BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY TỨ THƯ HỒNG, TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH., HỌ NHO (VITACEAE) S K C 0 9 MÃ SỐ: T2014-48TĐ S KC 0 Tp Hồ Chí Minh, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY TỨ THƯ HỒNG, TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH., HỌ NHO (VITACEAE) Mã số: T2014-48TĐ Chủ nhiệm đề tài: ThS Phan Thị Anh Đào Thành viên đề tài: TS Võ Thị Ngà TP HCM, 11, 2014 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI ST T Đơn vị công tác lĩnh vực chuyên môn Họ tên Nội dung nghiên cứu giao Phan Thị Anh Đào Bộ môn CN Hóa học- Khoa CN Hóa học& Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP HCM Chủ trì Võ Thị Ngà Bộ môn Hóa Phân Tich, Khoa Hóa, Tham gia ĐH Khoa học Tự Nhiên TP HCM ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Tên đơn vị Nội dung phối hợp Họ tên nước nghiên cứu người đại diện đơn vị Phòng thí nghiệm Hóa Dược– ĐH Khoa học Tự nhiên Tp HCM Thử hoạt tính kháng oxy Nguyễn Xuân Hải Phòng phân tích trung tâm-– ĐH Khoa học Tự nhiên Tp HCM hóa Phân tích phổ nghiệm iii Nguyễn Huỳnh Hoa MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined LỜI CAM ĐOAN Error! Bookmark not defined MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ix DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ix DANH M ỤC CÁC SƠ ĐỒ x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.1.1 Khái niệm gốc tự 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự thể 1.1.3 Vai trò gốc tự thể 1.1.4 Khái niệm chất kháng oxy hóa 13 1.1.5 Phân loại 13 1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 19 1.2 TÌM HIỂU VỀ CÁC CÂY THUỐC SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA Error! Bookmark not defined 1.3 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH 23 1.3.1 Mô tả thực vật phân bố sinh thái Tetrastigma erubescens Planch 23 1.3.2 Nghiên cứu dược học T.erubescen 24 1.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học chi Tetrastigma 25 1.4 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.)Error! Bookmark not defined 1.4.1 Mô tả thực vật phân bố sinh thái Nauclea orientalis (L.) Error! Bookmark not defined 1.4.2 Nghiên cứu dược học N orientalis Error! Bookmark not defined 1.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học N orientalisError! Bookmark not defined 1.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học chi NaucleaError! defined iv Bookmark not 1.5 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 30 1.5.1 Những vấn đề tồn 30 1.5.2 Định hướng nghiên cứu 30 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 32 2.1 ĐIỀU CHẾ CÁC MẪU CAO SÀNG LỌC Error! Bookmark not defined 2.1.1 Hóa chất thiết bị Error! Bookmark not defined 2.1.2 Nguyên liệu Error! Bookmark not defined 2.1.3 Xác định độ ẩm nguyên liệu Error! Bookmark not defined 2.1.4 Điều chế mẫu cao methanol Error! Bookmark not defined 2.2 TRÍCH LY VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT 32 2.2.1 Hóa chất 32 2.2.2 Thiết bị 32 2.2.3 Trích ly phân lập hợp chất từ thân T.erubescens 33 2.2.4 Trích ly phân lập hợp chất từ thân N.orientalis 34 2.3 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC Error! Bookmark not defined 2.3.1 Nguyên tắc Error! Bookmark not defined 2.3.2 Hóa chất thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3.3 Chuẩn bị mẫu Error! Bookmark not defined 2.3.4 Qui trình xác định Error! Bookmark not defined 2.3.5 Dựng đường chuẩn Error! Bookmark not defined 2.3.6 Xử lý kết Error! Bookmark not defined 2.3.7 Nơi thực nghiệm Error! Bookmark not defined 2.4 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 34 2.4.1 Khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 34 2.3.2 Khảo sát hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid 36 2.4.