VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI : TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTORBIỂU HIỆN NHÓM GENE doxA VÀ dnrV THAM GIA ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP DOXORUBICIN TRONG XẠ KHUẨNSTREPTOMYCES LIVIDANS TK24 Giáoviênhướngdẫn: TS Tạ Thị Thu Thủy Th.S Nguyễn Thành Chung Sinh viên thực hiện: Mai Thị Lan Anh Lớp : CNSH - 12.02 HàNội - 2016 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo công tác khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tạo điều kiện cho chúng em học tập môi trường khoa học hoàn thiện Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy ThS Nguyễn Thành Chung- người dành nhiều thời gian tâm huyết đinh hướng nghiên cứu, giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo - Kỹ sư công nghệ sinh học nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực tập hoàn thành đề tài nghiên cứu Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, toàn thể bạn phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Trong trình nghiên cứu đề tài, thân em có nhiều cố gắng,nhưng tránh khỏi thiếu sót, hạn chế nên em mong nhận góp ý quý thầy – cô để khóa luận em đầy đủ hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh viên Mai Thị Lan Anh MAI THỊ LAN ANH – LỚP 12-02 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Lịch sử kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.2 Đại cương xạ khuẩn 10 1.2.1 Đặc điểm chung xạ khuẩn 10 1.2.2 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 10 1.3 Vật chủ biểu xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 12 1.4 Tổng quan kháng sinh Doxorubicin 12 1.4.1 Giới thiệu chung kháng sinh Doxorubicin 12 1.4.2 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin 13 1.4.3 Cấu trúc Doxorubicin 14 1.4.4 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin 15 1.4.5 Cơ chế hoạt động hoạt tính sinh học Doxorubicin 16 1.4.6 Ứng dụng thành tựu đạt nghiên cứu kháng sinh DXR 18 1.5 Giới thiệu chung gen doxA , dnrV 21 1.5.1 Giới thiệu chung gen doxA 21 1.5.2 Giới thiệu chung gen dnrV 23 1.5.3 Vai trò liên kết hỗ trợ doxA dnrV 23 1.6 Vector biểu pIBR25trong hệ xạ khuẩn 24 1.7 Mục tiêu nội dung đề tài 24 1.7.1 Mục tiêu đề tài 25 1.7.2 Nội dung đề tài 25 MAI THỊ LAN ANH – LỚP 12-02 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1.7.3Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 26 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường thiết bị 27 2.1.1 Vật liệu 27 2.1.2 Môi trường 29 2.1.3 Hóa chất 31 2.1.4 Thiết bị 33 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp thiết kế mồi 33 2.2.2 Phương pháp PCR 34 2.2.