BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL ĐỂ VI BAO VI KHUẨN BACILLUS CLAUSII GVHD: ThS LÊ HOÀNG DU SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ MSSV: 11116022 SKL 0 Tp Hồ Chí Minh, tháng 7/2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2015-11116022 SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL ĐỂ VI BAO VI KHUẨN BACILLUS CLAUSII GVHD: ThS LÊ HOÀNG DU SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ MSSV: 11116022 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Thảo Hà Ngành: Công nghệ Thực phẩm Tên khóa luận: Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao vi khuẩn Bacillus clausii Nhiệm vụ khóa luận:  Khảo sát đánh giá ảnh hưởng nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào vi bao, đặc điểm hạt vi bao khả bảo vệ tế bào vi khuẩn hạt vi bao gelatin alginate ủ môi trường giả lập dày; môi trường giả lập dịch ruột  Khảo sát đánh giá ảnh hưởng nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào vi bao, đặc điểm hạt vi bao khả bảo vệ tế bào vi khuẩn hạt vi bao soy protein alginate ủ môi trường giả lập dày; môi trường giả lập dịch ruột Ngày giao nhiệm vụ khóa luận:16/01/2015 Ngày hoàn thành khóa luận: 16/07/2015 Họ tên ngƣời hƣớng dẫn 1: ThS Lê Hoàng Du Phần hƣớng dẫn: toàn khóa luận Họ tên ngƣời hƣớng dẫn 2: Phần hƣớng dẫn: Nội dung yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đƣợc thông qua Trƣởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Tp.HCM, ngày Trƣởng Bộ môn tháng năm 20 Ngƣời hƣớng dẫn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ LỜI CẢM ƠN Sau tháng nỗ lực thực hiện, đồ án tốt nghiệp “Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao vi khuẩn Bacillus clausii” hoàn thành Ngoài cố gắng học hỏi, nghiên cứu thân em nhận giúp đỡ, động viên nhiều từ phía nhà trường, thầy cô, bạn bè hướng dẫn tận tình thầy Lê Hoàng Du Đầu tiên, em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ Hóa học Thực phẩm, trường Đại học Sư phạm kỹ thuật Hồ Chí Minh tận tình dạy bảo, xây dựng kiến thức cần thiết cho em suốt năm học tập trường Các thầy cô tạo điều kiện giúp em thực thí nghiệm, khảo sát để thực thành công đồ án tốt nghiệp này.Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Lê Hoàng Du giáo viên hướng dẫn Thầy người thầy tâm huyết, đầy trách nhiệm, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình triển khai, nghiên cứu hoàn thành đồ án Thầy giúp đỡ em nhiều từ kiến thức tiến trình làm thí nghiệm; thầy bên cạnh hỗ trợ, đóng góp ý kiến cho em suốt trình làm đồ án Thầy người dìu dắt, thầy hướng dẫn chắn đồ án hoàn thành Cảm ơn tất bạn lớp 111160 em chia sẻ khoảnh khắc đẹp thời sinh viên, người bạn bên cạnh em vào giây phút khó khăn Và cuối cùng, xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, người thân nuôi nấng, quan tâm con, nguồn động viên hỗ trợ mặt từ chào đời đến ngày hôm Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn tất người giúp đỡ em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Mặc dù em có nhiều cố gắng để hoàn thành đồ án với thời gian khả hạn chế tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đóng góp quý thầy cô bạn Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2015 i KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn nội dung trình bày khóa luận tốt nghiệp riêng Tôi xin cam đoan nội dung tham khảo khóa luận tốt nghiệp trích dẫn xác đầy đủ theo qui định Ngày 16tháng 07năm 2015 Ký tên ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ MỤC LỤC CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Giới thiệu 1.2 Tổng quan probiotics 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Lợi ích probiotics 1.2.3 Cơ chế tác dụng probiotics 1.3 Vi khuẩn Bacillus clausii 1.3.