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan chuột nhắt bị suy giảm hệ miễn dịch cyclophosphamide (mô hình in vivo) Error! Bookmark not defined CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓAError! Bookmark not defined 3.1.1 Điều chế mẫu cao MeOH Error! Bookmark not defined v 3.1.2 Kết khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự DPPHError! Bookmark not defined 3.1.2 Kết khảo sát hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipidError! Bookmark not defined 3.1.3 Bàn luận kết nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa Error! Bookmark not defined 3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY T.ERUBESCENS VÀ THÂN CÂY N.ORIENTALIS 39 3.2.1 Kết thử hoạt tính mẫu cao T erubescensError! Bookmark not defined 3.2.2 Kết thử hoạt tính mẫu cao N orientalisError! Bookmark not defined 3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY T ERUBESCENS 40 3.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất polyphenol đơn vòngError! Bookmark not defined 3.3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất stilbene 40 3.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất flavonoid 47 3.3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất benzopyranoidError! Bookmark not defined 3.3.5 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất nhóm lignanError! Bookmark not defined 3.3.6 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất nhóm steroidError! Bookmark not defined 3.3.7 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất nhóm norisoprenoidError! Bookmark not defined 3.4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.) Error! Bookmark not defined 3.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất polyphenol đơn vòngError! Bookmark not defined 3.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất benzopyranoidError! Bookmark not defined vi 3.4.3 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất triterpenoidError! Bookmark not defined 3.4.4 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất monoterpenoidError! Bookmark not defined 3.4.5 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất flavonoidError! Bookmark not defined 3.4.6 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất lignan Error! Bookmark not defined 3.5 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC Error! Bookmark not defined 3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 66 3.6.1 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 66 3.6.2 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid 69 3.6.3 Kết nghiên cứu in vivo- mô hình gây suy giảm miễn dịch chuột nhắt cyclophosphamide Error! Bookmark not defined CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A : Acetone AO (AH) : Antioxidant (chất kháng oxy hóa) Asc : Ascorbic acid (vitamin C) BHA : Butylated hydroxyanisole br : Broad (rộng) BTH : Butylated hydroxytoluene CHCl3 : Chloroform CPA : Cyclophosphamide CTPT : Công thức phân tử d : Doublet (mũi đôi) DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide DNA : Acid deoxyribonucleic DPPH : 2,2-diphenylpicrylhydrazyl E : Ethyl acetate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ET : Electron transfer methods GSH : Glutathione H : n-hexan HAT : Hydrogen atom transfer methods HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HR-EIS-MS : High resolution electron spray ionization mass spectroscopy HSQC : Heteronuclear single quantum coherence IC50 : Nồng độ mẫu mà ức chế 50 % gốc tự J : Hằng số ghép M : Methanol m : Multiplet (mũi đa) MDA : Malonyldialdehyde NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NMR : Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) viii NOS : Nitrogen oxygen species NP : Nomal phase (pha thường) PBS : Phosphate buffered saline PG : Propyl gallate Pr : Protein quin : quintet (mũi năm) RNS : Reactive nitrogen species ROS : Reactive oxygen species RP : Reversed phase (pha đảo) s : Singlet (mũi đơn) SEM : Standard error of the mean (sai số chuẩn giá trị trung bình) SKC : Sắc ký cột TBA : Acid thiobarbituric TBHQ : tert-Butylhydroquinone TCA : Trichloroacetic acid TLC : Thin layer chromatography (sắc ký mỏng) Trolox : Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic UV : Ultraviolet (tử ngoại) W : Water (nước) XO : Xanthine oxydase YHCT : Y học cổ truyền ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU x DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xi MỞ ĐẦU * Tổng quan tình hình nghiên cứu nước Tình hình nước: hoạt tính kháng oxy hóa hoạt tính sinh học nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhiều vào khoảng 20 năm trở lại Trên giới có môt số công trình nghiên cứu mang tính qui mô đối tượng lớn thuốc Xu hướng nghiên cứu phân lập hoạt chất từ mẫu dược liệu phát triển mạnh Họ Nho (Vitaceae) họ thực vật lớn, chi Tetrastigma chi lớn thứ ba với 95 loài Song nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa thực loài (T thomsonianum) nghiên cứu thành phần hóa học tiến hành loài Cây T Erubescens (Tứ thư hồng) loài chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng oxy hóa Tình hình nước: nước ta nước nhiệt đới có thảm thực vật phong phú giới với khoảng 12.000 loài, chưa kể tới rong, rêu, nấm Bên cạnh đó, YHCT Việt Nam phát triển với bề dày kinh nghiệm lưu truyền qua hệ Có nhiều thuốc sử dụng dân gian để điều trị nhiều bệnh lý phải kể tới bệnh liên quan tới gốc tự ưng thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp Tuy nhiên, chứng khoa học thuốc chưa có hạn chế Ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu mang tính qui mô, sâu rộng theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa - Cây T Erubescens loài chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng oxy hóa Do vậy, mục tiêu tìm kiếm hoạt chất kháng oxy hóa mạnh, tiến hành phân lập định danh hợp chất nhằm tìm hiểu thêm thành phần hóa học * Tính cấp thiết: Trong năm gần đây, nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến vấn đề gốc tự do, chất kháng oxy hóa hoạt tính kháng oxy hóa Trong thể người, lượng gốc tự lớn, vượt qua mức kiểm soát hệ thống miễn dịch, gốc tự công vào đại phân tử DNA, protein, lipid gây rối loạn trình sinh hóa thể Gốc tự biết thủ phạm có liên quan tới nhiều bệnh mà phải kể tới bệnh nguy hiểm ung thư, viêm khớp, huyết áp, tim mạch, Alzheimer, Parkinson …Chất kháng oxy hóa đưa vào thể người thông qua thực phẩm, dược phẩm có khả ngăn ngừa, ức chế loại bỏ tác dụng độc hại gốc tự cách trực tiếp gián tiếp Nhu cầu thị yếu người ngày cao, đòi hỏi tìm tòi, nghiên cứu nhà khoa học sâu rộng, hiệu kịp thời Ngày này, xu hướng nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm thay cho chất kháng oxy hóa tổng hợp sử dụng nhiều thực phẩm, y học sống ngày Vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, An Giang có hệ thực vật phong phú đa dạng, sử dụng nhiều y hoc cổ truyền (YHCT) Có nhiều thuốc sử dụng dân gian để điều trị nhiều bệnh lý liên quan tới gốc tự ung thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp…Tuy nhiên, nay, chưa có nghiên cứu qui mô hệ thống thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa Từ kết sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa 90 thuốc An Giang (3/2012), nhóm tìm cao MeOH trích ly từ thân Tứ thư hồng có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh với giá trị IC50= 2,1 µg/ml (phương pháp thử ức chế gốc tự DPPH) IC50= 4.9 µg/ml (phương pháp ức chế trình peroxide hóa lipid) Ở Việt Nam giới, chưa có công trình