ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH THU NHẬN HP CHẤT TỰ NHIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY RỄ TƠ GVHD: TS Lê Thò Thủy Tiên SVTH: Trần Tú Bửu MSSV: 60700186 Tp HCM, Tháng 6/2011 LỜI CẢM ƠN Em xin cảm ơn thầy mơn Cơng nghệ Sinh học trường Đại học Bách Khoa Tp HCM tận tình truyền đạt kiến thức cho em, giúp em có kiến thức cần thiết hỗ trợ cho việc thực đồ án Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Lê Thị Thủy Tiên nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án i MỤC LỤC Đề mục Trang Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục bảng iv Danh mục hình iv Danh mục ảnh v Lời mở đầu Chương TỔNG QUAN 1.1 Hợp chất tự nhiên (HCTN) 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Con đường sinh tổng hợp HCTN 1.1.4 Ý nghĩa HCTN thân thực vật người 1.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 1.2.1 Lịch sử Agrobacterium rhizogenes 1.2.2 Gene Ri T-DNA Agrobacterium rhizogenes 1.3 Kĩ thuật thu nhận HCTN in vitro 11 1.4 Rễ tơ 14 Chương KỸ THUẬT NI CẤY RỄ TƠ 20 2.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu cấy 20 2.2 Giai đoạn chuyển gene cảm ứng tạo rễ tơ 22 2.2.1 Kĩ thuật chuyển gene vào tế bào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes cảm ứng tạo rễ tơ 22 2.2.2 Loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 24 2.2.3 Kiểm tra chọn lọc dòng chuyển gene 24 ii 2.3 Ni cấy rễ tơ để sản xuất HCTN 25 2.3.1 Ni cấy rễ tơ quy mơ bioreactor để thu nhận HCTN 25 2.3.2 Khảo sát điều kiện q trình ni cấy rễ tơ thu nhận HCTN 26 2.3.3 Các dạng thiết bị bioreactor sử dụng để ni cấy rễ tơ 28 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp HCTN hệ thống ni cấy rễ tơ 32 2.4.1 Sự lựa chọn dòng 33 2.4.2 Hình thái rễ tơ sau chuyển gene 33 2.4.3 Mối quan hệ tổng hợp HCTN với giai đoạn phát triển rễ tơ (phase) q trình ni cấy 35 2.4.4 Thành phần mơi trường 35 2.4.5 Hàm lượng khí 36 2.4.6 Chất cảm ứng 37 2.4.7 Ánh sáng 38 2.4.8 Các yếu tố khác 39 2.5 Lưu trữ bảo quản rễ tơ 40 Chương Một số kết nghiên cứu phương pháp ni cấy rễ tơ để thu nhận HCTN 42 3.1 Thu nhận resveratrol phương pháp ni cấy rễ tơ đậu phộng 42 3.1 Thu nhận plumbagin phương pháp ni cấy rễ tơ Plumbago indica 43 3.2 Thu nhận ginsenoside phương pháp ni cấy rễ tơ Panax ginseng 45 3.3 Thu nhận betalain phương pháp ni cấy rễ tơ Beta vulgaris 48 Chương KẾT LUẬN 51 Tài liệu tham khảo 53 iii Danh mục bảng Bảng 1.1: Danh mục HCTN (theo Chapman Hall, 1998) Bảng 2.1: Ảnh hưởng chủng A rhizogenes khác lên cảm ứng rễ tơ từ mẫu A hypogaea 33 Bảng 2.2: Sự tăng hàm lượng HCTN hệ thống ni cấy rễ tơ cách sử dụng chất cảm ứng khác 38 Danh mục hình Hình 1.1: Các đường sinh tổng hợp HCTN thực vật Hình 1.2: Con đường acid shikimic Hình 1.3: Mối liên hệ đường MVA đường MEP Hình 1.5: Mơ hình chung Ri-plasmid 11 Hình 1.6: Ri-plasmid – pRiA4b 11 Hình 1.7: Q trình ni cấy dịch treo tế bào 13 Hình 1.8: Q trình ni cấy mơ, quan 13 Hình 2.1: Sơ đồ q trình ni cấy rễ tơ 21 Hình 2.2: Q trình chuyển gene vào tế bào thực vật nhờ A rhizogenes 23 Hình 2.3: Thiết bị ni cấy chìm có sục khí 28 Hình 2.4: Thiết bị cột sủi bọt ni cấy rễ tơ B vulgaris 29 Hình 2.5: Thiết bị cột sủi bọt chia thành nhiều đoạn 29 Hình 2.6: Thiết bị kết hợp khuấy sục khí 30 Hình 2.7: Thiết bị phun dạng sương mù 30 Hình 2.8: Thiết bị ni cấy ngập chìm tạm thời – RITA® 31 Hình 2.9: Hệ thống ni cấy dạng phun sương điều khiển tự động 32 Hình 2.12: Tốc độ tăng sinh khối hàm lượng ginsenoside dạng hình thái rễ tơ khác ni mơi trường SH khơng chứa hormone thực vật 35 Hình 3.1: Cấu trúc hóa học dạng trans- cis- resveratrol hợp chất stilbenoid liên quan 43 Hình 3.3: Cấu trúc chung ginsenoside [14] 45 Hình 3.6: Betalain có dịch chiết thu nhận từ rễ bình thường hệ thống ni cấy rễ tơ B vulgaris cv Detroit Dark Red 49 iv Hình 3.7: Hoạt tính ức chế DPPH tự dịch chiết từ rễ bình thường hệ thống ni cấy rễ tơ B vulgaris cv Detroit Dark Red 49 Hình 3.8: Giá trị ORAC chất chiết từ rễ bình thường hệ thống ni cấy rễ tơ B vulgaris cv Detroit Dark Red 49 Hình 3.9: Các bioreactor sử dụng để ni rễ tơ Beta vulgaris cv Detroit Dark Red 50 Danh mục ảnh Hình 