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 1.3.2 Vai trò 1.3.3 Hoạt tính probiotics 1.4 Vi bao probiotics .9 1.4.1 Định nghĩa vi bao 1.4.2 Vi bao probiotics .9 1.4.3 Kỹ thuật vi bao probiotics .10 1.4.4 Vật liệu vi bao probiotics 14 1.5 Vi bao probiotics gel alginate .16 1.5.1 Nghiên cứu nước 16 1.5.2 Nghiên cứu nước 17 1.6 Vi bao đa lớp probiotics .19 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Địa điểm thực 21 2.2 Vật liệu 21 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 21 2.2.2 Phụ gia hóa chất 21 2.3 Phƣơng pháp 21 2.3.1 Phương pháp vi bao 21 iii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 24 2.3.3 Xác định hiệu suất vi bao 25 2.3.4 Mật độ tế bào vi bao .25 2.3.5 Phân tích phân bố kích thước hạt .25 2.3.6 Phân tích đặc điểm bề mặt hạt vi bao 25 2.3.7 Khảo sát khả tồn vi khuẩn Bacillus clausii vi bao môi trường giả lập dày (SGJ) 26 2.3.8 Khảo sát khả tồn vi khuẩn Bacillus clausii vi bao môi trường giả lập dịch ruột (SIJ) 26 2.3.9 Phân tích xử lý số liệu .26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .27 3.1 Ảnh hƣởng nồng độ gelatin đến trình vi bao vi khuẩn Bacillus clausii phƣơng pháp vi bao hai lớp gelatin alginate 27 3.1.1 Hiệu suất vi bao .27 3.1.2 Mật độ tế bào vi bao .28 3.1.3 Đặc điểm hạt vi bao 29 3.1.4 Khả bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii hạt bao ủ môi trường giả lập dày (SGJ) 32 3.1.5 Khả bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii hạt bao ủ môi trường giả lập dịch ruột (SIJ) 36 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ soy protein đến trình vi bao vi khuẩn Bacillus clausii phƣơng pháp vi bao hai lớp soy protein alginate 39 3.2.1 Hiệu suất vi bao .40 3.2.2 Mật độ tế bào vi bao .41 3.2.3 Đặc điểm hạt bao .42 3.2.4 Khả bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii hạt bao ủ môi trường giả lập dày (SGJ) 44 3.2.5 Khả bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii hạt bao ủ môi trường giả lập dịch ruột (SIJ) 48 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 iv KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tế bào Bacillus clausii quan sát kính hiển vi Hình 1.2 Bao gói tế bào probiotics kỹ thuật nhũ tương 11 Hình 1.3 Sơ đồ trình bao gói vi khuẩn phương pháp sấy phun 12 Hình 1.4 Sự hình thành gel tạo hạt bao ion Ca2+ khuếch tán vào dung dịch sodium alginate 15 Hình 2.1 Quá trình vi bao 23 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao (giá trị trung bình n = 3) Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ gelatin đến mật độ tế bào vi bao (giá trị trung bình n = 3) Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn 29 Hình 3.3 Phân bố kích thước mẫu 1.0G 30 Hình 3.4 Bề mặt hạt vi bao mẫu 1.0G 32 Hình 3.5 Bề mặt hạt vi bao mẫu 0.0CB-SA 32 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ gelatin đến khả bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii tự ( ), vi bao ( : 0.0%; : 0.5%; : 1.0%, : 1.5%) ủ môi trường SGJ 120 phút Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn 34 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ gelatin đến khả bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii tự ( ), vi bao ( : 0.0%; : 0.5%; : 1.0%, : 1.5%) ủ môi trường SIJ 120 phút Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn 38 Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao (giá trị trung bình n = 3) Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn 40 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ soy protein đến mật độ tế bào vi bao (giá trị trung bình n = 3) Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn 41 Hình 3.10 Phân bố kích thước hạt mẫu 1.0G ( ) mẫu 15.0SP ( ) 43 Hình 3.11 Bề mặt hạt vi bao mẫu 15.0SP 44 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng độ soy protein đến khả bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii tự ( ), vi bao ( : 0.0%; : 5.0%; : 10.0%, : 15.0%) ủ môi trường SGJ 120 phút Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn 47 v KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Hình 