VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT NGUỒN GỐC VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE NGOẠI BÀO HOẠT TÍNH CAO DÙNG ĐỂ TÁCH CHIẾT HYALURONIC ACID TỪ SỤN CÁ NHÁM(CARCHARHINUS SORAH) Người hướng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC Sv thực : KHỔNG THỊ KHÁNH LINH Lớp : 12-01 HÀ NỘI- 2016 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT NGUỒN GỐC VIỆT NAM CĨ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE NGOẠI BÀO HOẠT TÍNH CAO DÙNG ĐỂ TÁCH CHIẾT HYALURONIC ACID TỪ SỤN CÁ NHÁM(CARCHARHINUS SORAH) Người hướng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC Sv thực : KHỔNG THỊ KHÁNH LINH Lớp : 12-01 HÀ NỘI- 2016 Khổng Thị Khánh Linh 1201 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hồn thành khóa luận em bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS.Võ Hồi Bắc, người truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu, cô quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn suốt trình em thực tập Qua em xin chân thành cảm ơn tồn thể cán phịng Sinh hóa Thực vật- Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cho phép tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập phòng nghiên cưú Em chân thành cảm ơn Ban giám hiệu thầy cô trường Viện đại mở Hà Nội, đặc biệt quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh họcViện đại học Mở Hà Nội tận tình truyền đạt cho em kiến thức quý báu năm em học tập trường Với vốn kiến thức tiếp thu trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang q báu để em bước vào đời cách vững tự tin Cuối em xin kính chúc q Thầy, Cơ dồi sức khỏe đạt nhiều thành công nghiệp cao quý Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2016 Sinh viên Khổng Thị Khánh Linh Khổng Thị Khánh Linh 1201 Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 PROTEASE VÀ ứNG DụNG TRONG THựC TIễN 1.1.1 Định nghĩa Protease 1.1.2 Phân loại Protease 1.1.3 Ứng dụng protease thực tiễn (Đặng Thị Thu, 2012) 1.2 GIớI THIệU TổNG QUAN Về HYALURONIC ACID 1.2.1 Khái niệm Hyaluronic acid 1.2.2 Vai trò Hyaluronic acid 1.3 MộT Số NGHIÊN CứU Về HYALURONIC ACID 1.3.1 Nghiên cứu HA giới 1.3.2 Nghiên cứu HA Việt Nam 11 1.4 ỨNG DụNG CủA HYALURONIC ACID 11 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIếT VÀ XÁC ĐịNH HA 13 1.5.1 Tách chiết HA 13 1.5.2 Xác định HA 14 1.6 GIớI THIệU NGUồN NGUYÊN LIệU SụN 14 1.6.1 Sụn động vật 14 1.6.2 Sụn cá nhám 16 PHẦN II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 NGUYÊN VậT LIệU 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CấY CÁC CHủNG VI SINH VậT 18 Khổng Thị Khánh Linh 1201 Khóa luận tốt nghiệp 2.3 XÁC ĐịNH HOạT Độ PROTEASE BằNG KHUếCH TÁN TRÊN ĐĨA THạCH CÓ CHứA CƠ CHấT THEO LELUK VÀ CộNG Sự 19 2.4 XÁC ĐịNH HOạT Độ PROTEASE THEO PHƯƠNG PHÁP ANSON CảI TIếN 20 2.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐịNH ĐIềU KIệN TốI ƯU CHO HOạT ĐộNG CủA PROTEASE NGOạI BÀO SÀNG LọC ĐƯợC 22 2.5.1 Xác định nhiệt độ thủy phân tối ưu 22 2.5.2 Xác định pH tối ưu 23 2.5.3 Xác định thời gian thủy phân tối ưu 23 2.5.4 Xác định nồng độ enzyme thủy phân tối ưu 23 2.6 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐịNH ĐIềU KIệN TốI ƯU CHO SINH TRƯởNG VÀ TIếT PROTEASE NGOạI BÀO CủA CHủNG B-510 24 2.6.1 Khảo sát môi trường ni cấy thích hợp sinh protease ngoại bào