1.4: Lơng rễ cảm ứng A rhizogenes mơ sẹo cảm ứng A tumefaciens Hình 1.9: Rễ tơ Beta vulgaris phát triển mơi trường agar 14 Hình 1.10: Rễ tơ Harpagophytum procumbens bioreactor 14 Hình 1.11: Rễ tơ G glabra ni mơi trường lỏng 14 Hình 1.12: Rễ tơ đậu phộng 14 Hình 2.10: Rễ tơ phát triển thiết bị dạng phun sương 32 Hình 2.11: Rễ tơ Panax ginseng ni mơi trường SH sau tuần, biểu ba kiểu hình thái khác 34 Hình 2.13: Hình thái rễ tơ M lanceolata trước sau lưu trữ 41 Hình 3.2: Rễ tơ Arachis hypogaea L ni cấy erlen để sản xuất resveratrol 43 Hình 3.4: Sự sản xuất ginsenoside từ rễ tơ nhân sâm bioreactor (5 ÷ 20 l) quy mơ phòng thí nghiệm 47 Hình 3.5: Hệ thống bioreactor (10,000 l) sử dụng ni cấy rễ tơ P ginseng 47 v LỜI MỞ ĐẦU Các nghiên cứu hợp chất biến dưỡng thứ cấp thực vật phát triển mạnh từ 50 năm trở lại Ngồi việc đóng vai trò lớn hệ thống tự vệ thực vật, hợp chất biến dưỡng thứ cấp mang lại nhiều lợi ích cho người Rất nhiều sản phẩm phục vụ ngành dược phẩm, mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm có nguồn gốc từ hợp chất biến dưỡng thứ cấp thực vật Việc tổng hợp hợp chất nghiên cứu nhiều hệ thống ni cấy in vitro hệ thống ni cấy mơ, tế bào thực vật hệ thống ni cấy tế bào thực vật chuyển gene từ vi sinh vật Ở hệ thống có lợi hạn chế khác Mặc dù vi sinh vật xem nguồn sản xuất enzyme hợp chất tự nhiên tối ưu nhất, sản phẩm biến dưỡng thứ cấp thực vật hệ thống có nhiều hạn chế hạn chế hiểu biết đường sinh tổng hợp nhiều hợp chất tự nhiên thực vật Do đó, hệ thống ni cấy mơ tế bào thực vật đối tượng ưu tiên để sản xuất hợp chất tự nhiên thực vật Trong đó, rễ tơ đối tượng có nhiều ưu quan tâm phát triển nhiều, có nhiều tiềm lớn việc nâng lên quy mơ sản xuất cơng nghiệp Tuy nhiên, biết đến muộn so với hệ thống ni cấy tế bào ni cấy mơ thực vật khác, số lượng nghiên cứu hệ thống ni cấy rễ tơ nhiều đối tượng hạn chế cần phát triển mạnh để đưa vào ứng dụng sản xuất Chương TỔNG QUAN 1.1 Hợp chất tự nhiên (HCTN) 1.1.1 Khái niệm Hợp chất tự nhiên (HCTN), gọi hợp chất thứ cấp, sản phẩm hoạt động biến dưỡng thứ cấp thực vật Q trình trao đổi chất thực vật chia thành dạng biến dưỡng bậc biến dưỡng bậc (biến dưỡng thứ cấp) Ở q trình biến dưỡng bậc thực vật chủ yếu tạo vật chất lượng phục vụ cho nhu cầu tăng trưởng phát triển chúng, việc tạo vật chất diễn thường xun liên tục suốt q trình tồn thực vật Còn q trình biến dưỡng thứ cấp thực vật tổng hợp hợp chất thứ cấp để bảo vệ thực vật khỏi yếu tố tác động bên ngồi (stress, tia UV, cơng vi sinh vật, …) , chúng khơng có vai trò tăng trưởng phát triển thực vật Các hợp chất thứ cấp khơng tổng hợp thường xun mà tạo có tín hiệu tác động yếu tố ngoại cảnh đến thực vật Thực vật sản xuất số lượng phong phú HCTN Cơ sở liệu NAPRALERT vào năm 1988 thống kê khoảng 88.000 hợp chất, hầu hết chúng có nguồn gốc từ thực vật Mỗi năm có khoảng 4000 hợp chất phát Năm 1998, từ điển sản phẩm tự nhiên (Dictionary of Natural Products) theo Chapman Hall đưa bảng số liệu chứa khoảng 85.000 danh mục hợp chất thứ cấp Số liệu trình bày bảng [26] Bảng 1.1: Danh mục HCTN (theo Chapman Hall, 1998) Tổng số lượng danh mục 85,058 Trong bao gồm: aliphatics 5200 polyketides 2442 carbohydrates oxygen heterocycles simple aromatics 3210 1348 4527 benzofuranoids benzopyranoids flavonoids 387 2694 8128 tannins lignans polycyclic aromatics 750 1565 2448 terpenoids amino acid alkaloids 1.1.2 27,463 3921 15,765 hemimonosesquiditri- 56 1946 8650 7834 5582 tetrapolysteroids 352 51 4600 indole isoquinoline steroidal 3693 3498 873 Phân loại Các hợp chất thự nhiên phân loại theo nhiều cách khác dựa vào cơng thức hóa học HCTN, dựa vào nguồn thực vật, dựa vào đường sinh tổng hợp HCTN Dựa vào cơng thức hóa học HCTN chia thành nhóm lớn terpenoid, hợp chất chứa phenol hợp chất chứa nitơ Trong nhóm lớn terpenoid 1.1.2.1 Nhóm terpenoid: Các hợp chất thuộc nhóm terpenoid đa phần có nguồn gốc từ đường sinh tổng hợp isoprenoid, thực vật sử dụng hợp chất isoprene chứa carbon viên gạch để xây dựng nên hợp chất terpenoid chứa từ 10 carbon trở lên Các hợp chất phân loại theo số lượng carbon sau:  Monoterpene: 10C  Sesquiterpene: 