MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đặc điểm bệnh Wilson 1.1.1 Khái niệm bệnh Wilson 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson .3 1.1.3 Dịch tễ bệnh Wilson 1.1.4 Sinh lý bệnh học bệnh Wilson 1.1.5 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh Wilson Triệu chứng gan Triệu chứng huyết học .10 Triệu chứng xương khớp 10 Triệu chứng hệ thận tiết niệu 10 Triệu chứng khác .11 Định lượng đồng nước tiểu 24 13 Định lượng đồng gan khô 14 Chẩn đốn hình ảnh ổ bụng .14 Đánh dấu đồng phóng xạ 17 Chẩn đoán tổn thương gan kính hiển vi điện tử 17 Mô học gan 17 Mô học não 18 Điện tâm đồ .19 1.1.6 Chẩn đoán 19 1.1.7 Điều trị 22 1.1.8 Tiên lượng phòng bệnh .27 1.2 Bệnh học phân tử bệnh Wilson 1.2.1 Vị trí, cấu trúc chức gen ATP7B .28 1.2.2 Đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson 30 1.2.3 Đặc điểm di truyền bệnh Wilson 36 1.2.4 Cơ chế bệnh học phân tử bệnh Wilson 37 1.3 Các kỹ thuật phát đột biến gen ATP7B 1.3.1 Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp biến tính 39 1.3.2 Sử dụng enzym cắt giới hạn 40 1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing) .41 1.4 Mối tương quan đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh nhân Wilson 1.4.1 Mối tương quan dạng đột biến kiểu hình 43 1.4.2 Tương quan số đột biến điểm gen ATP7B kiểu hình 45 CHƯƠNG 48 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .48 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Địa điểm nghiên cứu 2.3 Thời gian nghiên cứu 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu .49 2.4.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 50 2.4.3 Các nội dung nghiên cứu .50 2.5 Các bước tiến hành nghiên cứu 2.5.1 Hỏi bệnh khám lâm sàng 51 2.5.2 Xét nghiệm sinh hóa chẩn đốn hình ảnh 53 2.5.3 Chẩn đoán 53 2.5.4 Quy trình phân tích đột biến gen ATP7B 54 So sánh trình tự acid amin bệnh nhân với trình tự acid amin chuẩn Genebank NM_000053.3 phần mềm Blast NCBI 2.6 Xử lý kết 2.7 Vấn đề đạo đức nghiên cứu CHƯƠNG 59 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59 3.1 Một số đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng 3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 59 3.1.2 Triệu chứng cận lâm sàng 62 3.1.3 Thể lâm sàng bệnh Wilson 66 Dựa vào kết khám lâm sàng kết xét nghiệmnghiệm, phân chia thể lâm sàng theo tiêu chuẩn Ferenci [29] Nghiên cứu 60 bệnh nhân chia thành nhóm: thể thần kinh; thể gan thể hỗn hợp gan-thần kinh (hình 3.3) .66 3.2 Kết phân tích gen ATP7B 3.2.1 Kết tách chiết DNA 66 3.2.2 Kết xác định đột biến gen ATP7B 67 3.2.3 Các dạng đột biến gen ATP7B bệnh nhân Wilson 73 3.3 Mối tương quan đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh Wilson 3.3.1 Mối tương quan số alen đột biến kiểu hình bệnh nhân Wilson .74 3.3.2 Mối tương quan dạng đột biến kiểu hình bệnh Wilson 80 CHƯƠNG 85 BÀN LUẬN 85 4.1 Một số đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh Wilson 4.1.1 Một số đặc điểm lâm sàng bệnh Wilson 85 4.1.