3.13 Ảnh hưởng nồng độ soy protein đến khả bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii tự ( ), vi bao ( : 0.0%; : 5.0%; : 10.0%, : 15.0%) ủ môi trường SIJ 120 phút Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn 51 vi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Công thức phối trộn màng bao tế bào Bacillus clausii 23 Bảng 3.1 Sự thay đổi số lượng tế bào tự tế bào vi bao sống sót (log CFU/g) ủ môi trường SGJ 120 phút 33 Bảng 3.2 Sự thay đổi số lượng tế bào tự tế bào vi bao sống sót (log CFU/g) ủ môi trường SIJ 120 phút .37 Bảng 3.3 Sự thay đổi số lượng tế bào tự tế bào vi bao sống sót (log CFU/g) ủ môi trường SGJ 120 phút 46 Bảng 3.4 Sự thay đổi số lượng tế bào tự tế bào vi bao sống sót (log CFU/g) ủ môi trường SIJ 120 phút .50 Bảng 3.5 Tỷ lệ sống sót (%) tế bào vi bao màng gelatin alginate, soy protein alginate sau ủ môi trường SGJ, môi trường SIJ 120 phút 53 vii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắtGiải thích nghĩa 0.0CB-SA 1.0GMẫu vi bao có nồng độ gelatin 1.0%w/v 15.0SPMẫu vi bao có nồng độ soy protein 15.0%w/v %w/vWeight/Volume - Khối lượng/Thể tích CFU ĐCMẫu đối chứng GGelatin SGJ Simulated gastric juices - Môi trường giả lập dày SIJ Simulated intestinal juices - Môi trường giả lập dịch ruột 10 SP Soy protein - Protein từ đậu nành Mẫu vi bao sử dụng sodium alginate Colony form unit - đơn vị hình thành khuẩn lạc viii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ TÓM TẮT KHÓA LUẬN Vi khuẩnBacillus clausii vi bao hai lớp protein (gelatin soy protein) alginate kỹ thuậtvi gel Ảnh hưởng nồng độ gelatin sử dụng (0.0, 0.5, 1.0, 1.5%); nồng độ soy protein sử dụng (0.0, 5.0, 10.0, 15.0%) đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào vi bao, đặc điểm hạt vi bao khả bảo vệ tế bào bên hạt vi bao ủ môi trường giả lập dày; môi trường giả lập dịch ruột khảo sát Kết cho thấy sau vi bao, mẫu sử dụng 1.0% gelatin mẫu sử dụng 15.0% soy protein mang lại hiệu suất vi bao cao 88.38% 85.89% Mẫu 1.0% gelatin mẫu 15.0% soy protein hai mẫu có mật độ tế bào vi bao cao tương ứng 2.56x1011 CFU/g 2.39x1011 CFU/g Thêm vào đó, màng bao hai lớp gelatin alginate; soy protein alginateđã cải thiện đáng kể khả sống sót vi khuẩn Bacillus clausii ủ môi trường giả lập dày; môi trường giả lập dịch ruột Màng bao sử dụng 1.0% gelatin alginate, 15.0% soy protein alginate cho thấy hiệu bảo vệ tế bào bên tốt nhất, số lượng tế bào sống sót sau 120 phút môi trường giả lập dày mẫu ĐC, 0.0CB-SA, 1.0G 15.0SP tương ứng 4.36, 8.07, 9.29 9.86 log CFU/g Số lượng tế bào sống sót sau 120 phút môi trường giả lập dịch ruột mẫu ĐC, 0.0CB-SA, 1.0G 15.0SP tương ứng 5.22, 8.77, 9.75 10.25 log CFU/g Như màng bao hai lớp 15.0% soy protein alginate (15.0SP) cho thấy tiềm bảo vệ tốt tế bào bên ủ môi trường giả lập dày môi trường giả lập dịch ruột, cung cấp đủ số lượng probiotic (>106 CFU/g) mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng ix KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Probiotics vi sinh vật sống đưa trực tiếp vào thểvới lượng đầy đủ có lợi mặt sức khỏe cho người sử dụng[1] Chúng chứng minh mang lại nhiều lợi ích sức khỏe cho người sử dụng giúp cân hệ vi sinh vật đường ruột, kháng khuẩn, cải thiện trình chuyển hóa lactose, giảm cholesterol huyết thanh, kích thích hệ thống miễn dịch, chống tiêu chảy, cải thiện bệnh viêm ruột, [2]–[4], [5]– [12].Tuy nhiên số lượng tế bào probioticstự giảm đáng kể tiếp xúc với môi trường dày - ruột người, với số lượng nhỏ 106 CFU/g chúng không mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng[13]–[15] Phương pháp bao gói từ lâu sử dụng để bảo vệ tế bào probiotics chống lại điều kiện khắc nghiệt môi trường bên Có nhiều kỹ thuật bao gói sử dụng kỹ thuật sấy phun, ép đùn, nhũ tương,vi gel Trong bật kỹ thuật vi gelbằngthiết bị phun áp lực tạo hạt bao có kích thước nhỏ nên bổ sung vào