chủng B510 24 2.6.2 Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu 24 2.6.3 Xác định pH nuôi cấy tối ưu 25 2.6.4 Xác định thời gian nuôi cấy tối ưu 25 2.7 ĐịNH LƯợNG HA: XÁC ĐịNH GốC N-ACETYL-DGLUCOSAMINE CủA HA THEO PHƯƠNG PHÁP REISSING 25 2.8 XÁC ĐịNH HÀM LƯợNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY 27 2.9 PHƯƠNG PHÁP SING HọC TÁCH CHIếT HA 28 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 SÀNG LọC CÁC CHủNG VI SINH VạT SINH ENZYME PROTEASE NGOạI BÀO HOạT TÍNH CAO 29 3.2 KHảO SÁT ĐIềU KIệN THÍCH HợP CHO SINH TRƯởNG VÀ TIếT PROTEASE NGOạI BÀO CủA CHủNG B-510 32 3.2.1 Khảo sát môi trường thích hợp sản sinh protease 32 3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu 33 Khổng Thị Khánh Linh 1201 Khóa luận tốt nghiệp 3.2.3 pH ni cấy tối ưu 34 3.2.4 Thời gian nuôi cấy tối ưu 35 3.3 ẢNH HƯởNG CủA CÁC ĐIềU KIệN PHảN ứNG TớI HOạT Độ CủA PROTEASE NGOạI BÀO Từ CHủNG VI KHUẩN B-510 35 3.3.1 Ảnh hưởng pH 36 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 37 3.3.3 Xác định thời gian tối ưu thủy phân sụn cá protease từ chủng B-510 37 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ protease lên trình thủy phân sụn cá 38 3.4 SƠ Đồ THU PROTEASE NGOạI BÀO VÀ CÁC ĐIềU KIệN TốI ƯU THủY PHÂN SụN CÁ NHÁM CủA PROTEASE NGOạI BÀO Từ CHủNG B-510 39 3.5 SO SÁNH HÀM LƯợNG HA CHIếT RÚT KHI Sử DụNG PROTEASE KHÁC NHAU 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Khổng Thị Khánh Linh 1201 Khóa luận tốt nghiệp A660 Độ hấp phụ bước sóng 660nm A750 Độ hấp phụở bước sóng 750nm BSA Albumin huyết bò CN Cá nhám GAG Glycosaminoglycan GalNAc N-acetyl-D-galactosamine OD Optical Density PG Proteoglycan TCA Tricloacetic acid UV Ultraviolet HA Hyaluronic acid DMAB Dimetylamin benzaldehyde CPC Cetylpyridium chloride CTAB Cetyltrimethylamnonium bromide Khổng Thị Khánh Linh 1201 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Hyaluronic acid từ số nguồn nguyên liệu 10 Bảng 1.2: Thành phần mơ sụn 15 Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật 17 Bảng 2.2 Môi trường sử dụng thí nghiệm 18 Bảng 2.3: Xác định đường cong chuẩn tyrosine 21 Bảng 2.4: Xây dựng đường cong chuẩn HA 27 Bảng 3.1: Hoạt tính protease ngoại bào chủng vi sinh vật nghiên cứu 30 Bảng 3.2 Hoạt tính protease chủng Bio2, B26, B-510 31 Bảng 3.3: Khả sinh trưởng tiết protease ngoại bào chủng B510 nuôi môi trường khác 32 Bảng 3.4: Hàm lượng HA hòa tan sau sử dụng protease khác 40 Khổng Thị Khánh Linh 1201 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc đơn phân đường đôi hyaluronic acid Hình 2.1: Phản ứng tạo màu N-acetyl-D-glucosamine DMAB 26 Hình 3.1 Hoạt tính protease chủng vi sinh vật Bio2, B26, B-510 Thể tích dịch ni vi sinh vật cho vào giếng là: 150µl; 1: Bio (25mm), 2: B26 (26mm); 3: B-510 (27mm) 31 Hình 3.2: Khả sinh trưởng (A) hoạt tính protease (B) chủng B510 nhiệt độ khác 33 Hình 3.3: Khả sinh trưởng (A) tiết protease chủng B510 (B) pH khác 34 Hình 3.4: Khả sinh trưởng(A) tiết protease ngoại bào (B) chủng B-510 theo thời gian nuôi cấy 35 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease củachủng B-510 36 Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính protease chủng B-510 37 Hình 3.7: Ảnh hưởng thời gian thủy phân sụn cá đến hiệu thu nhận HA 38 Hình 3.8: Ảnh hưởng nồng độ protease chủng B-510 