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số xạ khuẩn 37 2.2.4 Phương pháp điện di gel agarose 39 2.2.5 Phương pháp tinh ADN từ gel agarose 40 2.2.6 Phương pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn 41 2.2.7 Phương pháp nối ADN 42 2.2.8 Phương pháp cắt ADN enzyme giới hạn 43 2.2.9 Phương pháp chuyển gen sốc nhiệt 43 2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào Streptomyces lividansTK24 45 PHẦN : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Thiết kế mồi 47 3.2 Tách dòng gen doxA dnrV 47 3.2.1 Tách chiết ADN tổng số xạ khuẩn S.peucetius ATCC27952 47 3.2.2 Nhân gen doxA , dnrV phản ứng PCR 48 3.2.3 Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T.doxAV 51 3.3 Giải trình tự dự đoán chức gen qua genbank 54 3.3.1 Giải trình tự gen dự đoán chức doxA 54 3.3.2 Giải trình tự gen dự đoán chức dnrV 56 MAI THỊ LAN ANH – LỚP 12-02 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 3.4 Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV 58 PHẦN : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 62 4.1 Kết luận 62 4.2 Đề xuất 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 MAI THỊ LAN ANH – LỚP 12-02 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích Amp Ampicillin bp Base paire C Carbon DMSO Dimethyl sulfoxide ADN Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleotides ARN Ribonucleic Acid HTKS Hoạt tính kháng sinh kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate IPTG Isopropyl-thio-β-galactoside SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate DTT Dithinotheitol Da MAI THỊ LAN ANH – LỚP 12-02 Dalton VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng 31 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng 33 Bảng 3.1 So sánh gen doxA giải trình tự với gen doxA công bố Genbank qua phần mềm Blast .53 Bảng 3.2 So sánh gen dnrV giải trình tự với gen dnrV công bố Genbank qua phần mềm Blast .55 MAI THỊ LAN ANH – LỚP 12-02 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH SÁCH CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.2 Cấu trúc không gian kháng sinh DXR 15 Hình 1.3 Cấu trúc không gian DNR DXR 15 Hình 1.4 Các gen tham gia vào trình sinh tổng hợp DXR 16 Hình 1.5 Tóm tắt phản ứng xúc tác gen doxA 22 Hình 2.1 Cấu trúc pGEM T Easy vector dùng tách dòng gen 28 Hình 2.2 Cấu trúc pIBR25 dùng biểu gen doxAV 29 Hình 2.3 Sơ đồ phản ứng PCR 36 Hình 3.1 Tách chiết ADN tổng số từ chủng xạ khuẩn 48 S.peucetiusATCC27952 Hình 3.2 Điện di kết PCR nhân gen doxAV 50 Hình 3.3 Tinh gen doxAV từ gel agarose 50 Hình 3.4 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM T.doxAV 51 Hình 3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp pGEM T.doxAV vào vi 52 khuẩn E coli JM109 Hình 3.6 Tách plasmid khuẩn lạc E coli JM109 mang vector 53 pGEM T.doxAV Hình 3.7 Cắt kiểm tra plasmid dòng E.coli JM109 mang 54 pGEM-T.doxAV Hình 3.8 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV 58 Hình 3.9 Cắt plasmid pGEM T.doxAV vector pIBR25 59 enzyme XbaI EcoRI Hình 3.10 Tinh sản phẩm cắt Hình 3.11 Kiểm tra cáckhuẩn lạc chuyển gen vector 61 pIBR25 cắt enzyme EcoRI XbaI MAI THỊ LAN ANH – LỚP 12-02 60 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỞ ĐẦU Bệnh ung thư coi bệnh nan y nguy hiểm phát với số ca mắc bệnh ngày gia tăng giới Theo thống kê tổ chức y tế giới (WHO) năm 2014 cho thấy tới năm 2035 số lượng bệnh nhân mắc bệnh ung thư đạt 24 triệu người tăng 70% so với năm 2012 14,1 triệu người Nhưng số nước phát triển Hoa kỳ, theo