sản phẩm thực phẩm mà không làm thay đổi kết cấu tính chất cảm quan thực phẩm[16] Các chất bao alginate, gelatin, chitosan, whey protein, soy protein, carrageenan, thường sử dụng để vi bao probiotics Alginate chất bao sử dụng nhiều chúng vật liệu rẻ tiền, không độc hại, bảo vệ tế bào bên chống lại môi trường khắc nghiệt dày giải phóng tế bào bên vào ruột kết nhằm phát huy tác dụng có lợi cho sức khỏe người sử dụng[17]–[19] Tuy nhiên nhược điểm alginate tạo thành màng bao xốp không bảo vệ tốt tế bào bên trong[20] Vì lý trên, tiến hành vi bao chủng probioticsBacillus claussi phương pháp vi bao hai lớp:lớp thứ có chất protein (gelatin soy protein), lớp thứ hai gel alginate sử dụng kỹ thuật vi gel thiết bị phun áp lực nhằm tạo hạt vi bao có kích thước nhỏ 1mm.Vi sinh vật vi bao theo kỹ thuật có khả chống chịu tốt tiếp xúc với điều kiện khắc nghiệt môi trường giả lập dày môi trường giả lập dịch ruột KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài cải thiện phương pháp bao gói vi khuẩnBacillus clausii cách sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao hai lớp gelatin alginate; soy protein alginate; tìm nồng độ gelatin, soy protein thích hợp nhằm làm tăng hiệu suất vi bao, tăng mật độ tế bào vi bao, cải thiện cấu trúc hạt vi bao tăngkhả bảo vệ tế bào vi khuẩn bên ủ môi trường giả lập dày môi trường giả lập dịch ruột Đối tƣợng giới hạn nghiên cứu đề tài Đối tƣợng:Vi khuẩnBacillus clausii; phương pháp vi bao hai lớp gelatin alginate, soy protein alginate Giới hạn nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ gelatin, nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào vi bao, đặc điểm hạt bao khả bảo vệ tế bào vi khuẩn hạt bao ủ môi trường giả lập dày môi trường giả lập dịch ruột trình vi bao vi khuẩn Bacillus clausii phương pháp vi bao hai lớp gelatin alginate, soy protein alginate Nội dung đề tài  Vi bao vi khuẩnBacillus clausii phương pháp vi bao hai lớp gelatin alginate, soy protein alginate kỹ thuật vi gel Sử dụng nồng độ gelatin khác (0.0, 0.5, 1.0, 1.5%) nồng độ soy protein khác (0.0, 5.0, 10.0, 15.0%)  Khảo sát ảnh hưởng nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào vi bao, đặc điểm hạt vi bao khả bảo vệ tế bào vi khuẩn hạt vi bao ủ môi trường giả lập dày môi trường giả lập dịch ruột  Khảo sát ảnh hưởng nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào vi bao, đặc điểm hạt vi bao khả bảo vệ tế bào vi khuẩn hạt vi bao ủ môi trường giả lập dày môi trường giả lập dịch ruột  So sánh hiệu hai loại màng bao gelatin alginate; soy protein alginate việc bảo vệ tế bào bên ủ môi trường giả lập dày môi trường giả lập dịch ruột Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học  Sử dụng kỹ thuật vi bao việc bảo vệ tế bào probiotics KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ  Nghiên cứu, đánh giá giải thích hiệu màng bao hai lớp gelatin alginate, soy protein alginate đến khả bảo vệ tế bào probioticsđược bao bên Ý nghĩa thực tiễn  Là phương pháp tạo hạt vi bao với kích thước nhỏ 1mm nên ứng dụng bổ sung vào thực phẩm không làm thay đổi kết cấu hay ảnh hưởng đến tính chất cảm quan thực phẩm  Là phương pháp tiên tiến tạo hạt bao có khả bảo vệ tốt tế bào bên chống lại điều kiện khắc nghiệt môi trường giả lập dày giả lập dịch ruột Từ làm tăng số lượng tế bào sống sót mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng  Phương pháp vi bao dễ thực Các loại màng bao sử dụng rẻ tiền, độc tính, có sẵn thị trường Bố cục đề tài Đề tài gồm có chương chính:  Chương 1: Tổng quan tài liệu  Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu  Chương 3: Kết bàn luận  Chương 4: Kết luận kiến nghị KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Tại Việt Nam, bệnh đường tiêu hóa đứng đầu nhóm bệnh nội khoa Trong rối loạn tiêu hóa vấn đề thường gặp Trong bệnh rối loạn tiêu hóa hay hấp thụ táo bón, tiêu chảy bệnh phổ biến gây