15C  Diterpene: 20C  Steroid triterpene: 30C  Tetraterpene (carotenoid): 40C  Polyterpeneoid: [C5].n với n >8 Hợp chất tiêu biểu nhóm terpene quan tâm đến nhiều saponin 1.1.2.2 Nhóm hợp chất phenol: Là hợp chất có chứa nhân phenol, hợp chất thường tổng hợp từ đơn vị cấu trúc phenolalanine tyrosine (9C) Các hợp chất tiêu biểu thuộc nhóm lignin, tanin, flavonoid,… 1.1.2.3 Hợp chất chứa nitơ: Là hợp chất có chứa N cấu trúc, hầu hết chúng tổng hợp từ acid amin, gồm nhóm quan tâm đến nhiều alkaloid (Vinca alkaloid, Taxol, …) cyanogenic glycoside 1.1.3 Con đường sinh tổng hợp HCTN Trong q trình trao đổi chất thực vật, HCTN tổng hợp theo đường là: đường acid shikimic, đường acid malonic, đường acid mevalonic đường methylerythritol phosphate (MEP) hay gọi đường non-mevalonate Chương Một số kết nghiên cứu phương pháp ni cấy rễ tơ để thu nhận HCTN 3.1 Thu nhận resveratrol phương pháp ni cấy rễ tơ đậu phộng (Arachis hypogaea L) Resveratrol (trans-3, 5, 4'-trihydroxystilbene) dẫn xuất hợp chất stilbenoid tự nhiên có liên quan nhiều đến lợi ích sức khỏe người Resveratrol có nhiều dạng đồng phân, dạng trans- resveratrol thể có giá trị dược tính tốt (Hình 3.1) Resveratrol chất hóa học có giá trị cao, nhiều nghiên cứu chứng minh chúng có đặc tính kháng viêm, chống oxy hóa, chống lây nhiễm bệnh có hoạt tính đầy hứa hẹn việc chữa nhiều bệnh ung thư ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt ung thư tế bào ngồi sọ [16] Resveratrol có mặt nhiều lồi thực vật nho, đậu phộng, việt quất,… đậu phộng (Arachis hypogaea L) xem nguồn thu nhận resveratrol tốt Resveratrol thu nhận cách chiết từ trực tiếp từ thực vật, nhiên sản phẩm lại khơng thích hợp việc ứng dụng lĩnh vực thực phẩm hay dược phẩm hàm lượng tạp chất cao hàm lượng resveratrol dẫn xuất thu nhận thấp Để tạo sản phẩm giàu resveratrol có độ tinh cao, hệ thống ni cấy rễ tơ (Arachis hypogaea L) ứng dụng xác định hệ thống sản xuất sinh học resveratrol dẫn xuất Với hệ thống ni cấy rễ tơ tối ưu hóa đạt hàm lượng trans-resveratrol 98 g/mg chất chiết khơ mơi trường, chiếm 99% tổng số resveratrol sản xuất [7] Với rễ tơ Arachis hypogaea L chuyển gene giống A rhizogenes R1601 ni cấy điều kiện bình thường (khơng sử dụng biện pháp làm tăng hàm lượng hợp chất tổng hợp) lượng resveratrol tổng hợp cao 1.5 mg/g khối lượng khơ [16] Và hệ thống ni cấy bổ sung chất cảm ứng khả tiết sản phẩm ngồi mơi trường ni cấy rễ tơ tăng lên nhiều, dẫn đến hàm lượng resveratrol tăng lên gần 60 lần so với trường hợp khơng dùng chất cảm ứng Đặc điểm góp phần phát triển hệ thống ni cấy rễ tơ lên quy mơ ni cấy liên tục để thu nhận resveratrol hàm lượng cao liên tục 42 Hình 3.1: Cấu trúc hóa học dạng trans- cis- resveratrol hợp chất stilbenoid liên quan Hình 3.2: Rễ tơ Arachis hypogaea L ni cấy erlen để sản xuất resveratrol 3.1 Thu nhận plumbagin phương pháp ni cấy rễ tơ Plumbago indica (P rosea) Plumbagin (2-methoxy-5-hydroxy-1,4 naphthoquinone) hợp chất nathoquinone tạo chủ yếu từ rễ lồi Plumbago (thuộc họ Plumbaginaceae) Các lồi chủ yếu tổng hợp plumbagin bao gồm Plumbag indica (hay P rosea), P zeylanica, P europe Trong đó, lồi P indica nguồn tốt để thu nhận plumbagin Plumbagin có hoạt tính chống ung thư, kháng khuẩn kháng nấm, biết đến với ứng dụng chúng y học cổ truyền chữa bệnh sốt rét, trợ tim, chống bệnh ung thư,… Plumbagin tự nhiên thu nhận từ rễ trưởng thành Plumbago rosea lồi lại có đặc điểm phát triển chậm nên việc thu nhận hợp chất trực tiếp từ thực vật tự nhiên phải tốn nhiều thời gian sản lượng thu thấp Do nhà khoa học khảo sát nhiều phương pháp in vitro để sản xuất plumbagin ni cấy dịch treo tế bào, ni cấy mơ sẹo, ni cấy rễ bất định ni 43 cấy rễ tơ lồi Plumbago rosea số lồi khác Trong đó, phương pháp ni cấy rễ tơ thể hiệu cao với hàm lượng plumbagin thu gần cao hẳn so với hàm lượng chúng rễ ngun vẹn Theo kết từ nghiên cứu, hàm lượng plumbagin thu phương pháp ni cấy dịch treo tế bào P rosea vào khoảng 4.5 mg/g tế bào khơ với khối lượng sinh khối thu 8.2 g tế bào khơ/l [24] Hàm lượng plumbagin thu từ phương pháp ni cấy rễ bất định P rosea 0.129 ± 0.0139% khối lượng khơ, hàm lượng nhiều