thống kê tổ chức ung thư Hoa Kỳ cho thấy tỷ lệ ca tử vong bệnh ung thư hai thập kỷ qua có xu hướng giảm từ đỉnh điểm 215/100.000 người năm 1991 xuống 175/100.000 người năm 2010 Điều chứng tỏ vai trò vô quan trọng chất kháng sinh tham gia vào trình điều trị ung thư.Tuy nhiên , kho tàng thuốc kháng sinh ngày trở nên hạn hẹp khan Tốc độ phát triển loại kháng sinh kháng loài vi sinh vật gây bệnh bắt kịp sức tăng trưởng biến đổi mầm bệnh kháng thuốc Hiện tượng kháng kháng sinh trở thành vấn đề mang tính toàn cầu đặc biệt trội nước phát triển Với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn chi phí có liên quan việc chữa trị trở thành gánh nặng lớn với bệnh nhân Chính vậy, song song với việc sử dụng thuốc kháng sinh cách hợp lí người bệnh việc nghiên cứu, phát triển ứng dụng sản xuất loại kháng sinh nghĩa vụ trách nhiệm nhà khoa học toàn giới Doxorubicin (DXR) kháng sinh thuộc nhóm anthacycline, sử dụng điều trị bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, khối u hệ lympho ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung , ung thư máu Hiện nay, kháng sinh biết đến đặc điểm vượt trội có phổ tác dụng mạnh tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào trình sinh tổng hợp tế bào ung thư MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Doxorubicin loại kháng sinh có giá thành đắt Việt Nam chưa sản xuất Trong đường sinh tổng hợp tự nhiên chủng xạ khuẩn Strepyomyces peucetius hàm lượng Daunorubicin (DNR) tạo với hàm lượng lớn nhiều so với DXR Một biện pháp tăng sản lượng kháng sinh DXR thực phản ứng chuyển hóa invitro nhằm DNR thành DXN Việc chuyển hóa DNR thành DXR dựa hoạt động enzyme Cytochrome P450 Hydroxylase, enzyme Putative Ketoreductase Vì em thực nghiên cứu đề tài: “Tách dòng thiết kế vector biểu nhóm gen doxA dnrV tham gia điều hòa sinh tổng hợp DXR Streptomyces lividansTK24 ” nhằm tạo enzymeCytochrome P450 Hydroxylase, enzyme Putative Ketoreductase tái tổ hợp để thực phản ứng chuyển hóa DNR thành DXR MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Từ kết điện di hình 3.3, bước đầu khẳng định thu nhận đoạn gen doxAV với kích thước 2100bp Đoạn gen thu sau tinh sử dụng tách dòng vector pGEM–T Easy 3.2.3 Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T.doxAV Trong đề tài này, vector pGEM–T Easy chọn làm vector tách dòng gen doxAV Đây vector đa chức có khả tái nhanh Quan trọng hơn, vector mở vòng nên không cần thực phản ứng cắt Do vậy, đầu mút vòng mở vector có base Timin(T) tự mà sản phẩm PCR gen doxAV cuối tạo thành có gắn với base Adenin(A) nên sản phẩm PCR gen doxAV có khả gắn trực tiếp vào với vector mà không cần phải thực cắt đoạn gen doxAV cắt vector enzyme giới hạn đặc hiệu xúc tác enzyme nối.Quy trình tạo vector tái tổ hợp mang gen doxAV vector pGEM T Easy sau : Hình 3.4 Quy trình tạo vector tái tổ hợp doxAV-pGEM T Thực phản ứng nối gen doxAV vào plasmid vector pGEM–T Easy 40c ủ qua đêm (từ 14-16h) 160C Sau tiến hành biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli JM109 phương pháp sốc nhiệt Sản phẩm cấy trang MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 51 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ NGH SINH HỌC môi trường LB đĩa thạch ch có bbổ sung kháng sinh Ampicillin 100µg/ml, chất ch cảm ứng IPTG chất th thị màu X-Gal đem nuôi cấy nhiệtt độ đ 370C thời gian 14-16 Sau 16h nuôi cấyy đĩa thạch LB thấy xuất khuẩn khu lạc xanh khuẩn lạc trắng Khuẩnn llạc mang vector tái tổ hợp pGEM-T.d doxAV có màu trắng khuẩn lạạc mang vector pGEM-T tự đóng vòng òng có màu xanh Kết K nuôi cấy thể hi hình 3.5 Hình 3.5.Biến nạpp vector tái ttổ hợp pGEM T.doxAV vào vi khuẩnE E Coli JM109 Những khuẩn lạcc có màu xanh xu xuất n vector pGEM T không chèn đoạn gen cầnn tách dòng, gen LacZ hoạt động ng bình thường th biểu tạoo thành enzy enzyme β-galactosidase, enzyme thủy y phân c chất Xgal có mặtt môi tru truờng để tạo khuẩn lạcc có màu xanh Trong khuẩn lạc chứaa vector tái ttổ hợp có chèn vào gen doxAV V làm cho trình tự gen lacZ bị phá vỡ cấu trúc nên tổng hợp p đư enzyme βgalactosidase vậyy mà không phân gi giải chất X-gal gal môi trường tr tạo thành khuẩn lạcc màu tr trắng Để kiểm tra kếtt qu gắn gen doxAV vào vector pGEM-T T Easy đồng thời sàng lọc chủng ng mang vector tái ttổ hợp Tiến hành nhặt ngẫu u nhiên bốn b khuẩn MAI THỊ LAN ANH - LỚP ỚP 12 12-02 Page 52 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC lạc trắng nuôi 3ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp(100 µg/ml) lắc 200 vòng/phút, để qua đêm 37°C Sau đó, tiến hành tách plasmid chạy điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết thu hình 3.6 Hình 3.6 Tách plasmid từ khuẩn lạc E coli JM109 trắng Giếng 1÷ 4: Plasmid khuẩn lạc trắng ; Giếng M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder Từ hình 3.6, thấy xuất băng vạch tương ứng với kích thước khoảng 5kb, phù hợp với kích thước plasmid pGEM-T.doxAV 5115bp.Vậy kết luận chuyển gen thành công pGEM-T.doxAV vào E.coli JM109 Để khẳng định nhận xét hoàn toàn xác , tiến hành cắt kiểm tra plasmid dòng E.coli JM109 mang pGEM-T.doxAV hai enzym cắt giới hạn XbaI EcoRI Sản phẩm chạy điện di, thể ởhình 3.7 : MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 53 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hình 3.7 Cắt kiểm tra plasmid dòng E.coli JM1109 mang pGEM-T.doxAV 1,2 : plasmid vector Pgem-T.doxAV ; M : GeneRuler 1kb ADN Ladder Từ kết điện di hình cho thấy hai giếng số xuất hai băng vạch , băng vạch phía có độ dài tương ứng với vạch 2kp thang maker chuẩn , phù hợp với kích thước gen doxAV 2100bp, băng vạch phía có kích thước tương ứng với vạch 3kb thang marker phù hợp với kích thước vector pGEM-T Easy 3015bp Do khẳng định tách dòng thành công gen doxAV pGEMT 3.3 Giải trình tự dự đoán chức gen qua genbank 3.3.1 Giải trình tự gen dự đoán chức doxA: GTGGCCGTCGACCCGTTCGCGTGTCCCATGATGACCATGCAGCGCAAGCCCGAGGTGCACGACGCC TTCCGGGAGGCGGGCCCGGTCGTCGAGGTGAACGCCCCCGCGGGCGGACCCGCCTGGGTCATCACC GATGACGCCCTCGCCCGCGAGGTGCTGGCCGATCCCCGGTTCGTGAAGGACCCCGACCTCGCCCCC GCCGCCTGGCGGGGGGTGGACGACGGTCTCGACATCCCCGTTCCGGAGCTGCGTCCGTTCACGCTC