparaginase Aspergillus oryzae nấm men Pichia pastoris” Nấm men P pastoris hệ thống biểu protein ngoại lai đƣợc nhà khoa học sử dụng rộng rãi đặc tính ƣu việt chủng an toàn sinh học, chủng eukaryote đơn giản, thực biến đổi sau dịch mã tốt, có khả sinh trƣởng mạnh tạo lƣợng sinh khối lớn trình lên men, thao tác dễ dàng [3,49] Ngoài ra, hệ thống P pastoris sản xuất lƣợng lớn protein mục tiêu với nguồn nguyên liệu methanol rẻ tiền bị tạp nhiễm Chính ƣu điểm mà P pastoris đƣợc xem hệ biểu thích hợp đƣợc lựa chọn để biểu gen mã hóa asparaginase từ nấm sợi A oryzae Hiện nay, có nhiều công trình giới biểu asparaginase từ nguồn khác để phục vụ chủ yếu cho mục đích chữa bệnh làm chất phụ gia Các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn thƣờng đƣợc biểu E coli Bacillus [27, 50, 51, 52] gen có nguồn gốc từ nấm thƣờng đƣợc biểu chủng nấm tƣơng ứng [36, 53, 54, 55] Ngoài có hai công trình nghiên cứu biểu asparaginase I III nấm men Saccharomyces cerevisiae nấm men P pastoris [53] Đây nghiên cứu sử dụng chủng nấm men P pastoris để biểu asparaginase A oryzae Toàn công việc nghiên cứu đƣợc tiến hành phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Trung (2002), Phân lập biểu gen mã hóa β- Amylase đậu tương nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Thùy Linh, Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Trần Ngọc Tân, Nguyễn Thị Thanh Nhành, Lê Văn Trƣờng, Phạm Văn Ty, Trƣơng Nam Hải (2010), “Ghép nối biểu gen mã hóa enterocin P vi khuẩn Enterococcus faecium Pichia pastoris X33”, Tạp Chí Công Nghệ Sinh Học 8, tr 221–226 3 Võ Viết Cƣờng, Lê Thị Huệ, Đỗ Thị Huyền, Lê Quỳnh Giang, Nguyễn Thị Quý, Trƣơng Nam Hải (2013), “Biểu gen HA5.1 đƣợc cải biến mã có hoạt tính sinh học nấm men Pichis pastoris X33”,Tạp Chí Sinh Học 35, tr 255–264 Vƣơng Cát Khánh, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Phạm Phƣơng Thanh, Đặng Thị Phƣơng Thảo, Trần Linh Thƣớc (2014), “Nghiên cứu cấu trúc sàng lọc dòng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp đa biểu nhân tố tăng trƣởng từ tiểu cầu (BBPDGF-BB) mức độ cao”, Tạp Chí Sinh Học 36, tr 77-83 Phạm Thị Kim Liên, Đặng Tất Trƣờng, Trần Văn Hiếu (2013), “Tạo dòng biểu nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu – đại thực bào HGM-CSF tái tổ hợp hệ thống Pichia pastoris”, Tạp Chí Phát Triển KH&CN, 3, tr 22-29 Nguyễn Thanh Ngọc, Lê Tùng Lâm, Nguyễn Thị Dung, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thị Hƣơng Trà, Trƣơng Nam Hải (2014), “Nghiên cứu biểu gen mã hóa Asparaginase Aspergillus oryzae nấm men Pichia pastoris” Tạp Chí Sinh Học, 36, TCSH14013 Đỗ Thị Hồng (2005), Nghiên cứu biểu vùng gen preM-env virus Dengue typ nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Anese, M., Quarta, B., and Frias, J (2011), “Modelling the effect of asparaginase in reducing acrylamide formation in biscuits”, Food Chem, 126, pp 435–440 Archer, A.H.S and D.L (2013), “Acrylamide in Foods: A Review and Update”, University of Florida, 4, pp 1-4 10 Budolfsen, G., Jensen, M.T., Heldt-Hansen, H.P., Stringer, M.A., and Lange, L (2004), Method of preparing a heat-treated product, United States Patent 8859023 11 Bunpo, P., Murray, B., Cundiff, J., Brizius, E., Aldrich, C.J., and Anthony, T.G (2008), “Alanyl-glutamine consumption modifies the suppressive effect of Lasparaginase on lymphocyte populations in mice”, J Nutr, 138, pp 338–343 12 Campbell, H.A., Mashburn, L.T., Boyse, E.A., and Old, L.J (1967), “Two LAsparaginases from Escherichia coli B Their Separation, Purification, and Antitumor Activity”, Biochemistry (Mosc), 6, pp.721–730 13 Cereghino, J.L., and Cregg, J.M (2000b), “Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol Rev, 24, pp 45–66 14 Choi, J.H., and Lee, S.Y (2004), “Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli”, Appl Microbiol Biotechnol, 64, pp 625– 635 15 Clare, J.J., Romanes, M.A., Rayment, F.B., Rowedder, J.E., Smith, M.A., Payne, M.M., Sreekrishna, K., and Henwood, C.A (1991), “Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies”, Gene, 105, pp 205–212 16 Claus, A., Carle, R., and Schieber, A (2008), “Acrylamide in cereal products: A review”, Journal Cereal Science, 47, pp 118–133 17 Cregg, J.M., Madden, K.R., Barringer, K.J., Thill, G.P., and Stillman, C.A (1989), “Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris”, Mol Cell Biol, 9, pp 1316–1323 18 DeJong, P.J (1972), “L-Asparaginase Production by Streptomyces griseus” Appl Microbiol, 23, pp 1163–1164 19 Dunlop, P.C., Meyer, G.M., Ban, D., and Roon, R.J (1978), “Characterization of two forms of asparaginase in Saccharomyces cerevisiae”, J Biol Chem, 253, pp 1297–1304 20 El-Bessoumy, A.A., Sarhan, M., and Mansour, J (2004), “Production, isolation, and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation”, J Biochem Mol Biol, 37, pp 387–393 21 Gellissen, G (2000), “Heterologous protein production in methylotrophic yeasts”, Appl Microbiol Biotechnol, 54, pp 741–750 22 Gulati, R., Saxena, R.K., and Gupta, R (1997), “A rapid plate assay for screening lasparaginase producing micro-organisms”, Lett Appl Microbiol, 24, pp 23–26 23 Harms, E., Wehner, A., Jennings, M.P., Pugh, K.J., Beacham, I.R., and Röhm, K.H (1991), “Construction of expression systems for Escherichia coli asparaginase II and two-step purification of the recombinant enzyme from periplasmic extracts”, Protein Expr Purif, 2, pp 144–150 24 Hendriksen, H.V., Kornbrust, B.A., Østergaard, P.R., and Stringer, M.A (2009), “Evaluating the Potential for Enzymatic Acrylamide Mitigation in a Range of Food Products Using an Asparaginase from Aspergillus oryzae”, J Agric Food Chem, 57, pp 4168–4176 25 Jahic, M., Veide, A., Charoenrat, T., Teeri, T., and Enfors, S.-O (2006), “Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris”, Biotechnol Prog, 22, pp 1465–1473 26 Jones, G.E (1977) “Genetics of Expression of Asparaginase II Activity in Saccharomyces cerevisiae”, J Bacteriol, 129, pp 1165–1167 27 Khushoo, A., Pal, Y., and Mukherjee, K.J (2005), “Optimization of extracellular production of recombinant asparaginase in Escherichia coli in shake-flask and bioreactor”, Appl Microbiol Biotechnol, 68, pp 189–197 28 Kukurová, K., Morales, F.J., Bednáriková, A., and Ciesarová, Z (2009), “Effect of L-asparaginase on acrylamide mitigation in a fried-dough pastry model”, Mol Nutr Food Res, 53, pp 1532–1539 29 Lineback, D.R., Coughlin, J.R., and Stadler, R.H (2012), “Acrylamide in foods: a review of the science and future considerations”, Annu Rev Food Sci Technol, 3, pp 15–35 30 Lingnert, H., Grivas, S., (2002), “Acrylamide in food: mechanisms of formation and influencing factors during heating of foods”, Scand J Nutr, 46, pp 159–172 31 Maria Antonieta Ferrara, N.M.B.S (2006), “Asparaginase production by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring Saccharomyces cerevisiae ASP3 gene”, Enzyme Microb Technol, pp 1457–1463 32 Mucci, L.A., Dickman, P.W., Steineck, G., Adami, H.-O., and Augustsson, K (2003), “Dietary acrylamide and cancer of the large bowel, kidney, and bladder: absence of an association in a population-based study in Sweden”, Br J Cancer, 88, pp 84–89 33 Peterson, R.E., and Ciegler, A (1969), “L-Asparaginase Production by Various Bacteria”, Appl Microbiol, 17, pp 929–930 34 Roberts, J., Burson, G., and Hill, J.M (1968), “New Procedures for Purification of lAsparaginase with High Yield from Escherichia coli”, J Bacteriol, 95, pp 2117–2123 35 Romanos, M.A., Scorer, C.A., and Clare, J.J (1992), “Foreign gene expression in yeast: a review”, Yeast Chichester Engl, 8, pp 423–488 36 Sarquis, M.I de M., Oliveira, E.M.M., Santos, A.S., and Costa, G.L da (2004), “Production of L-asparaginase by filamentous fungi”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 99, pp 489–492 37 Soniyamby Ambi Rani, L.S.P.B.V (2012), “Isolation and screening of LAsparaginase producing fungi from soil samples”, Int J Pharm Sci, 4, pp 279–282 38 Sumner, S.C., MacNeela, J.P., and