hậu nghiêm trọng Nguyên nhân thay đổi lối sống, chế độ ăn uống không khoa học, chế độ sinh hoạt nghỉ ngơi không phù hợp đặc biệt donhiễm khuẩn gây hại Escherichia coli, Vibrio, Shigella,…từ thực phẩm không vệ sinh, chúng làm cân hệ vi sinh vật đường ruột tạo điều kiện cho vi sinh vật gây hại phát triển tạo độc tố [119] Sử dụng sản phẩm có chứa probiotics phương pháp góp phần cải thiện hệ vi sinh đường ruột, điều trị bệnh rối loạn tiêu hóa cải thiện sức khỏe cho người sử dụng[2]–[4] Theo tổ chức Y tế giới (World Health Organization - WHO), hàng năm giới có khoảng 1,3 tỷ lượt trẻ em tuổi bị tiêu chảy, 3,5-4 triệu trường hợp tử vong Việc sử dụng probiotics để điều trị bệnh đường tiêu hóa tiêu chảy nhiễm khuẩn không nhiễm khuẩn, phòng ngừa điều trị rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột gây dùng kháng sinh, hội chứng ruột kích thích, mang lại hiệu đáng kể [123] Probiotics vi sinh vật thiết yếu sống đường ruột có khả điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho thể vật chủ[21], [22] Để phát huy tác dụng mình, probiotics phải có khả vượt qua trở ngại acid dày, phát triển nhanh sống đường ruột chí có mặt acid, muối mật loại thuốc kháng sinh Chúng phải bám chặt vào thành ruột làm tăng khả miễn dịch cho thể vật chủ, đặc biệt kích thích tiết immunoglobulin A.Để phát huy lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng, số lượng tối thiểu tế bào probiotics sống sản phẩm thời điểm tiêu thụ nên cao 106 CFU/g CFU/ml sản phẩm[13]–[15] Phân tích sản phẩm chứa probiotics nhiều quốc gia khác cho thấy lượng probiotic sống tồn sản phẩm lên men truyền thống [23], [24] KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Mặc dù mang lại lợi ích đáng kể cho sức khỏe cho người sử dụng số lượng probiotics sản phẩm sau trình sản xuất, bảo quản bị giảm Hơn probiotics nhạy cảm với acid dày muối mật đường ruột cần tìm hướng giải nhằm làm tăng tỷ lệ vi khuẩn sống sót giải phóng vi khuẩn probiotics chỗ, thời điểm để mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng Sử dụng kỹ thuật bao gói probiotics để chống lại điều kiện bất lợi bên cách tiếp cận nhận nhiều quan tâm.Hơn bao gói có xu hướng ổn định tế bào, tăng cường khả phát triển ổn định vi khuẩn sản xuất [25] 1.2 Tổng quan probiotics 1.2.1 Khái niệm Probiotics định nghĩa theo nhiều cách số lượng định nghĩa probiotics nhiều tùy thuộc vào hiểu biết chế tác động chúng sức khỏe người Gần năm 2002, tổ chứcY tế giới (WHO) đưa định nghĩa probioticsvà định nghĩa kiểm chứng hiệp hội nhà khoa học quốc tế probiotics prebiotic; định nghĩa định nghĩa xác dùng phổ biến nhất: probiotics vi sinh vật sống đưa trực tiếp vào thể, với lượng đầy đủ có lợi mặt sức khỏe cho người sử dụng[1] 1.2.2 Lợi ích probiotics Có nhiều chứng cho thấy probiotics có tiềm mang lại lợi ích sức khỏe cho người [26] Nhiều nghiên cứu mô tả lợi ích sức khỏe chúng làm giảm bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa, kháng khuẩn, cải thiện trình chuyển hóa lactose, giảm cholesterol huyết thanh, kích thích hệ thống miễn dịch, đặc tính chống ung thư, chống tiêu chảy, cải thiện bệnh viêm ruột ức chếnhiễm khuẩnHelicobacter pylori cách bổ sung chủng probiotic lựa chọn vào sản phẩm thực phẩm[2]–[4], [5]–[12].Các tác dụng có lợi probiotic xuất chúng đến vùng dày ruột với số lượng đủ cao sống sót điều kiện khắc nghiệt này[27] Hầu hết chủng probiotics phân lập từ hệ vi sinh vật đường ruột người Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng sức khỏe người, không tham gia chúng trình tiêu hóa, mà chúngcòn đóng góp tích cực phát triển hệ vi sinh vật đường ruột hệ thống miễn dịch [28] Các chế hoạt động probiotics cho kết từ việc điều chỉnh thành phần hệ vi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ sinh vật đường ruột hoạt động trao đổi chất chúngngăn ngừa tồn tại, phát triển mức mầm bệnh kích thích hệ miễn dịch thể vật chủ[29] 