ATCGCCGTGGACGGCGAGGCCCACCGGCGCCTGCGCCGCATCCACGCACCTGCGTTCAACCCGCGC CGGCTGGCCGAGCGGACGGATCGCATCGCCGCGATCGCCGGCCGGCTGCTCACCGAACTCGCCGAC GCCTCCGGCCGGTCGGGCAAACCGGCCGAGCTGATCGGCGGCTTCGCGTACCACTTCCCGCTGTTG GTCATCTGCGAGCTGCTCGGTGTGCCGGTCACCGATCCGGCGATGGCCCGCGAGGCCGTCAGCGTT CTCAAGGCACTCGGCCTCGGCGGCCCGCAGAGCGGCGGGGGTGACGGCACGGACCCTGCCGGGGG CGTGCCGGACACCTCGGCCCTGGAGAGCCTGCTCCTCGAAGCCGTGCACTCAGCCCGGCGGAACGA CACCCCGACCATGACCCGCGTGCTGTACGAGCGCGCGCAGGCCGAGTTCGGCTCGGTCTCCGACGA CCAGCTCGTCTACATGATCACCGGGCTCATCTTCGCCGGCCACGACACCACCGGCTCCTTCCTGGGC TTCCTGCTCGCGGAGGTCCTGGCGGGCCGCCTCGCGGCGGATGCCGACGAGGACGCCGTCTCCCGG TTCGTGGAGGAGGCGCTGCGCTACCACCCGCCGGTGCCCTACACGTTGTGGAGGTTCGCTGCCACG MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 54 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ NGH SINH HỌC GAGGTGACCATCGGCGGCGTCCGGCTGCCCCGCGGAGCGCCGGTGC GAGGTGACCATCGGCGGCGTCCGGCTGCCCCGCGGAGCGCCGGTGCTGGTGGACATCGAGGGCAC TGGTGGACATCGAGGGCAC CAACACCGACGGCCGCCATCACGACGCCCCGCACGCCTTCCACCCGGACCGTCCCTCGTGGCGGCG GCTCACCTTCGGCGACGGGCCGCACTACTGCATCGGGGAGCAGCTCGCCCAGCTGGAGTCGCGCAC GATGATCGGCGTACTGCGCAGCAGGTTCCCCGAGGCCCGACTGGCCGTGCCGTACGACGAGTTGCG GTGGTGCCGGAAGGGGGCCCAGACGGCGCGGCTCACCGA GTGGTGCCGGAAGGGGGCCCAGACGGCGCGGCTCACCGAACTGCCCGTCTGGCTGCGCTGA ACTGCCCGTCTGGCTGCGCTGA Tiếnn hành so sánh trình ttự thu với trình tự phân tích từ t Genbank phần mềm m Blast ((http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), ), kết k cho tháy trình tự có độ tương ương đồng 100% Bảng ng 3.1 So sánh gen doxA giải trình tự với gen dox oxA công bố Genbank qua phầnn m mềm Blast Query Sbjct Query 1330 61 Sbjct 1270 Query 121 Sbjct Query 1210 181 Sbjct Query 1150 241 Sbjct Query 1090 301 Sbjct Query 1030 361 Sbjct Query 970 421 Sbjct Query 910 481 Sbjct Query 850 541 Sbjct 790 GTGGCCGTCGACCCGTTCGCGTGTCCCATGATGACCATGCAGCGCAAGCCCGAGGTGCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGCCGTCGACCCGTTCGCGTGTCCCATGATGACCATGCAGCGCAAGCCCGAGGTGCAC GACGCCTTCCGGGAGGCGGGCCCGGTCGTCGAGGTGAACGCCCCCGCGGGCGGACCCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGCCTTCCGGGAGGCGGGCCCGGTCGTCGAGGTGAACGCCCCCGCGGGCGGACCCGCC 60 TGGGTCATCACCGATGACGCCCTCGCCCGCGAGGTGCTGGCCGATCCCCGGTTCGTGAAG |||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| TGGGTCATCACCGATGACGCCCTCGCCCGCGAGGTGCTGGCCGATCCCCGGTTCGTGAAG GACCCCGACCTCGCCCCCGCCGCCTGGCGGGGGGTGGACGACGGTCTCGACATCCCCGTT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACCCCGACCTCGCCCCCGCCGCCTGGCGGGGGGTGGACGACGGTCTCGACATCCCCGTT CCGGAGCTGCGTCCGTTCACGCTCATCGCCGTGGACGGCGAGGCCCACCGGCGCCTGCGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGGAGCTGCGTCCGTTCACGCTCATCGCCGTGGACGGCGAGGCCCACCGGCGCCTGCGC AGCTGCGTCCGTTCACGCTCATCGCCGTGGACGGCGAGGCCCACCGGCGCCTGCGC CGCATCCACGCACCTGCGTTCAACCCGCGCCGGCTGGCCGAGCGGACGGATCGCATCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCATCCACGCACCTGCGTTCAACCCG CGCATCCACGCACCTGCGTTCAACCCGCGCCGGCTGGCCGAGCGGACGGATCGCATCGCC CGCCGGCTGGCCGAGCGGACGGATCGCATCGCC GCGATCGCCGGCCGGCTGCTCACCGAACTCGCCGACGCCTCCGGCCGGTCGGGCAAACCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGATCGCCGGCCGGCTGCTCACCGAACTCGCCGACGCCTCCGGCCGGTCG