khoa học nghiên cứu thành phần hoạt tính Dây rơm nói chúng thân Dây rơm nói riêng Do vậy, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng oxy hóa thân Tứ thư hồng cần thiết hứa hẹn kết khả quan * Mục tiêu:  Cô lập hợp chất từ thân Tứ thư hồng, Tetrastigma erubescens Planch., Họ Nho (Vitaceae)  Xác định cấu trúc hóa học hợp chất cô lập  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp ức chế gốc tự DPPH, ức chế trình peroxyde hóa lipid * Cách tiếp cận  Tham khảo tài liệu  Thực nghiệm * Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: Điều chế mẫu cao phương pháp trích nóng dung môi MeOH cô lập hợp chất phương pháp sắc ký cột, sắc ký mỏng điều chế  Phương pháp nghiên cứu phân tích tổng hợp: Phân tích tổng hợp liệu phổ nghiệm phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13 C, DEPT, COSY, HMBC, HMQC khối phổ để xác định cấu trúc hóa học hợp chất polyphenol cô lập * Đối tượng phạm vi nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu: thân Tứ thư hồng  Phạm vi nghiên cứu : - Cô lập 10 hợp chất tinh khiết * Nội dung nghiên cứu  Cô lập hợp chất tinh khiết từ thân Tứ thư hồng phương pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký mỏng, sắc ký mỏng điều chế  Xác định cấu trúc hóa học hợp chất cô lập phương pháp phổ nghiệm đại cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều, khối phổ,  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp ức chế gốc tự DPPH hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.1.1 Khái niệm gốc tự Gốc tự (free radical) định nghĩa phân tử, nguyên tử, nhóm nguyên tử có chứa hay nhiều electron tự (electron độc thân) lớp [25,32,35] Gốc tự gồm dạng hoạt động là: dạng hoạt động nitrogen (RNSreactive nitrogen species) (bảng 1.1) dạng hoạt động oxygen (ROS-reactive oxygen species) (bảng 1.2) Bảng 1.1 Các dạng hoạt động nitrogen [25] Các dạng động Ký hiệu Thời tồn Nitric oxide NO● 1s Nitrogen dioxide Acid peroxynitrous Peroxynitrite NO2● 1s Vai trò quan trọng hệ thống thần kinh trung ương ngoại biên Hình thành trình ô nhiễm không khí ONOOH Khá ổn định Được hình thành ONOO─ nhận thêm proton ONOO─ 10-3 s Hoạt tính cao, hình thành từ NO● O2●─ hoạt gian Hoạt động Bảng 1.2 Các dạng hoạt động oxygen [25] Các dạng hoạt động Ký hiệu Thời gian tồn Superoxide O2●─ 10-6s Gốc hydroxyl HO● 10-9s Alkoxyl Gốc peroxyl Hydroperoxide hữu Hydrogen peroxide RO● ROO● 1s 1s ROOH Ổn định H2O2 Bền Singlet oxygen 10-6s Ozon O3 O2 1s Hoạt động Tạo ty thể (mitochondria), hệ thống tim mạch phận khác Hoạt tính cao, tạo tình trạng thể dư chất sắt (phản ứng Fenton) Hoạt tính cao, hình thành đại phân tử bị gốc tự công Phản ứng với ion kim loại chuyển tiếp để tạo dạng hoạt động Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận electron để chuyển hóa thành gốc tự HO● Hoạt tính cao, hình thành trình quang học (photosensitization) phản ứng hóa học Là chất gây ô nhiễm khí quyển, phản ứng với phân tử khác để tạo 1O2 Các gốc tự thường bền có lượng cao, dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng polymer hóa… Gốc tự có hoạt tính cao nên thời gian tồn chúng thường ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố: cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp.[82] Hai gốc tự quan trọng chứa nitrogen NO• ONOO-, NO• gốc tự quan tâm nhiều có vai trò quan trọng hệ thống thần kinh trung ương, ngoại biên tác nhân điều hòa huyết áp Nếu dạng hoạt động nitrogen có ý nghĩa lâm sàng dạng hoạt động oxygen lại tác nhân nguy hiểm gây nhiều bệnh lý.[25,84] Các dạng oxygen hoạt động có lượng cao, bền dễ dàng phản ứng với đại phân tử sinh học protein, lipid, DNA… gây rối loạn trình sinh hóa thể Đồng thời phân tử sống bị gốc tự công, điện tử trở thành gốc tự mới, tiếp tục phản ứng với phân tử khác tạo thành chuỗi phản ứng thường gọi phản ứng dây chuyền thể, gây biến đổi có tác hại thể.