so với hàm lượng plumbagin có rễ P rosea ba năm tuổi (0.32 ± 0.026% khối lượng khơ), nhiên việc thu nhận từ rễ bất định xem hiệu thời gian để ni cấy rễ bất định ngắn nhiều so với thời gian trồng P rosea (khoảng 48 ngày) [25] Trong đó, hệ thống ni cấy rễ tơ lại thể ưu vượt trội với khả phát triển nhanh mơi trường ni cấy khơng cần bổ sung hormone thực vật cho hàm lượng plumbagin 7.8 mg/g sinh khối khơ, cao hẳn so với hệ thồng ni cấy Từ cho thấy hệ thống ni cấy rễ tơ P rosea có ý nghĩa lớn việc sản xuất plumbagin với suất cao thể tính khả thi việc áp dụng hệ thống ni cấy quy mơ lớn Một số nghiên cứu đưa kết khả thi việc tăng hàm lượng sinh khối rễ tơ P rosea hệ thống bioreactor có sục khí (khơng có cánh khuấy) Rễ tơ P rosea ni cấy bioreactor sau 20 ngày lượng sinh khối tăng lên khoảng 1.8 lần lượng plumbagin tính số gam sinh khối khơ khơng thay đổi nhiều [22] Và việc sử dụng chất cảm ứng xác định đem lại hiệu cao việc làm tăng khả tiết plumbagin từ rễ tơ vào mơi trường ni cấy, từ làm tăng hàm lượng plumbagin tổng Các chất cảm ứng sử dụng bao gồm chitosan, methyl jasmonate, muối vơ cơ, Trong đó, kết hợp chitosan (200mg/l) methyl jasmonate (80M) cho hiệu cảm ứng cao với lượng plumbagin tổng lên đến 11.96 ± 0.76 mg/g sinh khối khơ sau ngày cảm ứng thứ 7, cao gấp 2.3 lần so với trường hợp khơng sử dụng chất cảm ứng [22] Từ kết cho thấy phương pháp ni cấy rễ tơ P rosea có ưu cao thời gian sản lượng plumbagin thu so với phương pháp ni cấy in vitro khác 44 3.2 Thu nhận ginsenoside phương pháp ni cấy rễ tơ Panax ginseng Ginsenoside (một hỗn hợp saponin triterpenoid) thành phần có hoạt tính dược lý quan trọng rễ Panax ginseng Chúng sử dụng loại thuốc cổ truyền Trung Quốc, xem vị thuốc q đứng đầu loại dược liệu q Đơng y Hai nhóm lớn ginsenoside nhóm Rb Rg bắt nguồn từ cấu trúc 20(S) protopanaxadiol 20(S) protopanaxatriol Trong đó, nhóm Rb bao gồm ginsenoside Rb1, Rb2, Rc Rd, nhóm Rg bao gồm ginsenoside Re, Rf Rg1 (Hình 3.3) Hình 3.3: Cấu trúc chung ginsenoside [14] Do nhân sâm tự nhiên phát triển chậm hàm lượng ginsenoside tổng hợp khơng cao, nhiều nhà khoa học nghiên cứu việc sản xuất ginsenoside cách sử dụng hệ thống ni cấy mơ sẹo, ni cấy dịch treo tế bào ni cấy rễ nhân sâm Tuy nhiên, hiệu sản xuất ginsenoside thấp tốc độ phát triển hệ thống chậm Trong đó, cảm ứng tạo rễ tơ từ thân rễ P ginseng A rhizogenes thể thành cơng việc sản xuất ginsenoside [18, 37, 40] Nhiều nghiên cứu chứng minh rễ tơ chuyển gene tăng trưởng nhanh sản xuất hàm lượng ginsenoside cao nhiều so với rễ bình thường ni cấy mơi trường đòi hỏi phải có hormone thực vật [1] Từ ưu điểm vượt bậc rễ tơ việc sản xuất ginsenoside, hệ thống rễ tơ P ginseng phát triển mạnh quy mơ cơng nghiệp với thiết bị ni cấy bioreactor Do yếu tố thường có ảnh hưởng khác đến tăng trưởng sinh tổng hợp ginsenoside rễ tơ chúng thiết lập giá trị khác nhau, 45 nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu hàm lượng ginsenoside cao từ rễ tơ P ginseng đưa kết luận đề nghị việc tiến hành q trình ni cấy theo phương pháp ni cấy hai giai đoạn Giai đoạn đầu chủ yếu để tăng sinh khối giai đoạn sau chủ yếu tích lũy ginsenoside sau sinh khối đạt đến giá trị định Theo kết tổng hợp từ nghiên cứu, hai thơng số quan trọng việc thiết lập q trình ni cấy hai giai đoạn nồng độ sucrose thời điểm bổ sung chất cảm ứng Với nồng độ sucrose, rễ tơ P ginseng tăng sinh mạnh nồng độ sucrose 3-5%, hàm lượng ginsenoside đạt cao nồng độ sucrose 2% [8] Ở chế độ nhiệt độ ánh sáng khác rễ tơ thể ưu việc phát triển sinh khối việc tổng hợp ginsenoside khác Ở chế độ nhiệt độ 20 0C/13 0C ứng với chu kì ngày/đêm 16 h/10 h lượng sinh khối rễ tơ thu cao nhất, chế độ 25 0C/25 0C hàm lượng ginsenoside thu đạt cực đại [17] Tương tự, chế độ chiếu sáng, khả tăng sinh khối mạnh rễ tơ chúng ni điều kiện ánh sáng đỏ điều kiên tối; chế độ ánh sáng huỳnh quang khả tổng hợp ginsenoside rễ tơ P ginseng đạt hiệu cao [17] Từ kết cho thấy hệ thống ni cấy rễ tơ P ginseng bioreactor đạt hiệu tổng hợp ginsenoside cao thiết lập q trình ni cấy hai giai đoạn Giai đoạn đầu (giai đoạn tăng sinh khối), rễ tơ ni cấy điều kiện tối