GCGATCGCCGGCCGGCTGCTCACCGAACTCGCCGACGCCTCCGGCCGGTCGGGCAAACCG GGCAAACCG GCCGAGCTGATCGGCGGCTTCGCGTACCACTTCCCGCTGTTGGTCATCTGCGAGCTGCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCGAGCTGATCGGCGGCTTCGCGTACCACTTCCCGCTGTTGGTCATCTGCGAGCTGCTC GGTGTGCCGGTCACCGATCCGGCGATGGCCCGCGAGGCCGTCAGCGTTCTCAAGGCACTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTGTGCCGGTCACCGATCCGGCGATGGCCCGCGAGGCCGTCAGCGTTCTCAAGGCACTC GGCCTCGGCGGCCCGCAG GGCCTCGGCGGCCCGCAGAGCGGCGGGGGTGACGGCACGGACCCTGCCGGGGGCGTGCCG AGCGGCGGGGGTGACGGCACGGACCCTGCCGGGGGCGTGCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCCTCGGCGGCCCGCAGAGCGGCGGGGGTGACGGCACGGACCCTGCCGGGGGCGTGCCG 180 MAI THỊ LAN ANH - LỚP ỚP 12 12-02 1271 120 1211 1151 240 1091 300 1031 360 971 420 911 480 851 540 791 600 731 Page 55 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Query 601 Sbjct Query 730 661 Sbjct Query 670 721 Sbjct Query 610 781 Sbjct Query 550 841 Sbjct Query 490 901 Sbjct Query 430 961 Sbjct Query 370 1021 Sbjct Query 310 1081 Sbjct Query 250 1141 Sbjct Query 190 1201 Sbjct 130 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC GACACCTCGGCCCTGGAGAGCCTGCTCCTCGAAGCCGTGCACTCAGCCCGGCGGAACGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACACCTCGGCCCTGGAGAGCCTGCTCCTCGAAGCCGTGCACTCAGCCCGGCGGAACGAC ACCCCGACCATGACCCGCGTGCTGTACGAGCGCGCGCAGGCCGAGTTCGGCTCGGTCTCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCCCGACCATGACCCGCGTGCTGTACGAGCGCGCGCAGGCCGAGTTCGGCTCGGTCTCC GACGACCAGCTCGTCTACATGATCACCGGGCTCATCTTCGCCGGCCACGACACCACCGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGACCAGCTCGTCTACATGATCACCGGGCTCATCTTCGCCGGCCACGACACCACCGGC TCCTTCCTGGGCTTCCTGCTCGCGGAGGTCCTGGCGGGCCGCCTCGCGGCGGATGCCGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCCTTCCTGGGCTTCCTGCTCGCGGAGGTCCTGGCGGGCCGCCTCGCGGCGGATGCCGAC GAGGACGCCGTCTCCCGGTTCGTGGAGGAGGCGCTGCGCTACCACCCGCCGGTGCCCTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGGACGCCGTCTCCCGGTTCGTGGAGGAGGCGCTGCGCTACCACCCGCCGGTGCCCTAC ACGTTGTGGAGGTTCGCTGCCACGGAGGTGACCATCGGCGGCGTCCGGCTGCCCCGCGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGTTGTGGAGGTTCGCTGCCACGGAGGTGACCATCGGCGGCGTCCGGCTGCCCCGCGGA GCGCCGGTGCTGGTGGACATCGAGGGCACCAACACCGACGGCCGCCATCACGACGCCCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGCCGGTGCTGGTGGACATCGAGGGCACCAACACCGACGGCCGCCATCACGACGCCCCG CACGCCTTCCACCCGGACCGTCCCTCGTGGCGGCGGCTCACCTTCGGCGACGGGCCGCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACGCCTTCCACCCGGACCGTCCCTCGTGGCGGCGGCTCACCTTCGGCGACGGGCCGCAC TACTGCATCGGGGAGCAGCTCGCCCAGCTGGAGTCGCGCACGATGATCGGCGTACTGCGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACTGCATCGGGGAGCAGCTCGCCCAGCTGGAGTCGCGCACGATGATCGGCGTACTGCGC AGCAGGTTCCCCGAGGCCCGACTGGCCGTGCCGTACGACGAGTTGCGGTGGTGCCGGAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCAGGTTCCCCGAGGCCCGACTGGCCGTGCCGTACGACGAGTTGCGGTGGTGCCGGAAG GGGGCCCAGACGGCGCGGCTCACCGAACTGCCCGTCTGGCTGCGCTGA 1248 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGGCCCAGACGGCGCGGCTCACCGAACTGCCCGTCTGGCTGCGCTGA 83 660 671 720 611 780 551 840 491 900 431 960 371 1020 311 1080 251 1140 191 1200 