Fennell, T.R (1992), “Characterization and quantitation of urinary metabolites of acrylamide in rats and mice using 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy”, Chem Res Toxicol, 5, pp 81–89 39 Swain, A.L., Jaskólski, M., Housset, D., Rao, J.K., and Wlodawer, A (1993), “Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy”, Proc Natl Acad Sci U S A, 90, pp 1474–1478 40 Zhang, W., Inan, M., and Meagher, M.M (2000), “Fermentation strategies for recombinant protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, Biotechnol Bioprocess Eng, 5, pp 275–287 41 Zyzak, D.V., Sanders, R.A., Stojanovic, M., Tallmadge, D.H., Eberhart, B.L., Ewald, D.K., Gruber, D.C., Morsch, T.R., Strothers, M.A., Rizzi, G.P., et al (2003), “Acrylamide Formation Mechanism in Heated Foods”, J Agric Food Chem, 51, pp 4782–4787 42 DSM Food Specialties (2006), GRAS Notification for Asparaginase from A Gentically Modified Strain of Aspergillus niger 43 Catalog no, K1710-01 Manual Pichia Expression Kit 44 Invitrogen, Pichia expression kit, “A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris”, Version M: 011102: 25-0043, Catolog no K1710-01 45 Tokmakov, A.A., Kurotani, A., Takagi, T., Toyama, M., Shirouzu, M., Fukami, Y., and Yokoyama, S (2012), “Multiple post-translational modifications bear upon heterologous protein synthesis”, J Biol Chem, jbc.M112.366351 46 Hou, J., Tyo, K., Liu, Z., Petranovic, D., and Nielsen, J (2012), “Engineering of vesicle trafficking improves heterologous protein secretion in Saccharomyces cerevisiae”, Metab Eng, 14, pp 120–127 47 DSM 2012, GRAS notification for an asparaginase from a genetically modified strain of Aspergillus niger 48 Lin-Cereghino, G.P., Stark, C.M., Kim, D., Chang, J., Shaheen, N., Poerwanto, H., Agari, K., Moua, P., Low, L.K., Tran, N., et al (2013), “The Effect of ?-Mating Factor Secretion Signal Mutations on Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris”, Gene 519, pp 311–317 49 Daly R., Hearn M T W., 2005, “Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production” J Mol Recognit JMR, 18, pp 119-138 50 Jia M., Xu M., He B., Rao Z., 2013, “Cloning, expression, and characterization of Lasparaginase from a newly isolated Bacillus subtilis B11-06”, J Agric Food Chem, 61, pp 9428-9434 51 Kotzia G A., Labrou N E., 2007, “L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi 3937: Cloning, expression and characterization”, J Biotechnol, 127, pp 657-669 52 Oza V P., Parmar P P., Patel D H., Subramanian R B., 2011, “Cloning, expression and characterization of L-asparaginase from Withania somnifera L for large scale production”, Biotech, 1, pp 21-26 53 Ferrara M A., Severino N M B., Mansure J J., Martins A S., Oliveira E M M., Siani A C., Pereira Jr N., Torres F A G., Bon E P S., 2006, “Asparaginase production by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring Saccharomyces cerevisiae ASP3 gene”, Enzyme Microb Technol, 39, pp.1457-1463 54 Meeting J F E C on F A., Organization, W H 2007, “Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants: Sixty-eighth Report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives”, World Health Organization 55 Novel asparaginase enzyme, 2011, WO 2011134916 A1 56 Sambrook, J and Green, M R (1996) “Molecular cloning: A laboratory manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press 57 Sue Macauley-Patrick, * Mariana L Fazenda, Brian McNeil and Linda M Harvey (2005) “Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system” Yeast 22, pp 249–270 58 Hiller, K., Grote, A., Scheer, M., Münch, R., and Jahn, D (2004) PrediSi: prediction of signal peptides and their cleavage positions Nucleic Acids Res 32, W375–W379 Trang Web 61 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 62 http://primerdigital.com/fastpcr.html 63 http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis [...]