1.2.3 Cơ chế tác dụng probiotics 1.2.3.1 Cạnh tranh vị trí bám dínhvà chất dinh dƣỡng với vi sinh vật gây bệnh Cách thức hoạt động probiotics cạnh tranh loại trừ, nghĩa cạnh tranh bám vào màng nhầy thành ruột qua tạo nên hàng rào vật lý bảo vệ khỏi công khuẩn gây bệnh Khả bám dính probiotics vào niêm mạc ruột xem tiêu chí lựa chọn chủng probiotics Các tế bào biểu mô đường ruột tế bào chủ cho hàng triệu vị trí gắn thụ thể vi khuẩn khác Khi probiotics liên kết với vị trí gắn thụ thể tế bào biểu mô làm thay đổi niêm mạc tế bào tế bào lân cận Do vi khuẩn có hại có khả bám dính lên niêm mạc ruột Probiotics tìm thấy điểm gắn nhiều vị trí nên ngăn ngừa vi khuẩn có hại xâm nhập Vi khuẩn bám dính niêm mạc ruột nhờ chế đặc trưng (chất bám dính phân tử thụ thể ruột) chế không đặc trưng (dựa vào yếu tố hóa học) Một vài thành phần cấu tạo vi khuẩn: protein, thành tế bào, carbohydrate, acid lipoteichoic xem có liên quan đến tính bám dính probiotics vào ruột Ngoài ra, probiotics cạnh tranhnguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ nhiều loại muối khoáng với vi sinh vật có hại [120] 1.2.3.2 Sản xuất hợp chất kháng khuẩn Trong trình trao đổi chất,probioticscó thể tạo sản phẩm có tính kháng khuẩn axit hữu (acid lactic acid acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, acetoine, CO2, reuterin, reutericyclin bacteriocin Những hợp chất ảnh hưởng đến trao đổi chất từ làm giảm vi sinh vật mang mầm bệnh Điều thực cách giảm pH khoang ruột thông qua việc tạo chuỗi acid béo ngắn dễ bay hơi, chủ yếu acetic, propionic, butyric acid lactic[30] Ngoài ra, reuterin dẫn xuất reutericyclin ức chế vi khuẩn Gram âm Gram dương, nấm động vật nguyên sinh giun, sán Các chất diacetyl, acetaldehyde acetoin có tác dụng kìm hãm vi sinh vật có hại khiở nồng độ thấp [120] 1.2.3.3 Cân hệ vi sinh vật đƣờng ruột KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Probiotics góp phần điều chỉnh thành phần hệ vi sinh vật đường ruột Khi tập trung khoang ruột chúng tạo nên cân tạm thời hệ vi sinh vật đường ruột, thay đổi nhận thấy vài ngày sau bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotics, phụ thuộc vào công dụng liều lượng chủng probiotics sử dụng.Probioticscó khả điều hòa hoạt động trao đổi chất vi sinh vật đường ruột Probiotics làm giảm pH phận tiêu hóa theo cách gây cản trở hoạt động tiết enzyme vi sinh vật có hại đường ruột Đồng thời tăng dung nạp đường lactose giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu hấp thu loại thức ăn có chứa nhiều lactose làm tăng lượng vi khuẩn có lợi, giảm lượng vi khuẩn gây hại[120], [121] Trong số chủng probiotics thương mại, chủngBacillus (Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus pumilus) mang đặc tính tiềm năngnhư: khả sống thành nhóm lớn nhanh chóng phát triển đường ruột, có khả kích thích phản ứng miễn dịch hoạt tính kháng khuẩn cao Vì chủngBacillus thường bổ sung vào sản phẩm thực phẩm mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng 1.3 Vi khuẩn Bacillus clausii 1.3.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Bacillus clausii vi khuẩn hiếu khí có dạng hình que đơn lẻ kết thành chuỗi (hình 1.1), vi khuẩn Gram dương có khả di động Vi khuẩn Bacillus clausii có kích thước chiều rộng 1-2 µm, dài µm [22], [31] Nhiệt độ tối thích để sinh trưởng phát triển 40oC, pH tối thích [32].Bacillus clausiiphân bố nhiều nơi chủ yếu đất vườn đất sét Ngoài tìm thấychúngở nước bùn Vi khuẩn Bacillus clausii có khả thủy phân casein, gelatin tinh bột không thủy phân pullulan[31], [122] Hình 1.1.Tế bào Bacillus clausii quan sát kính hiển vi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ 1.3.2 Vai trò Bacilus clausii loàiprobiotics quan trọng với người với bào tử trực khuẩn khác như: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Bacillus cereus var vietnami [33].Nghiên cứu Marseglia cộng Bacillus clausii không gây nên