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh Wilson 92 4.1.3 Các biến đổi hình ảnh học 94 4.1.4 Các thể lâm sàng bệnh 96 4.2 Kết phân tích gen ATP7B 4.3 Phân tích mối tương quan số alen đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh nhân Wilson 4.3.1 Mối tương quan tuổi khởi phát số alen đột biến .102 4.3.2 Mối tương quan nồng độ ceruloplasmin huyết số alen đột biến 103 4.3.3 Mối tương quan đồng niệu 24 số alen đột biến 104 4.3.4 Mối tương quan thể lâm sàng số alen đột biến .104 4.4 Phân tích mối tương quan dạng đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh nhân Wilson 4.4.1 Mối tương quan tuổi khởi phát dạng đột biến 106 4.4.2 Mối tương quan nồng độ ceruloplasmin huyết dạng đột biến 108 4.4.3 Mối tương quan đồng niệu 24 dạng đột biến 109 4.4.4 Mối tương quan thể lâm sàng dạng đột biến 110 KẾT LUẬN 121 KHUYẾN NGHỊ 122 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Chỉ số tiên lượng suy gan tối cấp [43] 26 Bảng 1.2 Kế hoạch ứng dụng lâm sàng liệu pháp gen [46] .27 Bảng 1.3: Một số dạng đột biến phổ biến giới 30 Bảng 1.4 Kiểu gen bệnh nhân Wilson Trung Quốc [70] .34 Bảng 2.1 Thang điểm chẩn đoán bệnh Wilson theo Ferenci [29] 48 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 55 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 56 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng sequencing 56 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng sequencing .57 Bảng 3.1 Tuổi khởi phát bệnh 59 Bảng 3.2 Triệu chứng giai đoạn khởi phát 60 Bảng 3.3 Triệu chứng giai đoạn toàn phát 61 Bảng 3.4 Tiền sử gia đình bệnh nhân Wilson 61 Bảng 3.5 Định lượng ceruloplasmin huyết 62 Bảng 3.6 Định lượng transaminase huyết 62 Bảng 3.7 Xét nghiệm đồng niệu 24 63 Bảng 3.8 Kết siêu âm ổ bụng 64 Bảng 3.9 Kết chụp MRI sọ não 65 Bảng 3.10 Phân bố đột biến gen ATP7B bệnh nhân Wilson .68 Bảng 3.11: Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh nhân Wilson mang đột biến đột biến công bố gây bệnh gen ATP7B .69 Bảng 3.12 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng số alen đột biến 75 Bảng 3.13 Chỉ số tương quan thể lâm sàng số alen đột biến 78 Bảng 3.14 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng dạng đột biến 80 Bảng 3.15 Chỉ số tương quan thể lâm sàng dạng đột biến 84 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Chu trình chuyển hóa đồng thể [25] Hình 1.2 Hình ảnh vịng Kayser-Fleischer rìa giác mạc (mũi tên đỏ) Hình 1.3 Hình ảnh đục nhân mắt hình hoa hướng dương (mũi tên đỏ) .10 Hình 1.4: Hình ảnh giảm tỷ trọng CT sọ não bệnh nhân nữ 14 tuổi bị bệnh Wilson [30] .15 Hình 1.5 Hình ảnh MRI sọ não bệnh nhân Wilson [27] 16 Hình 1.6 Hình ảnh chụp PET não bệnh nhân Wilson [26] .19 Hình 1.7 Cấu trúc protein ATP7B [50] 29 Hình 1.8 Phân bố số đột biến gen ATP7B [69] .32 Hình 1.9 Phân bố đột biến gen ATP7B [52] 33 Hình 1.10 Phả hệ gia đình bị bệnh di truyền lặn NST thường 36 Hình 1.11 Vị trí đột biến gen ATP7B [72] .38 Hình 1.12 Nguyên tắc kỹ thuật pDHPLC [73] 40 Hình 1.13: Hình ảnh minh họa xác định đột biến R778W gen ATP7B kỹ thuật cắt enzym giới hạn Mr: Marker100bp M: mẹ bệnh nhân; F: bố bệnh nhân; S: chị gái bệnh nhân; WD: bệnh nhân Nếu bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử R778W sản phẩm 256 bp không bị cắt có vạch, trường hợp đột biến dị hợp tử, alen bị cắt sản phẩm PCR có vạch 256 bp, 216 bp 29 bp, khơng có đột biến sản phẩm PCR bị cắt thành sản phẩm với kích thước 216 bp 29 bp [74] 41 Hình 1.14 Trình tự nucleotid xác định máy giải trình tự gen [75] 42 Hình 1.15 Các dạng đột biến thể lâm sàng bệnh Wilson [81] 44 Hình 3.1 Tỷ lệ mắc bệnh theo giới 59 Hình 3.2: Hình