... gen có nguồn gốc từ vi khuẩn thƣờng đƣợc biểu hiện trong E coli và Bacillus [27, 50, 51, 52] còn các gen có nguồn gốc từ nấm thƣờng đƣợc biểu hiện ở các chủng nấm tƣơng ứng [36, 53, 54, 55] Ngoài ra có hai công trình nghiên cứu biểu hiện asparaginase I và III của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong nấm men P pastoris [53] Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chủng nấm men P pastoris để biểu hiện asparaginase. .. Lâm, Nguyễn Thị Dung, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thị Hƣơng Trà, Trƣơng Nam Hải (2014), Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Asparaginase của Aspergillus oryzae trong nấm men Pichia pastoris Tạp Chí Sinh Học, 36, TCSH14013 7 Đỗ Thị Hồng (2005), Nghiên cứu biểu hiện vùng gen preM-env của virus Dengue typ 2 trong nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội Tài liệu... thực hiện đề tài Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của Aspergillus oryzae trong nấm men Pichia pastoris Nấm men P pastoris là hệ thống biểu hiện protein ngoại lai đƣợc các nhà khoa học sử dụng rộng rãi bởi những đặc tính ƣu việt đó là chủng an toàn sinh học, là chủng eukaryote đơn giản, có thể thực hiện biến đổi sau dịch mã tốt, có khả năng sinh trƣởng mạnh tạo lƣợng sinh khối lớn trong. .. Ty, và Trƣơng Nam Hải (2010), “Ghép nối và biểu hiện gen mã hóa enterocin P của vi khuẩn Enterococcus faecium trong Pichia pastoris X33”, Tạp Chí Công Nghệ Sinh Học 8, tr 221–226 3 Võ Viết Cƣờng, Lê Thị Huệ, Đỗ Thị Huyền, Lê Quỳnh Giang, Nguyễn Thị Quý, và Trƣơng Nam Hải (2013), Biểu hiện gen HA5.1 đƣợc cải biến mã có hoạt tính sinh học trong nấm men Pichis pastoris X33”,Tạp Chí Sinh Học 35, tr 255–264... trong quá trình lên men, thao tác dễ dàng [3,49] Ngoài ra, hệ thống P pastoris có thể sản xuất lƣợng lớn protein mục tiêu với nguồn nguyên liệu methanol rẻ tiền và ít bị tạp nhiễm Chính vì những ƣu điểm này mà P pastoris đƣợc xem là hệ biểu hiện thích hợp nhất đƣợc lựa chọn để biểu hiện gen mã hóa asparaginase từ nấm sợi A oryzae Hiện nay, có rất nhiều công trình trên thế giới biểu hiện asparaginase từ... chủng nấm men P pastoris để biểu hiện asparaginase của A oryzae Toàn bộ công việc nghiên cứu đƣợc tiến hành tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1 Nguyễn Thị Trung (2002), Phân lập và biểu hiện gen mã hóa β- Amylase của đậu tương trong nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học... Trần Linh Thƣớc (2014), Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp đa bản sao biểu hiện nhân tố tăng trƣởng từ tiểu cầu (BBPDGF-BB) mức độ cao”, Tạp Chí Sinh Học 36, tr 77-83 5 Phạm Thị Kim Liên, Đặng Tất Trƣờng, Trần Văn Hiếu (2013), “Tạo dòng và biểu hiện nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu – đại thực bào HGM-CSF tái tổ hợp trên hệ thống Pichia pastoris , Tạp Chí Phát... [24] Trong dƣợc phẩm asparaginase đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ máu với tên thƣơng mại Elspar [11] Hiện nay giá thành asparaginase trên thị trƣờng rất cao nên việc ứng dụng enzyme để làm giảm acrylamide trong quá trình chế biến các thực phẩm chiên nƣớng ở Việt Nam còn rất hạn chế Với mong muốn tạo ra chủng sản xuất asparaginase tái tổ hợp giống với asparaginase thƣơng mại để sử dụng ở trong. .. lƣợng acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột nhờ việc loại bỏ asparagine Enzyme asparaginase sẽ xúc tác thủy phân asparagine thành axit aspartic và ammonia, không cho asparagine tham gia phản ứng Maillard để hình thành acrylamide [8] Trên thế giới hiện nay hãng Novozymes A/S Denmark đã sản xuất và thƣơng mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi A oryzae ứng dụng trong công nghiệp... Agric Food Chem, 51, pp 4782–4787 42 DSM Food Specialties (2006), GRAS Notification for Asparaginase from A Gentically Modified Strain of Aspergillus niger 43 Catalog no, K1710-01 Manual Pichia Expression Kit 44 Invitrogen, Pichia expression kit, “A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris , Version M: 011102: 25-0043, Catolog no K1710-01 45 Tokmakov, A.A., Kurotani,