tác dụng phụ độc tính trẻ em trình điều trị[34] Bacillus clausii phát triển có mặt kháng sinh, đồng thời sản sinh men tiêu hóa amylase protease Vì Bacillus clausii thường dùng làm thực phẩm chức để bổ sung hệ vi khuẩn có lợi cho đường ruột, nhờ giúp phòng ngừa phối hợp điều trị rối loạn tiêu hóa cấp mãn tính trẻ em, đặc biệt sau dùng kháng sinh kéo dài [34] Bacillus claussi giúp kích thích miễn dịch tự nhiên, ổn định hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường chức tiêu hóa, hấp thu thức ăn sản sinh loại men tiêu hóa vitamin, đặc biệt protease kiềm vitamin nhóm B Một số đặc tính chúng sử dụng ứng dụng quan trọng công nghiệp công nghệ sinh học như: sản xuất protease kiềm xylanase [34] Theotổ chức Y tế giới - WHO (2008), phương pháp điều trị bệnh loét dày - tá tràng vi khuẩn Helicobacter pylorigây không thành công bệnh nhân vào khoảng 10%, nguyên nhân chủ yếu đề kháng kháng sinh tác dụng phụ phương pháp điều trị Phương pháp điều trị bệnh loét dày - tá tràng Helicobacter pylori thường dùng loại kháng sinh phối hợp với thuốc ức chế bơm proton nhiên thường gây nhiều tác dụng phụ Việc bổ sungBacillus clausii vào phương pháp điều trị làm giảm đáng kể tác dụng phụ buồn nôn, tiêu chảy, đau thượng vị giúp bệnh nhân tuân thủ trình điều trị tốt Tổ chức tiêu hóa giới (World Gastroenterology Organisation -WGO) (2008) thức khuyến cáo sử dụngBacillus clausii điều trị hỗ trợ điều trị bệnh loét dày – tá tràng vi khuẩn Helicobacter pylori gây [123] 1.3.3 Hoạt tính probiotics Việc cung cấp đủ lượng định tế bào Bacillus clausii giúp khôi phục hệ vi sinh vật có lợi cho hệ tiêu hóa, cung cấp thêm enzyme có lợi cho tiêu hóa (amylase, protease…), vitamin đặc biệt vitamin nhóm B chất dinh dưỡng Bacillus clausii vi khuẩn tuyệt đối an toàn nên không sản sinh độc tố hay chất ảnh gây hưởng xấu đến sức khỏe người sử dụng[35] KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Đánh giá hoạt động kháng khuẩn điều hòa miễn dịch loàiBacillus clausii cho thấy Bacillus clausiicó thể giải phóng chất kháng khuẩn môi trường Hơn nữa, việc giải phóng chất kháng khuẩn quan sát thấy giai đoạn tăng trưởng Những chất có tác dụng chống lại vi khuẩn Gram dương, đặc biệt Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium Clostridium difficile[31] 1.4 Vi bao probiotics 1.4.1 Định nghĩa vi bao Bao gói trình hóa lý học bao bọc chất loại vi sinh vật vật liệu bao gói để tạo phân tử với đường kính từ vài nanomet đến vài milimet [17], [36], [37] Các chất bao gói gọi vật liệu cốt lõi, chất bên pha nội Các chất bao gói gọi lớp phủ, màng, vỏ, pha bên ma trận màng bao Vi bao định nghĩa công nghệ bao gói chất rắn, chất lỏng chất khí dạng thu nhỏ hạt bao kín giải phóng chất bao bên mức kiểm soát định điều kiện đặc biệt [38],[39].Vi hạt thường có dạng hình cầu, có lớp màng bán thấmmỏng màng baovững bao quanh lõi lỏng/rắn, với đường kính khác từ vài micromet đến vài milimet[40] Hạt vi bao thường có đường kính từ 3-800μm tùy theo kỹ thuật vi bao sử dụng [41] Vibao thường nhắc đến cách để bảo vệ vi khuẩn chống lại yếu tố khắc nghiệt môi trường bên ngoài[41], [42] Mục tiêu vi bao tạo môi trường vi mô vi khuẩn tồn suốt trình xử lý, lưu trữ giải phóng chúng địa điểm thích hợp đường tiêu hóa.Trong trường hợp vi baoprobiotics, mục tiêu không để bảo vệ tế bào chống lại điều kiện bất lợi môi trường dày – ruột, mà giải phóng tế bào probiotics nơi, thời điểm tình trạng sống, có thểhoạt động trao đổi chất đường ruột mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng [41] 1.4.2 Vi bao probiotics Sự sống sót probiotics sản phẩm bị ảnh hưởng nhiều yếu tố bao gồm pH, trình acid hóa (trong trình bảo quản) sản phẩm lên men, trình oxy hóa, oxy độc tính (thẩm thấu oxy thông qua bao bì), nhiệt độ lưu trữ, độ ổn định S K L 0 [...]