[25,84] 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự thể 1.1.2.1 Nguồn nội sinh Gốc tự thể tạo trình sinh lý (quá trình hô hấp tế bào), trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm), hệ thống enzyme thân oxy hóa (prooxydant enzyme) có mặt ion kim loại chuyển tiếp thể a) Quá trình hô hấp tế bào [26,39,98] Quá trình hô hấp tế bào chuỗi phản ứng oxy hóa-khử gốc tự sản phẩm trung gian sinh trình Ví dụ: Quá trình khử oxygen tạo nước trình hô hấp tạo gốc tự O2●-, HO● thông qua phản ứng sau: O2 + H+ + 4e  2H2O (1.1) O2 + e  O2●H2O2  O2 ●- (1.2) + + 2H + e (1.3) H2O2 + H+ + e  HO● + H2O ● + HO + H + e  H2O (1.4) (1.5) Bên cạnh đó, phản ứng phụ gốc tự trình hô hấp hình thành gốc tự mới, độc hại Một phản ứng phụ đáng ý phản ứng - Haber-Weiss (phản ứng 1.6), xảy gốc O2● H2O2 tạo nên gốc HO● oxygen đơn bội: O2●- + H2O2  O2 + HO● + HO- (1.6) Phản ứng 1.6 xảy nhanh xúc tác ion kim loại chuyển tiếp sắt, đồng, coban,… Oxygen đơn bội gốc hydroxyl hình thành gốc tự có khả phản ứng mạnh độc hại Chúng nguyên nhân gây trình peroxide hóa màng lipid b) Hội chứng viêm nhiễm [26,76] Hội chứng viêm nhiễm phản ứng tự vệ thể sống nhằm chống lại công vi khuẩn sinh vật lạ từ bên xâm nhập vào thể sinh thể Khi vi khuẩn sinh vật lạ xâm nhập vào thể bị bạch cầu đa nhân trung tính (neutrophil) bao kín để làm nhiệm vụ thực bào Lúc này, enzyme NADPH oxydase màng bạch cầu hoạt hóa, xúc tác phản ứng O2 NADPH tạo nên gốc tự O2●- (phản ứng 1.7), từ tạo nhiều gốc tự khác nhằm phân hủy sinh vật lạ Một phần gốc tự bị thoát bạch cầu, gây nên phản ứng viêm NADPH oxydase 2O2 + NADPH 2O2●- + NADP + H+  (1.7) c) Các enzyme thân oxy hóa [26,33,88] Một hệ thống enzyme thân oxy hóa thể có khả tạo gốc tự xanthine oxydase (XO), nitric oxide synthase, myeloperoxydase … Gốc O2●- NO● gốc tự sinh xúc tác enzyme thân oxy hóa - Xanthine oxydase enzyme quan trọng trình thoái hóa hợp chất purine XO dùng O2 chất chuyển electron trình phản ứng kết dẫn đến hình thành gốc O2●- Điều minh họa phản ứng 1.8 sau: O HN O O H N + N H H2 O + 2O2 XO HN N N H O H N 2O2 O + + 2H+ (1.8) N H Sự tạo thành gốc O2●- XO đóng vai trò quan trọng việc gây tổn thương tượng thiếu máu cục (ischaemia injury) - Nitric oxide synthase enzyme xúc tác oxy hóa L-arginine thành citrulline tạo gốc NO● Enzyme dùng NADPH làm chất chuyển electron trình phản ứng Nếu phản ứng có tồn gốc O2●- gốc O2●- dễ dàng phản ứng với gốc NO● tạo ONOO- (một hợp chất có hại DNA) - Enzyme myeloperoxydase tạo hoạt hóa bạch cầu trung tính, sử dụng H2O2 để oxy hóa ion Cl- tạo HOCl, hợp chất gốc tự có khả oxy hóa mạnh, gây nguy hại cho mô trình viêm nhiễm d) Các ion kim loại chuyển tiếp [26,76] Phản ứng ion kim loại chuyển tiếp hợp chất peroxide góp phần sản sinh gốc tự thể Phản ứng phân hủy H2O2 thành gốc HO● xúc tác ion sắt ví dụ điển hình (phản ứng 1.9 1.10) Fe2+ + H2O2  HO- + HO● + Fe3+ (1.9) Fe3+ + H2O2  H+ + HOO● + Fe2+ (1.10) Hai phản ứng gọi phản ứng Fenton Ngoài sắt, ion kim loại chuyển tiếp khác đồng, cobalt tham gia trình 1.1.2.2 Nguồn ngoại sinh Ngoài yếu tố nội sinh, gốc tự hình thành thể yếu tố ngoại sinh ô nhiễm môi trường, xạ, khói thuốc, ozon … a) Sự xạ [26] Thành phần chủ yếu thể nước, xạ có lượng cao (tia X, tia UV…) chiếu vào thể phân hủy phân tử nước thành gốc tự do, có khả phản ứng mạnh (phản ứng 1.11 1.12): H2O  HO● + H+ + e-aq ● ● H2O  HO + H (1.11) (1.12) Nếu nước có oxygen xảy phản ứng sau (phản ứng 1.13 1.14): -aq O2 + e ●  O2 ●- (1.13) ● H + O2  HOO (gốc hydroperoxide) (1.14) Như vậy, tác dụng xạ, gốc tự HO●, O2●-, HOO● hình thành thể Điều giải thích lão hóa da người tăng lên vùng bị phơi bày ánh sáng Đó xạ mặt trời, tia cực tím làm sản sinh gốc tự có khả