lên trình thủy phân xương sụn cá nhám 38 Hình 3.9: Khả thủy phân sụn cá nhám protease khác 40 Hình 3.10: Hàm lượng HA từ dịch thủy phân sụn cá nhám sau sử dụng cácprotease khác 41 MỞ ĐẦU Thủy sản, việc cung cấp thực phẩm cho người nguồn dược liệu tự nhiên quý như: iốt chống biếu cổ từ rong mơ, vitamin A từ dầu cá, guanine từ vây cá Đặc biệt, nhiều dược liệu quý chiết xuất từ phế thải nhà máy chế biến thuỷ sản Các nghiên cứu giới cho thấy nguyên liệu từ sụn cá (Murado et al, 2012) có thành phần hyaluronic acid (HA) HA polymer tự nhiên mạch thẳng thuộc nhóm glycosaminoglycan (GAG), khơng chứa nhóm sulfat , cấu tạo hai đơn vị N-acetylglucosamine glucuronic ạcid xen kẽ liên kết với liên kết β(1-3) β (1-4) glycosidic Trong năm gần đây, HA sử dụng rộng rãi loại chế phẩm bổ sung dinh dưỡng ngày mở rộng ứng dụng hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh Hiện Việt Nam nhập thuốc chứa thành phần HA để điều trị bệnh viêm khớp, chống lão hóa, xóa nếp nhăn làm đẹp da (Duovital CHLB Đức, Havital-HA drink Thụy Sỹ với giá thành cao), chưa có đơn vị nước sản xuất HA để phục vụ Y dược Nghiên cứu trước xác định sụn cá nhám (Carcharhinus sorrah) Việt Nam chứa hàm lượng cao HA Hàm lượng HA từ sụn cá nhám không cao nguồn nguyên liệu từ mào gà hay vi khuẩn, việc nghiên cứu tận thu HA từ phế thải sụn cá từ nhà máy chế biến thủy sản Việt Nam giải vấn đề nhiễm mơi trường mà cịn làm tăng giá trị thủy sản Trong trình chiết rút HA từ sụn động vật, việc sử dụng protease thay chất hóa học nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng giảm độ độc hại chất hóa học sản xuất tăng chất lượng chế phẩm HA 3.2.4 Thời gian nuôi cấy tối ưu Thời gian nuôi cấy nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng khả sinh enzym chủng vi khuẩn Trong q trình ni cấy xác định hoạt tính protease chủng B510 theo dõi mốc thời gian sau: OD (620 nm) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 A B Hoạt tính protease(% tương đối) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Thời gian (giờ) 120 100 80 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Thời gian (giờ) Hình 3.4: Khả sinh trưởng(A) tiết protease ngoại bào (B) chủng B-510 theo thời gian nuôi cấy Kết hình 3.4cho thấy chủng B-510 sau 72 ni cấy tiết protease ngoại bào mạnh 3.3 ẢNH HƯởNG CủA CÁC ĐIềU KIệN PHảN ứNG TớI HOạT Độ CủA PROTEASE NGOạI BÀO Từ CHủNG VI KHUẩN B-510 Khả hoạt động enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzyme tối thích cho phản ứng 3.3.1 Ảnh hưởng pH Để nghiên cứu ảnh hưởng pH lên hoạt độ protease, phản ứng enzyme thực thời gian, nhiệt độ 40ºC đệm Naacetat (pH: 4,5; 5,5) đệm phosphate (pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5) Kết hình 3.5 cho thấy protease ngọai bào chủng B-510 có hoạt tính cao pH 7,5 Như protease chủng B-510 hoạt động mạnh vùng pH kiềm yếu Hoạt tính tương đối (%) 120 100 80 60 40 20 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 pH Hình 3.5: Ảnhhưởng pH đến hoạt tính protease củachủng B-510 Các vi khuẩn thường tổng hợp protease hoạt động thích hợp vùng pH trung tính kiềm yếu Các protease kiềm biết đến protease Bacillus pumilus, B amyloliquifaciens, B licheniformis and B Subtilis (Rao , 1998).Các protease kiềm vi sinh vật ứng dụng nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, tẩy