với hàm lượng sucrose 2% chế độ nhiệt độ 20 0C/13 0C (chu kì 16h/10h) Giai đoạn sau (giai đoạn tổng hợp ginsenoside), rễ tơ chiếu sáng ánh sáng huỳnh quang với nồng độ sucrose mơi trường ni cấy 3-5% nhiệt độ 25 0C Ngồi yếu tố việc bổ sung chất cảm ứng có ảnh hưởng mạnh đến khả sản xuất ginsenoside từ rễ tơ P ginseng khả phát triển rễ tơ Nhiều nghiên cứu tiến hành để khảo sát hiệu số chất cảm ứng lên hệ thống ni cấy rễ tơ P ginseng Một số chất cảm ứng nghiên cứu nhiều cho kết khả thi peptone, acid jasmonic catechin Trong đó, peptone thể khả cảm ứng tăng hàm lượng ginsenoside sử dụng nồng độ 300 mg/l catechin thể khả làm tăng sinh khối rễ tơ sử dụng nồng độ 100 mg/l [17] Cả hai chất cảm ứng bổ sung vào mơi trường ni cấy từ ban đầu Riêng chất cảm ứng acid jasmonic cho hiệu tốt việc làm tăng hàm lượng ginsenoside Hàm lượng ginsenoside (mg/g sinh khối khơ) tăng lên gấp lần hiệu suất sản xuất (mg/l) tăng lên lần acid jasmonic sử dụng nồng độ 46 mg/l [17] Và acid jasmonic đánh giá ức chế tăng trưởng rễ tơ, nên việc áp dụng chất cảm ứng cần phải kết hợp với phương pháp ni cấy hai giai đoạn mà chất cảm ứng bổ sung vào sau sinh khối đạt giá trị mong muốn Tóm lại, phương pháp ni cấy rễ tơ giải pháp xem cho hiệu tổng hợp ginsenoside cao nhất, đặc biệt kết hợp với phương pháp ni cấy hai giai đoạn sử dụng chất cảm ứng Tuy nhiên hạn chế việc nâng hệ thống ni cấy rễ tơ lên quy mơ lớn bioreactor đòi hỏi u cầu phức tạp so với việc thiết lập hệ thống bioreactor ni cấy dịch treo tế bào Hình 3.4: Sự sản xuất ginsenoside từ rễ tơ nhân sâm bioreactor (5 ÷ 20 l) quy mơ phòng thí nghiệm Hình 3.5: Hệ thống bioreactor (10,000 l) sử dụng ni cấy rễ tơ P ginseng quy mơ lớn 47 3.3 Thu nhận betalain phương pháp ni cấy rễ tơ Beta vulgaris Batalain sắc tố thực vật tan nước, gồm hai thành phần betacyanin betaxanthin, sử dụng rộng rãi chất màu thực phẩm Ngồi sắc tố đỏ, betalain sở hữu nhiều hoạt tính sinh học có giá trị khả chống oxy hóa, kháng viêm, chống khối u bảo vệ gan Hoạt tính sinh học betalain thể hiệu cao người chúng có khả tồn ổn định dày ruột người mà hoạt tính chống oxy hóa khơng đáng kể, điều làm tăng giá trị chúng với vai trò chất phụ gia thực phẩm an tồn Sự tăng hoạt tính oxy hóa betalain đánh giá phụ thuộc vào khả cho điện tử số lượng nhóm phenolic hydroxy có cấu trúc Nguồn betalain thương mại quan trọng chủ yếu dịch chiết đặc hay bột khơ từ rễ củ dền đỏ (Beta vulgaris spp.) trồng đồng ruộng Tuy nhiên, sản phẩm tạo từ đường có số đặc tính khơng mong muốn mùi vị khơng dễ chịu có mặt dẫn xuất geosmin pyrazine, lượng lớn lồi vi khuẩn đất lây nhiễm vào sản phẩm thực phẩm Ngồi ra, việc tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm khó khăn thay đổi khác điều kiện mơi trường Và việc ứng dụng hệ thống ni cấy thực vật in vitro để sản xuất betalain giải vấn đề hạn chế phương pháp thu nhận trực tiếp từ rễ củ dền đỏ Trong số phương pháp ni cấy in vitro việc sử dụng hệ thống ni cấy rễ tơ Beta vulgaris chuyển gene vi khuẩn A rhizogenes thể đặc tính đầy hứa hẹn Bên cạnh khả tổng hợp lượng betalain cao so với phương pháp chiết từ rễ ni cấy in vivo (Hình 3.6), hệ thống rễ tơ tổng hợp hợp chất betalain có hoạt tính sinh học cao ổn định Hoạt tính sinh học đánh giá chủ yếu qua hai thơng số hoạt tính “làm sạch” gốc tự DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) khả hấp phụ oxy hay peroxyl (ORAC) Kết nghiên cứu Vasil Georgiev (2010) cho thấy betalain hợp từ rễ tơ Beta vulgaris cv Detroit Dark Red cho giá trị DPPH ORAC cao nhiều so với betalain từ rễ bình thường (Hình 3.7, 3.8) [9] 48 Hình 3.6: Betalain có dịch chiết thu nhận từ rễ bình thường (1) hệ thống ni cấy rễ tơ (2) B vulgaris cv Detroit Dark Red Hình 3.7: Hoạt tính ức chế DPPH tự dịch chiết từ rễ bình thường (1) hệ thống ni cấy rễ tơ (2) B vulgaris cv Detroit Dark Red Hình 3.8: Giá trị ORAC chất chiết từ rễ bình thường (1) hệ thống ni cấy rễ tơ (2) B vulgaris cv Detroit Dark Red TE: đương lượng Trolox; DE: lượng chất chiết khơ Các nghiên cứu khả tổng hợp betalain từ rễ tơ Beta vulgaris cv Detroit Dark Red ni cấy bioreactor cho kết mong đợi, hàm lượng betalain thu cao