ảnh tăng tín hiệu nhân xám đối xứng bên phim MRI bênh nhân mã số W56.00 (mũi tên màu đỏ) 65 Hình 3.3 Các thể lâm sàng bệnh Wilson 66 Hình 3.4 Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen exon gen ATP7B 67 MK: MarkerФ174, (+) mẫu đối chứng dương, (-) đối chứng âm, 1-9 mẫu bệnh nhân 67 Hình 3.5 Hình giải trình tự gen bệnh nhân mã W8.00 73 73 Hình 3.6 Hình giải trình tự gen bệnh nhân mã W37.00 73 74 Hình 3.7 Hình giải trình tự gen bệnh nhân mã W38.00 74 Hình 3.8 Phân bố tuổi khởi phát số alen đột biến 76 Hình 3.9 Phân bố nồng độ cerulopllasmin huyết số alen đột biến 77 Hình 3.10 Phân bố nồng độ đồng niệu 24 số alen đột biến .77 78 Hình 3.11 Phân bố thể lâm sàng số alen đột biến 78 Hình 3.12 Phân bố tuổi khởi phát dạng đột biến .81 Hình 3.13 Phân bố nồng độ ceruloplasmin huyết dạng đột biến 82 Hình 3.14 Phân bố đồng niệu 24 dạng đột biến 83 Hình 3.15 Phân bố dạng đột biến thể lâm sàng bệnh Wilson 83 Hình 4.1 Hình ảnh bệnh nhân mã số W55.00 .113 Hình 4.2 Hình giải trình tự gen bệnh nhân mã W55.00 114 (đột biến c.2333G>T (p.R778L) exon gen ATP7B) 114 Kết cho thấy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử p.R778L, trình tự nucleotid G thay thành T dẫn đến ba thứ 778 CGG mã hóa Arginine (R) chuyển thành CTG mã hóa Leucin (L) 114 Hình 4.3 Hình ảnh bệnh nhân W31.00 (A) hình ảnh MRI sọ não (B) 115 (mũi tên màu đỏ tổn thương nhân bèo (trái) tổn thương nhân đuôi (phải) đối xứng bên) 115 Hình 4.4 Hình giải trình tự gen bệnh nhân mã W31.00 116 (đột biến c.3638G>A (p.G1213D) exon 17 đột biến c.3810delT (p.N1270IfsX35) exon 18 gen ATP7B) 116 Kết cho thấy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử kết hợp đột biến p.G1213D p.N1270IfsX35 Với đột biến p.G1213D, nucleotid G thay thành A dẫn đến ba thứ 1213 GGT mã hóa Glycine (G) chuyển thành GAT mã hóa Aspartate (D) Với đột biến p.N1270IfsX35, nucleotid T vị trí 1270 gây lệch khung dịch mã tạo nên mã kết thúc sớm vị trí acid amin thứ 35 tính từ vị trí đột biến .116 Hình 4.5 Hình ảnh bệnh nhân W58.00 (A) hình ảnh MRI sọ não (B) 117 (mũi tên màu đỏ tổn thương tăng tín hiệu vùng nhân xám đồi thị) 117 Hình 4.6 Hình giải trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số W58.00 .118 (đột biến c.2333G>T (p.R778L) exon gen ATP7B đột biến c.314C>A (p.S105X) exon 2) 118 Kết cho thấy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử kết hợp đột biến p.R778L p.S105X Với đột biến p.R778L, trình tự nucleotid G thay thành T dẫn đến ba thứ 778 CGG mã hóa Arginine (R) chuyển thành CTG mã hóa Leucine (L) Với đột biến p.S105X, trình tự nucleotid C thay thành A dẫn đến ba thứ 105 TCG mã hóa Serine (S) thay thành ba kết thúc TAG (X) Phân tích đột biến gen ATP7B vùng đột biến điểm thành viên gia đình bệnh nhân bao gồm bố, mẹ em trai bệnh nhân, kết cho thấy bố bệnh nhân có đột biến dị hợp tử p.R778L, mẹ bệnh nhân có đột biến dị hợp tử p.S105X em trai bệnh nhân có đột biến dị hợp tử p.S105X Như bệnh nhân nhận gen bệnh p.R778L từ người bố p.S105X từ người mẹ Em trai bệnh nhân nhận gen bệnh p.S105X từ người mẹ 118 Hình 4.7 Hình ảnh gia đình bệnh nhân mã số W58.00 .120 ĐẶT VẤN ĐỀ Y học đại có bước tiến nhanh khoảng vài thập kỷ trở lại đây, sau kiện nhà khoa học hoàn tất việc giải mã gen người Cơ chế bệnh sinh sáng tỏ mức độ phân tử, làm tiền đề cho việc chẩn đoán điều