trùng, thuộc da…(Gupta , 2002) 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme Chúng sử dụng pH tối thích khảo sát cho phản ứng enzyme thay đổi nhiệt độ phản ứng thuỷ phân từ 3080°C 120 Hoạt tính tương đối (%) 100 80 60 40 20 30 40 50 60 70 Nhiệt độ (độ C) Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính protease chủng B510 Kết hình 3.6 cho thấy protease chủng B-510 có hoạt độ cao 50°C 3.3.3 Xác định thời gian tối ưu thủy phân sụn cá protease từ chủng B-510 Hàm lượng HA (% tương đối) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 1h 4h 8h 12h 18h 24h Thời gian (giờ) Hình 3.7: Ảnh hưởng thời gian thủy phân sụn cá đến hiệu thu nhận HA Kết hình 3.7cho thấy thời gian tối ưu cho việc thủy phân sụn cá nhám giải phóng HA 18giờ thủy phân 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ protease lên trình thủy phân sụn cá Hàm lượng HA (% tương đối) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0,25 0,5 0,75 Nồng độ (IU/10g sụn) Hình 3.8: Ảnh hưởng nồng độ protease chủng B-510 lên trình thủy phân xương sụn cá nhám Kết hình 3.8 cho thấy hoạt tính thủy phân sụn cá protease ngoại bào từ chủng B510 cao với tỷ lệ 0,5 IU dịch enzyme/10gam sụn(enzyme có hoạt độ là: 0,25 IU/ml enzyme) điều kiện pH (8,5), nhiệt độ tối ưu (50°C) thời gian thủy phân 18giờ 3.4 SƠ Đồ THU PROTEASE NGOạI BÀO VÀ CÁC ĐIềU KIệN TốI ƯU THủY PHÂN SụN CÁ NHÁM CủA PROTEASE NGOạI BÀO Từ CHủNG B-510 Nuôi cấy chủng B-510 Điều kiện nuôi cấy - Thành phần môi trường: (Bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit) - Điều kiện nuôi cấy:32° °C, 72 giờ, pH=7 Ly tâm, tách chiết Chế phẩm enzyme thô (0,25UI/ml) Thủy phân Xương sụn cá (cắt nhỏ) Điều kiện thủy phân pH: 8,5; 50°°C; 18giờ; tỷ lệ: 0,5IUenzym/10g sụn Dịch thủy phân chứa HA 39 3.5.SO SÁNH HÀM LƯợNG HA CHIếT RÚT KHI Sử DụNG PROTEASE KHÁC NHAU Chúng so sánh khả thủy phân chiết rút HA sụn cá nhám chế phẩm ENV (hãng Novozyme) với điều kiện tối ưu(18 giờ; pH 6,0; 60oC) theo nghiên cứu (Võ Hoài Bắc, 2016), thủy phân papain theo nghiên cứu (Garnjanagoonchorn et al., 2007) protease ngoại bào vi khuẩn Bacillus subtilisB-510 mà nghiên cứu Bảng 3.4: Hàm lượng HA hòa tan sau sử dụng protease khác Protease Papain (200mg/10g sụn), 65 ºC; pH7,0 ENV(413 µl ENV/10g sụn tươi, 18 giờ; pH 6,0; 60oC) Protease ngoại bào Bacillus subtilis B-510 (0,5 IU/10g sụn), 50 ºC, pH 8,5 % HA dịch sau thủy phân/ g sụn tươi % Hàm lượng tyrosin giải phóng tối đa 1,5 ± 0,27 95,7 ± 3,5 1,6 ± 0,25 100,0 ± 4,2 1,5 ± 0,21 93,0 ± 3,1 Sau thủy phân Trước thủy phân Papain ENV B510 Papain ENV B510 Hình 3.9: Khả thủy phân sụn cá nhám protease khác Hình 3.10: Hàm lượng HA từ dịch thủy phân sụn cá nhám sau sử dụng cácprotease khác Chú thích: 1,Sử dụng papain; 2, Sử dụng ENV; 3, Sử dụng protease ngoại bào B510; 4,Đối chứng âm Kết (bảng 3.4; hình 3.9 hình 3.10) cho thấy protease ngoại bào chủng Bacillus subtilisB510 có hiệu thủy phânsụn chiết xuất HA gần sử dụng papain chế phẩm ENV hãng Novozym Vì nghiên cứu sử dụng protease ngoại bào từ chủng vi sinh nguồn gốc Việt Nam thay papain chế phẩm protease nhập ngoại hiệu nhằm hạ giá thành chủ động cho trình sản xuất HA KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Từ 15 chủng giống vi khuẩn có khả sinh enzym protease ngoại bào tuyển chọn chủng sinh protease có hoạt tính