nhiều đặc tính sinh học giữ ổn định Ở bioreactor dạng STR (Hình 3.9-1), sản lượng betalain thu nhận vào khoảng 10.06 mg/g sinh khối khơ Và cách áp dụng phương pháp fed-batch vào hệ thống ni cấy bioreactor dạng STR với chu kì cung cấp chất lượng betalain thu tăng lên đáng kể (gấp 10 lần) [9] Ở bioreactor phun dinh dưỡng dạng sương mù có kích thước bồn chứa 1.8 L (Hình 3.9-9), sau tuần ni cấy hàm lượng betalain thu 3.3 mg/g sinh khối khơ Đặc biệt bioreactor dạng ni cấy chìm có sục khí 49 (dạng cầu, dạng nón, dạng cột, dạng trống, dạng bầu) hàm lượng betalain thu cao (27 mg betacyanin/g sinh khối khơ) thiết bị dạng nón (Hình 3.9-3); thiết bị dạng cầu (Hình 3.9-4), hàm lượng betacyanin betaxanthin thu 20.8 11.3 mg/g sinh khối khơ Ở bioreactor dạng cột với hàm lượng oxy hòa tan kiểm sốt mơi trường tuần hồn liên tục qua cột hấp phụ oxy (Hình 3.9-8), lượng betalain thu 16.3 mg rễ tơ 8mg thu từ mơi trường ni cấy Ngồi ra, rễ tơ Beta vulgaris cv Detroit Dark Red nghiên cứu hệ thống bioreactor dạng chìm tạm thời-RITA® (Hình 3.9-2) với chế độ thời gian chìm 15 phút khoảng cách 60 phút Ở hệ thống hàm lượng betalain thu 18.8 mg/g sinh khối khơ [34] Từ kết cho thấy, rễ tơ Beta vulgaris tạo hàm lượng betalain cao, ổn định hoạt tính sinh học cao nhiều so với betalain thu nhận trực tiếp từ rễ Beta vulgaris Và việc ni cấy rễ tơ bioreactor cho kết tăng cao hàm lượng betalin thu mà hoạt tính ổn định, tạo thuận lợi cho việc sản xuất betalain quy mơ cơng nghiệp Hình 3.9: Các bioreactor sử dụng để ni rễ tơ Beta vulgaris cv Detroit Dark Red (1) STR; (2) thiết bị dạng chìm tạm thời RITA®; (3-7) thiết bị chìm có sục khí dạng nón, cầu, bầu, trống cột; (8) thiết bị dạng cột có điều khiển oxy hòa tan cột sục khí oxy; (9) thiết bị dạng phun sương mơi trường 50 Chương KẾT LUẬN Ni cấy rễ tơ phương pháp có tiềm lớn việc sản xuất hợp chất tự nhiên có giá trị cao Đa phần hệ thống ni cấy rễ tơ có khả tổng hợp lượng HCTN cao nhiều so với mẹ hệ thống ni cấy in vitro khác, chí tổng hợp nhiều hợp chất mà mẹ bình thường khơng tổng hợp thơng qua việc chuyển gene ngoại lai vào gene tế bào thực vật Ngồi ra, rễ tơ có ưu điểm bật khả phát triển nhanh, ổn định mơi trường khơng có chất điều hòa sinh trưởng thực vật số trường hợp có khả làm tăng hoạt tính sinh học có lợi HCTN Điều tạo nên thuận lợi lớn cho việc nâng hệ thống ni cấy rễ tơ lên quy mơ cơng nghiệp để sản xuất HCTN có giá trị với hiệu kinh tế cao Trong suốt q trình tạo nên hệ thống ni cấy rễ tơ từ khâu chọn mẫu thực vật giống A rhizogenes để cảm ứng tạo rễ tơ giai đoạn ni rễ tơ để sản xuất HCTN bioreactor, có nhiều yếu tố kiểm sốt điều khiển nhằm đến mục đích cuối tối ưu hóa lượng HCTN thu Ở khâu chuẩn bị, việc thực thí nghiệm để chọn giống A rhizogenes thích hợp cho q trình chuyển gene đối tượng thực vật cụ thể đóng vai trò quan trọng Chính phù hợp giống tế bào thực vật yếu tố tác động đến hiệu q trình chuyển gene tạo rễ tơ giai đoạn sau Còn q trình ni cấy dòng rễ tơ qua chọn lọc, có nhiều yếu tố tác động đến phát triển khả tổng hợp HCTN rễ tơ, đặc biệt chúng ni cấy bioreactor với thể tích sản xuất lớn Trong đó, thành phần mơi trường, hàm lượng oxy, mối quan hệ tổng hợp HCTN với giai đoạn phát triển rễ tơ yếu tố có tác động mạnh mẽ đến lượng HCTN thu nhận Do đó, việc thiết kế bioreactor có đặc tính riêng biệt cho phát triển rễ tơ bước lớn, góp phần giải phần lớn vấn đề cung cấp oxy, tiếp xúc rễ tơ với nguồn dinh dưỡng hay khả hấp thu dinh dưỡng rễ tơ Và việc áp dụng phương pháp ni cấy hai giai đoạn, ta tạo điều kiện tốt cho rễ tơ giai đoạn: phát triển sinh khối tổng hợp HCTN, góp phần làm tăng tích lũy HCTN với hàm lượng cao Ngồi ra, chiến lược có vai trò làm tăng hàm lượng HCTN hệ thống ni cấy rễ tơ cách đáng kể việc sử dụng chất cảm ứng sinh học phi sinh học, phương pháp áp dụng nhiều hệ thống ni cấy mơ, tế bào thực vật in vitro Tuy nhiên, hạn chế 51 việc nâng lên quy mơ lớn bioreactor dùng để ni cấy rễ tơ đòi hỏi phải có đặc tính phức tạp so với bioreactor ni cấy huyền phù tế bào, từ tạo nên trở ngại cho việc phát triển mạnh hệ thống rễ tơ quy mơ cơng nghiệp nguồn đầu tư thiết bị ban đầu lớn