tham gia trình peroxide hóa lipid tế bào da Bức xạ khơi mào phản ứng gốc tế bào, chẳng hạn tự oxy hóa lipid Đồng thời, phân tử DNA mục tiêu bị nguy hại xạ gốc tự sản sinh từ phân giải nước công bazơ DNA b) Khói thuốc [58] Khói thuốc chứa lượng lớn hợp chất aldehyde, expoxide, peroxide gốc oxy hóa nitric oxide, gốc peroxyl, gốc với trung tâm carbon diện pha khí Theo ước tính, thuốc có khoảng 1015 gốc tự Chúng có khả tồn thời gian dài chúng công túi phổi Bên cạnh đó, khói thuốc chứa gốc bền nhựa thuốc Sự vi xuất huyết nguyên nhân chủ yếu kết tủa sắt tìm thấy mô phổi người hút thuốc Sắt thể dễ dàng xúc tác cho phản ứng Fenton, sinh gốc HO● độc hại c) Ozon [40] Ozon tác nhân độc hại tạo gốc tự ảnh hưởng thể sống biểu chủ yếu qua tổn thương phổi máu Ozon phản ứng trực tiếp với hợp chất bất bão hòa acid béo lipid tự phân hủy sinh O2, từ gia tăng khả hình thành gốc tự thể 1.1.3 Vai trò gốc tự thể Ở nồng độ thấp trung bình, gốc tự có lợi cần thiết cho hoạt động thể sống Trong trình trao đổi chất, gốc tự đóng vai trò trung gian di chuyển điện tử từ phân tử sang phân tử khác nhằm tạo lượng cung cấp cho hoạt động sống người Gốc tự góp phần với bạch cầu tiêu diệt vi sinh vật có hại, tăng cường khả bảo vệ cho hệ thống miễn dịch thể Bên cạnh tác dụng giúp tiêu diệt vi sinh vật lạ, gốc tự góp phần quét dọn tế bào già, chết thể tạo điều kiện cho tế bào sinh sôi, phát triển tiêu diệt tế bào bất thường tế bào ung thư Ngoài ra, gốc tự tham gia vào nhiều trình có lợi khác cho thể đóng vai trò chất dẫn truyền thần kinh (NO•) tác nhân điều hòa huyết áp Trong thể sống tồn cân dạng hoạt động dạng kháng oxy hóa, trạng thái cân nội môi (homeostasis) Tuy nhiên, ảnh hưởng nhiều yếu tố tác động ngoại sinh làm gia tăng nồng độ dạng hoạt động, vượt mức kiểm soát hệ thống kháng oxy hóa thể Hiện tượng stress oxy hóa (oxydative stress) xảy ra, mang lại nhiều nguy hại cho người gốc tự bùng phát công phân tử sống lipid, protein, DNA gây chết tế bào.[80,82] Các phận thể chịu công gốc tự bệnh lý liên quan trình bày sơ đồ 1.1 Theo nhà khoa học, gốc tự thủ phạm gây tới 60 bệnh (sơ đồ 1.1), đáng kể gồm có: viêm khớp, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp, xơ gan, thiếu máu tim [25,84] Các bệnh lý thường xảy trình tổn thương thể Não  Bệnh Parkinson  Bệnh Alzheimer  Thái hoá thần kinh Tai biến mạch máu não Mạch máu  Thiếu máu  Đột qụi  Huyết áp Da  Rối loạn chuyển hoá porphyrin  Lão hoá  Viêm da Tim  Bệnh Keshan  Xơ vữa động mạch  Thiếu máu tim Mắt  Đục thuỷ tinh thể  Thoái hoá võng mạc / điểm vàng Gốc tự Hệ miễn dịch  Viễm nhiễm mãn tính  Bệnh lupus  Viêm đường ruột Thận  Thận mãn tính  Viêm cầu thận Cơ quan khác  Tiểu đường  Lão hoá  Mệt mỏi Khớp  Viêm khớp  Thấp khớp  Thoái hoá khớp Phổi  Hen phế quản  Dị ứng  Ung thư phổi Sơ đồ 1.1 Các phận thể bệnh lý liên quan tới gốc tự [25,84] 1.1.3.1 Sự tổn thương trình peroxide hóa lipid [80, 82] Trong thể, nước tổ chức màng chiếm phần lớn giữ vai trò quan trọng Thành phần màng chủ yếu acid béo chưa no, phospholipid,…Vì vậy, xác suất gốc tự công vào thành phần lipid gây trình peroxide hóa lipid cao Quá trình peroxide hóa tương tác dạng oxygen hoạt động với acid béo chưa no, tạo nhiều sản phẩm độc hại phản ứng gốc tự lan truyền thể Quá trình peroxide hóa lipid chuỗi phản ứng gốc tự điển hình với ba giai đoạn: khơi mào, phát triển kết thúc Trong giai đoạn khơi mào, gốc HO• lấy nguyên tử hydrogen nhóm methylene lipid (LH) hình thành gốc tự lipid (L•) (phản ứng 1.15) Gốc tự 10 [...]... như ung th , tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp…Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có bất kỳ một nghiên cứu qui mô và hệ thống nào về các cây thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa Từ kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của 90 cây thuốc An Giang (3 /2012 ), nhóm chúng tôi đã tìm ra cao MeOH trích ly từ thân cây Tứ thư hồng có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50= 2,1 µg/ml (phương... Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu mang tính qui m , sâu rộng theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa - Cây T Erubescens là một loài cây chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa Do vậy, ngoài mục tiêu chính là tìm kiếm những hoạt chất kháng oxy hóa mạnh, chúng tôi còn tiến hành phân lập và định danh các hợp chất nhằm tìm hiểu thêm về thành phần hóa học của cây này... Nho (Vitaceae) là một họ thực vật lớn, trong đó chi Tetrastigma là chi lớn thứ ba với hơn 95 loài Song các nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa mới được thực hiện trên 1 loài (T thomsonianum) và nghiên cứu thành phần hóa học mới được tiến hành trên 5 loài Cây T Erubescens (Tứ thư hồng) là một loài cây chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa Tình hình trong nước: nước ta là... tiêu:  Cô lập các hợp chất từ thân cây Tứ thư hồng, Tetrastigma erubescens Planch. , Họ Nho (Vitaceae) 2  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH, ức chế quá trình peroxyde hóa lipid * Cách tiếp cận  Tham khảo tài liệu  Thực nghiệm * Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: Điều chế các mẫu... 2,1 µg/ml (phương pháp thử ức chế gốc tự do DPPH) và IC50= 4.9 µg/ml (phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid) Ở Việt Nam và trên thế giới, chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về thành phần và hoạt tính của cây Dây rơm nói chúng và thân cây Dây rơm nói riêng Do vậy, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Tứ thư hồng là hết sức cần thiết và hứa hẹn những... nghiên cứu trong và ngoài nước Tình hình ngoài nước: hoạt tính kháng oxy hóa là một hoạt tính sinh học được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhiều vào khoảng 20 năm trở lại đây Trên thế giới có môt số ít các công trình nghiên cứu mang tính qui mô trên đối tượng lớn các cây thuốc Xu hướng nghiên cứu phân lập các hoạt chất từ các mẫu dược liệu hiện đang phát triển mạnh Họ Nho (Vitaceae) là một họ. .. peroxide hóa lipid 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.1.1 Khái niệm về gốc tự do Gốc tự do (free radical) được định nghĩa là những phân t , nguyên t , nhóm nguyên tử có chứa 1 hay nhiều electron tự do (electron độc thân) ở lớp ngoài cùng [2 5,3 2,3 5] Gốc tự do gồm 2 dạng hoạt động chính là: dạng hoạt động của nitrogen (RNSreactive nitrogen species) (bảng 1. 1) và dạng hoạt động của oxygen... tự do O2●- (phản ứng 1.7 ), từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm phân hủy các sinh vật lạ Một phần các gốc tự do bị thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng viêm NADPH oxydase 2O2 + NADPH 2O2●- + NADP + H+  (1 . 7) c) Các enzyme thân oxy hóa [2 6,3 3,8 8] Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do như xanthine oxydase (XO ), nitric oxide synthase, myeloperoxydase … Gốc... ung th , viêm khớp, huyết áp, tim mạch, Alzheimer, Parkinson …Chất kháng oxy hóa được đưa vào cơ thể con người thông qua thực phẩm, dược phẩm có khả năng ngăn ngừa, ức chế và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp Nhu cầu và thị yếu của con người ngày càng cao, đòi hỏi sự tìm tòi, nghiên cứu của các nhà khoa học càng sâu rộng, hiệu quả và kịp thời Ngày này, xu... dung nghiên cứu  Cô lập các hợp chất tinh khiết từ thân cây Tứ thư hồng bằng các phương pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký bản mỏng điều chế  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, khối ph ,  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và hoạt tính