trị can thiệp trúng đích nhằm giải tận gốc nguyên bệnh Năm 1993 Kary Mullis, người phát minh kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: phản ứng khuếch đại chuỗi) trao giải Nobel hóa học Từ kỹ thuật PCR nhanh chóng phát triển ứng dụng rộng rãi nghiên cứu lĩnh vực sinh học phân tử Những tiến ngành hoá sinh, sinh học phân tử giúp sàng lọc, chẩn đốn sớm, phịng bệnh, điều trị tốt bệnh rối loạn chuyển hóa di truyền Mặc dù khơng phổ biến số nhóm bệnh khác nhóm gây nhiều khó khăn điều trị để lại hậu nặng nề sức khỏe, tinh thần chất lượng sống cho bệnh nhi, đồng thời trở thành, gánh nặng cho gia đình tồn thể xã hội Bệnh Wilson thuộc nhóm bệnh lý rối loạn chuyển hóa di truyền lặn nhiễm sắc thể thường với tỷ lệ mắc bệnh 1/30.000 trẻ [1] Bệnh gây nên đột biến gen ATP7B, gen có vai trị điều hịa q trình chuyển hóa đồng thể Khi đột biến gen xảy gây rối loạn trình chuyển hóa đồng, làm cho lượng đồng tăng cao thể tích lũy dần quan (gan, não, mắt…) gây triệu chứng đa dạng lâm sàng, triệu chứng tiến triển nặng dần với trình lắng đọng đồng theo thời gian Ngồi ra, đồng lắng đọng hầu hết quan khác thể thường biểu nhẹ muộn Bệnh nhân Wilson thường biểu triệu chứng vềề gan nhiều triệu chứng thần kinh nhóm 10 tuổi, triệu chứng thần kinh hay gặp bệnh nhân sau 30 tuổi [1] Hiện nay, để chẩn đốn xác định bệnh cần có kết hợp triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng điển hình như: nồng độ ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ đồng nước tiểu 24 giờ, định lượng đồng gan chẩn đốn hình ảnh não gan Trong thực hành lâm sàng, chẩn đoán điều trị sớm bệnh Wilson đóng vai trị quan trọng tránh tiến triển nặng bệnh dẫn đến tử vong Ngày nay, phát đột biến gen ATP7B giúp chẩn đoán xác định bệnh sớm hơn, phát người lành mang gen bệnh chẩn đoán trước sinh nhằm ngăn ngừa làm giảm tỷ lệ mắc bệnh Bên cạnh đó, xác định mối tương quan kiểu gen ATP7B với thể lâm sàng bệnh Wilson giúp cho tiên lượng bệnh có phác đồ điều trị xác, hiệu Trên giới, có nhiều nghiên cứu xác định đột biến gen ATP7B, xác định mối tương quan kiểu gen kiểu hình bệnh Wilson Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh Wilson trước chủ yếu mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng [2],[3],[4] Trong vài năm gần đây, số nghiên cứu phát đột biến gen ATP7B bắt đầu triển khai [5],[6],[7], [8] Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu phân tích mối tương quan kiểu gen ATP7B kiểu hình bệnh Wilson tạo sở cho việc tiên lượng bệnh đưa phác đồ điều trị xác, hiệu Do đề tài: “Phân tích mối tương quan đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh nhân Wilson Việt Nam” thực với mục tiêu: Mô tả đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh nhân Wilson Phân tích mối tương quan kiểu gen ATP7B kiểu hình bệnh nhân Wilson - Bố mẹ bị bệnh: - Anh chị em bị bệnh: - Họ hàng bị bệnh: III Khám bệnh Khám toàn thân - Phù - Da xạm - Da xanh, niêm mạc nhợt - Xuất huyết da - Móng tay màu xanh Khám thần kinh - Ý thức: - Giảm vận động - Run chi: Đối xứng Không đối xứng - Nói khó: - Nuốt khó - Chảy nước dãi - Thất điều - Bàn tay vụng - Bộ mặt bất động (vô cảm) - Tăng trương lực ngoại tháp - Múa vờn, múa giật - Cơn động kinh - Rối loạn tròn Khám tâm thần - Thay đổi nhân cách - Rối loạn hành vi - Dễ xúc động - Suy giảm nhận thức - Suy giảm trí nhớ Khám mắt - Vịng Kayser – Fleischer - Đục thuỷ tinh thể hình hoa hướng dương - Giảm thị lực Khám tiêu hoá - Cổ trướng - Gan to - Lách to - Xao mạch - Dấu hiệu bàn tay son - Tuần hoàn bàng hệ - Vàng da, vàng mắt - Phân đen Khám hệ tiết niệu - Đái máu Khám xương khớp - Viêm xương khớp - Tổn thương sụn Khám quan khác - Tiếng tim bất thường IV Xét nghiệm Xét nghiệm máu - Công thức máu: HC BC - Sinh hoá máu: Ure: ALP Protein: Billirubin TP: Đồng Ceruloplasmin: - Đông máu bản: PT - Test Coomb Nước tiểu - Protein - Calci - Hồng cầu TC Creatinin: Hb: GOT: GPT: Albumin Billirubin TT: Billirubin GT: Fibrinogen: APTT: - Đồng niệu 24 giờ: - Test D-Penicilamin: Trước: Siêu âm ổ bụng - Mật độ gan - Kích thước gan - Kích thước lách - Đường mật gan - Tĩnh mạch cửa - Dịch ổ bụng Chụp cắt lớp vi tính sọ não Chụp cộng hưởng từ sọ não Phân tích gen ATP7B - Bệnh nhân: - Anh, chị, em ruột bệnh nhân: - Bố, mẹ bệnh nhân: - Người thân khác huyết thống với bệnh nhân: V Chẩn đoán Tổng điểm theo Ferrenci: VI Điều trị D - Penicillamin 300mg Trientine 250 mg Kẽm Vitamin E Vitamin B6 Điều trị khác Sau: Người làm bệnh án 14,15,18,26,29,33,35,38,40,41,43,50,62,64,67,68,69,74,75,77,78,79,81,82,83,111,113 1-13,16,17,19-25,27-28,30-32,34,36,37,39,42,44-49,51-61,63,65,66,70-73,76,80,84110,112,114- PHỤ LỤC Nồng độ độ tinh 60 mẫu DNA nhóm bệnh nhân STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Nồng độ DNA (ng/µl) 237 313 291 256 351 257 255 321 365 238 275 221 343 312 278 239 278 299 284 293 Độ tinh (A260/280) 1,7 1,7 1,8 1,7 1,8 1,7 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 1, 1,7 1,7 1,7 STT 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Nồng độ DNA (ng/µl) 303 264 213 214 319 244 213 216 249 264 322 227 298 230 312 234 309 325 224 312 Độ tinh (A260/280) 1,7 1, 1,7 1,7 1,7 1,7 1,8 1,8 1,8 1,9 1,8 1,8 1,8 1,7 1,7 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 STT 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Nồng độ DNA (ng/µl) 315 382 279 290 263 219 280 211 301 199 322 265 322 287 391 203 280 283 230 293 Nồng độ độ tinh 40 mẫu DNA nhóm chứng Độ tinh (A260/280) 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 1,7 1,8 1,8 1,9 1,9 1,8 1,8 1,8 1,7 1,7 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 STT 10 11 12 13 14 Nồng độ DNA (ng/µl) 256 254 320 265 258 255 225 347 332 378 259 258 249 254 Độ tinh (A260/280) 1,7 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,7 1,8 1,7 1,8 1,7 1,8 1,7 1,7 STT 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Nồng độ DNA (ng/µl) 263 254 253 256 245 254 352 257 268 235 352 254 369 345 Độ tinh (A260/280) 1,7 1,7 1,8 1,8 1,8 1,9 1,8 1,8 1,8 1,7 1,8 1,7 1,8 1,7 STT 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Nồng độ DNA (ng/µl) 254 352 259 260 251 305 199 352 245 352 267 371 Độ tinh (A260/280) 1,7 1,9 1,7 1,8 1,8 1,9 1,9 1,8 1,8 1,8 1,7 1,7 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH KHUẾCH ĐẠI CHUỖI CỦA 21 EXON TRÊN GEN ATP7B Chú thích: M: Marker 100bp BN: Bệnh nhân (+): mẫu đối chứng dương (-): mẫu đối chứng âm khơng có DNA PHỤ LỤC HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ 21 EXON TRÊN GEN ATP7B Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon 10 Exon 11 Exon 12 Exon 13 Exon 14 Exon 15 Exon 16 Exon 17 Exon 18