... tài Mục tiêu của đề tài là cải thiện phương pháp bao gói vi khuẩnBacillus clausii bằng cách sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao hai lớp gelatin và alginate; soy protein và alginate; tìm ra nồng độ gelatin, soy protein thích hợp nhằm làm tăng hiệu suất vi bao, tăng mật độ tế bào được vi bao, cải thiện cấu trúc hạt vi bao và tăngkhả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn bên trong khi ủ trong môi trường giả lập dạ... vi bao chỉ sử dụng sodium alginate Colony form unit - đơn vị hình thành khuẩn lạc viii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ TÓM TẮT KHÓA LUẬN Vi khuẩnBacillus clausii được vi bao hai lớp bằng protein (gelatin hoặc soy protein) và alginate bằng kỹ thuậtvi gel Ảnh hưởng của nồng độ gelatin sử dụng (0.0, 0.5, 1.0, 1.5%); nồng độ soy protein sử dụng (0.0, 5.0, 10.0, 15.0%) đến hiệu suất vi bao, ... thành màng bao xốp không bảo vệ tốt tế bào bên trong[20] Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành vi bao chủng probioticsBacillus claussi bằng phương pháp vi bao hai lớp:lớp thứ nhất có bản chất protein (gelatin hoặc soy protein), lớp thứ hai là gel alginate sử dụng kỹ thuật vi gel bằng thiết bị phun áp lực nhằm tạo ra hạt vi bao có kích thước nhỏ hơn 1mm .Vi sinh vật được vi bao theo kỹ thuật này có... tƣợng :Vi khuẩnBacillus clausii; phương pháp vi bao hai lớp gelatin và alginate, soy protein và alginate Giới hạn nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ gelatin, nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào trong được vi bao, đặc điểm hạt bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột của quá trình vi bao vi khuẩn Bacillus. .. Bacillus clausii bằng phương pháp vi bao hai lớp gelatin và alginate, soy protein và alginate 4 Nội dung của đề tài  Vi bao vi khuẩnBacillus clausii bằng phương pháp vi bao hai lớp gelatin và alginate, soy protein và alginate bằng kỹ thuật vi gel Sử dụng nồng độ gelatin khác nhau (0.0, 0.5, 1.0, 1.5%) và nồng độ soy protein khác nhau (0.0, 5.0, 10.0, 15.0%)  Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gelatin... không mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng[ 13]–[15] Phương pháp bao gói từ lâu đã được sử dụng để bảo vệ các tế bào probiotics chống lại các điều kiện khắc nghiệt của môi trường bên ngoài Có rất nhiều kỹ thuật bao gói được sử dụng như kỹ thuật sấy phun, ép đùn, nhũ tương ,vi gel Trong đó nổi bật là kỹ thuật vi gelbằngthiết bị phun áp lực tạo ra hạt bao có kích thước nhỏ nên có thể bổ sung vào... của nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt vi bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột  Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt vi bao khi ủ trong môi trường giả lập... người sử dụng 1.3 Vi khuẩn Bacillus clausii 1.3.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí có dạng hình que đơn lẻ hoặc kết thành chuỗi (hình 1.1), là vi khuẩn Gram dương có khả năng di động Vi khuẩn Bacillus clausii có kích thước chiều rộng 1-2 µm, dài 5 µm [22], [31] Nhiệt độ tối thích để sinh trưởng và phát triển là 40oC, pH tối thích bằng 9 [32] .Bacillus clausiiphân... theo kỹ thuật vi bao được sử dụng [41] Vibao thường được nhắc đến như là cách để bảo vệ vi khuẩn chống lại các yếu tố khắc nghiệt của môi trường bên ngoài[41], [42] Mục tiêu của vi bao là tạo ra môi trường vi mô trong đó các vi khuẩn sẽ tồn tại trong suốt quá trình xử lý, lưu trữ và giải phóng chúng tại các địa điểm thích hợp trong đường tiêu hóa.Trong trường hợp vi baoprobiotics, mục tiêu không chỉ để. .. được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào bên trong của hạt vi bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày; môi trường giả lập dịch ruột được khảo sát Kết quả cho thấy sau khi vi bao, mẫu sử dụng 1.0% gelatin và mẫu sử dụng 15.0% soy protein mang lại hiệu suất vi bao cao nhất là 88.38% và 85.89% Mẫu 1.0% gelatin và mẫu 15.0% soy protein cũng là hai mẫu có mật độ tế bào được vi bao cao