cao B26, Bio B510 Khảo sát điều kiện thích hợp cho sinh trưởng tiết protease ngoại bào chủng Bacillus subtilis B510: - Môi trường (Bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; Nước cất lít) - pH: - Nhiệt độ: 32ºC - Thời gian nuôi cấy: 72 Xác định số điều kiện phản ứng protease ngoại bào từ chủng vi khuẩn B510: - pH: 7,5 - Nhiệt độ: 50ºC - Thời gian: 18 - Nồng độ:0,5 IU dịch enzyme/10gam sụn(enzyme có hoạt độ là: 0,25 IU/ml enzyme) Protease ngoại bào chủng Bacillus subtilis B510có hiệu thủy phân sụn chiết xuất HA gần sử dụng papain chế phẩm ENV hãng Novozym, sử dụng thay enzyme thương mại trình tách chiết HA II KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu sản xuất protease ngoại bào từ chủng Bacillus subtilis B510 qui mô pilot 42 So sánh giá thành sử dụng protease bào với enzyme thương mại để tinh HA TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Thị Thu (2012).Công nghệ enzyme.NXB Khoa học : 233-299 Lê Ngọc Tú ( 2010) Hố sinh cơng nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật : 31 Lê Xuân Phương.(2001) Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến.(1998) Công nghệ enzyme, Nhà xuất nơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Phạm Võ Minh Thiện, Nguyễn Hoàng Khuê Tú, (2010).Phát hyaluronantừ số nguyên liệu tự nhiên Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3A): 685-691 Võ Hoài Bắc, Trần Thị Hồng, Nguyễn Thị Mai Phương, Lê văn Trường, (2016).Xác định hàm lượng hyaluronic acid số phế phụ liệu baloại cá nghiên cứu sử dụng enzyme để tách chiết Tạp chí Sinh học (đã chấp nhận đăng) Nước Abdelnasser S.S.I, Nefisa M.A EI-Shayeb and Sohair S M Isolation and Identification of Alkaline Protease Producing Alkaliphilic Bacteria from an Egyptian Soda Lake Journal of Applied Sciences Research.,(2007) 3(11): 1363-1368 Balazs, (27 February 1979) E.A Ultrapure Hyaluronic Acid and the Use Thereof U.S Patent 4,141,973, Cowman M.K, Matsuoka S., (2005).Experimental approaches to hyaluronan structure Carbohydrate Re-search, 340: 791–809 43 Cullis-Hill, D, (1989).Preparation of hyaluronic acid from synovial fluid U.S Pat Nº 4,879,375 Chain, E., and Duthie, E., Rrit J Exp Path., (1940) 21, 324 Chien LJ, Lee CK, (2007).Hyaluronic acid production by recombinant Lactococcus lactis Appl Microbiol Biotechnol, 77:339346 Chong FB, Blank LM, Mclaaughlin R, Nielsen LK, (2005), Microbial hyaluronic acid production Appl Microbiol Biotechnol, 66:341-351 E Yu Ignatova, A N Gurov, (March 1990).Principles of extraction and purification of hyaluronic acid (review) Pharmaceutical Chemistry Journal, Volume 24, Issue 3, pp: 211-216 Fong Chong B, Nielsen LK, (2003).Aerobic cultivation of Streptococcus zooepidemicus and the role of NADH oxidase Biochem Eng J, 16:153-162 10 Garnjanagoonchorn W, Wongekalak L, Engkagul A., (2007) Determination of chondroitin sulfate from different sources of cartilage Chemical Engineering and Processing 46: 465-471 11 Gupta R., Beg Q.K., Lorenz P., (2002) Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications Appl Microbiol Biotechnol.59(1):15-32 12 Hascall V.C., (1988).Proteoglycans: The chondroitin sulfate/keratin sulfate proteoglycan of cartilage Institute for Scientific Information Atlas of Science, Biochemistry Institute for Scientific Information, Philadelphia, PA (1): 189-198 13 Heldin P, (2003) Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in celldifferentiation and tumour formation Braz J Med Biol Res 36(8): 967-73 44 14 Izawa N, Hanamizu T, Iizuka R, Sone T, Mizukoshi H, Kimura K, Chiba K., (2009 exopolysaccharides Feb).Streptococcus including thermophilus hyaluronic acid produces J Biosci Bioeng.;107(2):119-23 15 José Antonio Vázquez , Isabel Rodríguez-Amado 1, María Ignacia Montemayor , Javier Fraguas , María del Pilar González and Miguel Anxo Murado, (2013).Chondroitin Sulfate, Hyaluronic Acid and Chitin/Chitosan Production Using Marine Waste Sources: Characteristics, Applications and Eco-Friendly Processes, A Review Mar Drugs, 11: 747-774 16 Juhlin L, (1997).Hyaluronan in skin, J Intern Med 242 (1): 61-66 17 Knudson W, Chow G, Knudson CB, (2002 Jan).CD44-mediated uptake and degradation of hyaluronan Matrix Biol;21(1):15-23 18 Krahulec J, Krahulcova J, (2006).Increase in hyaluronic acid production by Streptococcus equi subsp zooepidemicus strain deficient in betaglucuronidase in laboratory conditions Appl Microbiol Biotechnol, 71:415-422 19 L.S Lohmander, S De Luca, B Nilsson, V.C Hascall, C.B Caputo, J.H.Kimura, D Heinegard Oligosaccharides on proteoglycans from the swarm rat chondrosarcom., J Biol Chem 255 (13), (1980): 6084– 6091 20 Leluk J, Pham Tran Chau, Kieleczawa XXI Meet Pol Biochem Soc., Krakov, Abstract, (1885) p: 139 21 Lowry O.H, Rose Bough N.J, Farr A.L and Andall R.J Protein measurement ưith the folin fenol reagent.J Biochem 193., (1951): 265-270 22 Lyon M, and Gallagher JT, (1998) Bio-specific sequences and domains in heparan sulphate and the regulation of cell growth and adhesion Matrix Biol 17: 485-493 45 23 Lyon M, and Gallagher JT, (1998) Bio-specific sequences and domains in heparan sulphate and the regulation of cell growth and adhesion Matrix Biol 17: 485-493 24 Mansour, M.B., H Majdoub, I Bataille, M.S Roudesli, M Hassine, N Ajzenberg, F Chaubet and R.M Maaroufi, (2009).Polysaccharides from the skin of the ray Raja radula Partial characterization and anticoagulant activity Thrombosis Research, 123: 671-678 25 Mao Z, Chen RR,(2007).Recombinant synthesis of hyaluronan by Agrobacterium sp Biotechnol Prog, 23:1038-1042 26 Meyer K, Palmer J, (1934).The polysaccharide of the vitreous humor J Biol Chem 107: 629-634 27 Meyer, K., and Chaffee, E., J Biol Chem., (1941) 136-141 28 Murado, M.A., Montemayor, M.I., Cabo, M.L., Vázquez, J.A., González, M.P., (2012).Optimization of extraction and purification process of hyaluronic acid from fish eyeball Food Bioprod Proc, 90: 491–498 29 Nakano T, Ikawa N and Ozimek L, (1994).Extraction of Glycosaminoglycans from Chicken Eggshell Poultry Science; 80: 681684 30 O’Regan, M.; Martini, I.; Crescenzi, F.; de Luca, C.; Lansing, M Molecula, (1994).mechanisms and genetics of hyaluronan biosynthesis Int J Biol Macromol., 16: 283–286 31 Pat, (1974) 2333184 , FRG; Chem Abstr., 81, No 4210, (1974) 32 Pat, (1975) 88291 , Jpn., Chem Abstr., 84, No 15711 33 Pat, (1976) 95116, Jpn.; Chem Abstr., 85, No 156941 34 Prescott AL,(2003).Method for purifying high molecular weight hyaluronic acid USP 6660853 35 Reig F B., (1992) Separation and indentification of sugars and maltodextrines by thin layer chromatography: Application to 46 biological fluids and humen milk Talanfa, Vol 39, No 11, pp: 14931498 36 Reissig J.L, Jack L.Strominger and Luis., (1955) A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars J Biol Chem., 217:959-966 37 Rodén, L., J.R Baker, A Cifonelli and M.B Mathews Isolation and characterization of connective tissue polysaccharides Methods in Enzymology 53A., (1972): 69-82 38 Selleck SB., (2000) Proteoglycans and pattern formation: sugar biochemistry meets developmental genetics Trends Genet: 206-212 39 Selleck SB., (2000) Proteoglycans and pattern formation: sugar biochemistry meets developmental genetics Trends Genet: 206-212 40 Shankar K, Muthuvel A, Sadhasivam G, Thangavel.B., (2013) Isolation, characterizationand antioxidantactivity of hyaluronicacid 41 Sharmin, Md Towhid Hossain and M.N Anwar Isolation and Characterization of a Protease Producing Bacteria Bacillus amovivorus and Optimization of Some Factors of Culture Conditions for Protease Production Journal of Biological Sciences 5.,(2005) (3): 358-362 42 Shiedlin A, Bigelow R, Christopher W, Arbabi S, Yang L, Maier RV, Wainwright N, Childs A, Miller RJ, (2004) Evaluation of hyaluronan from different sources: Streptococcus zooepidemicus, rooster comb, bovine vitreous, and human umbilical cord 5(6):2122-7 43 Sikder K., Das A.Isolation and characterization of glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) from the skin of the fish Labeo rohita Carbohydr Res., (1979) 71: 273–285 44 Stern R,(2005).Hyaluronan metabolism: a major paradox in cancer biology Pathol Biol 53(7): 372-382 47 45 Swann, D.A., (1968) Studies on hyaluronic acid: The preparation and properties of rooster comb hyaluronic acid Biochim Biophys Acta, 156: 17–30 46 Timothy E Hardingham and Helen Muir, ( 1970 June).Hyaluronic acid in cartilage and proteoglycan aggregation Biochem J; 139(3): 565–581 47 Turnbull J, Powell A, and Guimond S., (2001) Heparan sulfate: decoding a 0dynamic multifunctional cell regulator Trends Cell Biol (11): 75-82 48 Vynios DH, Aletras A, Tsiganos CP, Tsegenidis T, Antonopoulos CA, Hjerpe A, Engfeld B., (1985).Proteoglycans from squid cranial cartilage extraction and characterization, Comp Biochem Physiol 80B 4: 761-766 49 Widner B, Behr R, Von Dollen S, (2005).Hyaluronic acid production in Bacillus subtilis Appl Environ Microbiol, 71:3747-3752 50 Yu HM, Stephanopoulos G, (2008).Metabolic engineering of Escherichia coli for biosynthesis of hyaluronic acid Metabolic Eng, 10:24-32 51 Zhao Yuhong, (2008) Preparation and identifi cation of Hyaluronic Acid From Fresh Pigskin Journal of Northeast Agricultural University, Vol 15No.3:44-49 Trang web: http://www.appliedhealth.com/ABC_News_HA.html http://wikipedia.Cartilage http://BME/ME 456 Biomechanics http://wikipedia.Chondroitin Sulfate http://ccbolgroup.com/hierbas2E.html 48 PHỤ LỤC y = 1.4051x + 0.026 R2 = 0.9937 0.8 A 750nm 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nồng độ Tyrosine (umol/ml) Hình 1: Đồ thị đường chuẩn tyrosine, xây dựng điểm với nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 µmol/ml, độ xác 0,9937 OD (585nm) 0.4 y = 0.69x + 0.003 R² = 0.996 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Hình 2: Phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn HA 0.6 HA