Những kết nghiên cứu khả thu nhận HCTN phương pháp ni cấy rễ tơ cho kết khả thi khơng phương diện sản lượng mà tạo giá trị chất lượng cho sản phẩm Từ đó, hệ thống ni cấy rễ tơ thể ưu điểm vượt bậc so với hệ thống ni cấy in vitro khác, cụ thể lĩnh vực dược phẩm thực phẩm 52 Tài liệu tham khảo [1] Anna Mallol, Rosa M Cusido´, Javier Palazo´n, Merce Bonfill, Carmen Morales, M Teresa Pin˜ ol (2001) Ginsenoside production in different phenotypes of Panax ginseng transformed roots Phytochemistry, 57, 365–371 [2] Archana Giri, M Lakshmi Narasu (2000) Transgenic hairy roots: recent trends and applications Biotechnology Advances, 18, 1–22 [3] C Neal Stewart, Jr (2008) Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and Applications John Wiley & Sons, Inc., 402 [4] E Lambert, A Goossens, B Panis, M C Van Labeke, D Geelen (2009) Cryopreservation of hairy root cultures of Maesa lanceolata and Medicago truncatula Plant Cell Tiss Organ Cult, 96:289–296 [5] F Bourgaud , A Gravot, S Milesi, E Gontier (2001) Production of plant secondary metabolites: a historical perspective Plant Science, 161, 839–851 [6] Fabricio Medina-Bolivar , Jose Condori, Agnes M Rimando, John Hubstenberger ,Kristen Shelton, Sean F O Keefe, Selester Bennett, Maureen C Dolan (2007) Production and secretion of resveratrol in hairy root cultures of peanut Phytochemistry, 68, 1992–2003 [7] Fabricio Medina-Bolivar, Jose Condori, Agnes M Rimando, John Hubstenberger, Kristen Shelton, Sean F O’Keefe, Selester Bennett, Maureen C Dolan (2007) Production and secretion of resveratrol in hairy root cultures of peanut Phytochemistry, 68, 1992–2003 [8] G Sivakumar, K W Yu, E J Hahn and K Y Paek (2005) Optimization of organic nutrients for ginseng hairy roots production in large-scale bioreactors Current Science, Vol 89, No 4, 25 [9] Georgiev M, Pavlov A, Bley Th (2006) Betalains by transformed Beta vulgaris roots in stirred tank bioreactor: batch and fed-batch processes FinMed 2006-2nd International conference on bioreactor technology in cell, tissue culture and biomedical applications Saariselka, Finland, 22–28 [10] Giri, S Banerjee, P S Ahuja, And C C Girp (1997) Production of Hairy Roots in Aconitum Heterophyllum Wall using Agrobacterium Rhizogenes In Vitro Cell Dev Biol Plant 33:280-284 53 [11] Hirata K, Goda S, Phunchindawan M, Du D, Ishio M, Sakai A, Miyamoto K (1998) Cryopreservation of horseradish hairy root cultures by encapsulation-dehydration J Ferment Bioeng, 86:418–420 doi:10.1016/S0922-338X(99)89017-5 [12] Hirata K, Mukai M, Goda S, Ishio-Kinugasa M, Yoshida K, Sakai A, Miyamoto K (2002) Cryopreservation of hairy root cultures of Vinca minor (L.) by encapsulation-dehydration Biotechnol Lett, 24:371–376 [13] Inomata S., Yokoyama M., Gozu Y., Shimizu T., Yanagi M (1993) Growth pattern and ginsenoside production of Agrobacterium-transformed Panax ginseng roots Plant Cell Rep., 12, 681–686 [14] Javier Palazón, Rosa M Cusidó, Mercedes Bonfill, Anna Mallol, Elisabet Moyano, Carmen Morales, M Teresa Piđol (2003) Elicitation of different Panax ginseng transformed root phenotypes for an improved ginsenoside production Plant Physiology and Biochemistry, 41, 1019–1025 [15] Je rey W Pollard and John M Walker (1990) Plant Cell and Tissue Culture Methods in Molecular Biology, Vol 6, 610 [16] Jong Se Kim, Sook Young Lee and Sang Un Park (2008) Resveratrol production in hairy root culture of peanut, Arachis hypogaea L transformed with different Agrobacterium rhizogenes strains African Journal of Biotechnology, Vol 7, 37883790 [17] Kee-Won Yuc, Hosakatte Niranjana Murthy, Eun-Joo Hahn, Kee-Yoeup Paek (2005) Ginsenoside production by hairy root cultures of Panax ginseng: influence of temperature and light quality Biochemical Engineering Journal, 23, 53–56 [18] Ko K.S., Noguchi H., Ebizuka Y., Sankawa U (1989) Oligoside production by hairy root cultures transformed by Ri plasmids Chem Pharm Bull., 37, 245–248 [19] M Gangopadhyay, D Sircar, A Mitra and S Bhattacharya (2008) Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin Biologia Plantarum, 52 (3): 533-537 [20] Mei-Liang Zhou & Xue-Mei Zhu & Ji-Rong Shao & Yi-Xiong Tang & Yan-Min Wu (2011) Production and metabolic engineering of bioactive substances in plant hairy root culture Appl Microbiol Biotechnol, 90, 1229–1239 54 [21] Milen I Georgiev & Atanas I Pavlov & Thomas Bley (2007) Hairy root type plant in vitro systems as sourcesn of bioactive substances Appl Microbiol Biotechnol, 74:1175–1185 [22] Moumita Gangopadhyay, Saikat Dewanjee, and Sabita Bhattacharya (2011) Enhanced plumbagin production in elicited Plumbago indica hairy root cultures Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol 111 No 6, 706–710 [23] Nadia N Ono, Li Tian (2011) The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities Plant Science, 180, 439–446 [24] P Komaraiah, P.B Kavi Kishor & S.V Ramakrishna (2001) Production of plumbagin from cell cultures of Plumbago rosea L Biotechnology Letters, 23: 1269–1272 [25] Panichayupakaranant P., Tewtrakul S (2002) Plumbagin productionby root cultures of Plumbago rosea Electronic J Biotechnol, 5: 1-5 [26] R Verpoorte and A W Alfermann (2000) Metabolic Engineering of Plant Secondary Metabolism Kluwer Academic Publishers, 297 [27] Rajest Arora (2010) Medicinal Plant Biotechnology CAB International, 387 [28] S Duttagupta, Yasuomi Ibaraki (2008) Plant Tissue Culture Engineering Springer, 485 [29] Sheela Chandra, Ramesh Chandra (2011) Engineering secondary metabolite production in hairy roots Phytochem Rev, DOI 10.1007/s11101-011-9210-8 [30] Sheng-Hui Xue, Xin-Juan Luo, Zhen-Hua Wu, Hui-Li Zhang, Xin-Yu Wang (2008) Cold storage and cryopreservation of hairy root cultures of medicinal plant Eruca sativa Mill., Astragalus membranaceus and Gentiana macrophylla Pall Plant Cell Tiss Organ Cult, 92:251–260 [31] Teoh KH, Weathers PJ, Cheetham RD, Walcerz DB (1996) Cryopreservation of transformed (hairy) roots of Artemisia annua Cryobiology, 33:106–117 doi:10.1006/cryo.1996.0011 [32] Touno K, Yoshimatsu K, Shimomura K (2006) Characteristics of Atropa belladonna hairy roots cryopreserved by vitrification method Cryo Letters 27:65– 72 [33] Vasil Georgiev Georgiev & Jost Weber & Eva-Maria Kneschke & Petko Nedyalkov Denev & Thomas Bley & Atanas Ivanov Pavlov (2010) Antioxidant Activity and 55 Phenolic Content of Betalain Extracts from Intact Plants and Hairy Root Cultures of the Red Beetroot Beta vulgaris cv Detroit Dark Red Plant Foods Hum Nutr, 65, 105–111 [34] Vasil Georgiev, Mladenka Ilieva, Thomas Bley, Atanas Pavlov (2008) Betalain production in plant in vitro systems Acta Physiol Plant, 30, 581–593 [35] Vilas P Sinkar, Frank F White, And Milton P Gordon (1987) Molecular Biology of Ri-Plasmid—A Review, J Biosci, Vol 11, Numbers 1–4, 47–57 [36] Vilas P Sinkar, Frank F White, And Milton P Gordon (1987) Molecular Biology of Ri-Plasmid—A Review, J Biosci Vol 11, Numbers 1–4, 47–57 [37] Washida D., Shimomura K., Nakajima Y., Takido M., Kitanaka S (1998) Ginsenosides in hairy roots of a Panax hybrid Phytochemistry, 49, 2331–2335 [38] Yoojeong Kim, Barbara E Wyslouzil1, and Pamela J Weathers (2002) Invited Review: Secondary Metabolism of Hairy Root Cultures in Bioreactors In Vitro Cell Dev Biol.-Plant, 38, 1–10 [39] Yoshihiro Mano, Hideo Ohkawa And Yasuyuki Yamada (1989) Production of Tropane Alkaloids by Hairy Root Cultures of Duboisia Leichhardtii Transformed by Agrobacterium Rhizogenes Plant Science, 59, 191-201 [40] Yoshikawa T., Furuya T (1987) Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes Plant Cell Rep., 6, 449–453 [41] Yoshimatsu K (2000) Cryopreservation of medicinal plant resources: retention of biosynthetic capabilities in transformed cultures In: FaT Engelmann H (ed) Cryopreservation of tropical germplasm Current research progress and application JIRCAS, Rome, 77–90 [42] Yoshimatsu K, Yamaguchi H, Shimomura K (1996) Traits of Panax ginseng hairy roots after cold storage and cryopreservation Plant Cell Rep, 15:555–560 doi:10.1007/BF00232452 [43] Zhi-Bi Hu and Min Du (2006) Hairy Root and Its Application in Plant Genetic Engineering Journal of Integrative Plant Biology, 48 (2): 121−127 56