131 3.3.2 Giải trình tự gen dự đoán chức dnrV GTGACCAGGTTCGCGCCCGGCGCCCCCGCATGGTTCGACCTCGGTTCGCCCGATGTCGCCGCCTCGG CCGACTTCTACACCGGCCTGTTCGGCTGGACCGCCACCGTGGTCAGCGACCCGGGCGCCGGGGGAT ACACGACGTTCAGCTCCGACGGGAAGCTGGTCGCCGCGGTCGCCCGCCACCAGATCGACACCCCCT ACCACCGGCCGTACGGGCCCGGGAACGACCAGCACGGCATGCCGGCCATCTGGACCGTGTACTTCG CCACCGACGACGCCGACGCACTGACCAAGCGGGTCGAGACGGCGGGCGGCGAGGTCATCATGACT CCGATGGACGTCCTCGGCCTCGGCCGGATGGCGGTCTTCGCCGACCCCGCCGGGGCCGCGTTCGCG GTCTGGCGCAAGGGAGTCATGGAGGGCGCGGAGGTGACGGGCGTGCCCGGCTCGGTCGGCTGGGT CGAGCTGGTGACCGACGGCATCGGGGCCGCCCGGGACTTCTACCCGGCGACCCTCGGCCTGGCTCC GGCCGACACCGGACTGAAGGGCGTCACCGACCCGGTCTGGCACATCGGTGACACACCGGTCGCCGG CACCCAGGAGCTGGGCGTCACCGGCGCGGTACGGCCGCACTGGGCCGTGCTGTTCGCCGTGCACGA CTGCGACGCGACGGTCCGGCGCGCCGTTGAACTCGGCGGCTCCGTCGAGAACGAGCCCGCCGACAC GCCCAGGGGGCGGCGGGCGGACCTGCTCGACCCGCACGGGGCCGGCTTCTCGGTGGTCGAACTGCG GGAGGGGTACCCCGCGGCGGCGGGCGGTGCCTCGTGA MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 56 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ NGH SINH HỌC Tiếnn hành so sánh trình ttự thu với trình tự phân tích từ t Genbank phần mềm m Blast ((http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), ), kết k cho tháy trình tự có độ tương ương đồng 100% Bảng ng 3.2 So sánh gen dnrV giải trình tự với gen dnrV V đư công bố Genbank qua phần mềm m Blast Query Sbjct Query 2175 61 Sbjct Query 2115 121 Sbjct Query 2055 181 Sbjct Query 1995 241 Sbjct Query 1935 301 Sbjct Query 1875 361 Sbjct Query 1815 421 Sbjct Query 1755 481 Sbjct Query ery 1695 541 Sbjct Query 1635 601 Sbjct Query 1575 661 Sbjct Query 1515 721 GTGACCAGGTTCGCGCCCGGCGCCCCCGCATGGTTCGACCTCGGTTCGCCCGATGTCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGACCAGGTTCGCGCCCGGCGCCCCCGCATGGTTCGACCTCGGTTCGCCCGATGTCGCC GCCTCGGCCGACTTCTACACCGGCCTGTTCGGCTGGACCGCCACCGTGGTCAGCGACCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCTCGGCCGACTTCTACACCGGCCTGTTCGGCTGGACCGCCACCGTGGTCAGCGACCCG GGCGCCGGGGGATACACGACGTTCAGCTCCGACGGGAAGCTGGTCGCCGCGGTCGCCCGC ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| GGCGCCGGGGGATACACGACGTTCAGCTCCGACGGGAAGCTGGTCGCCGCGGTCGCCCGC CACCAGATCGACACCCCCTACCACCGGCCGTACGGGCCCGGGAACGACCAGCACGGCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACCAGATCGACACCCCCTACCACCGGCCGTACGGGCCCGGGAACGACCAGCACGGCATG CCGGCCATCTGGACCGTGTACTTCGCCACCGACGACGCCGACGCACTGACCAAGCGGGTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGGCCATCTGGACCGTGTACTTCGCCACCGACGACGCCGACGCACTGACCAAGCGGGTC CATCTGGACCGTGTACTTCGCCACCGACGACGCCGACGCACTGACCAAGCGGGTC GAGACGGCGGGCGGCGAGGTCATCATGACTCCGATGGACGTCCTCGGCCTCGGCCGGATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGACGGCGGGCGGCGAGGTCATCATGACTCCGATGGACGTCCTCGGCCTCGGCCGGATG GCGGTCTTCGCCGACCCCGCCGGGGCCGCGTTCGCGGTCTGGCGCAAGGGAGTCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGGTCTTCGCCGACCCCGCCGG GCGGTCTTCGCCGACCCCGCCGGGGCCGCGTTCGCGGTCTGGCGCAAGGGAGTCATGGAG GGCCGCGTTCGCGGTCTGGCGCAAGGGAGTCATGGAG GGCGCGGAGGTGACGGGCGTGCCCGGCTCGGTCGGCTGGGTCGAGCTGGTGACCGACGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCGCGGAGGTGACGGGCGTGCCCGGCTCGGTCGGCTGGGTCGAGC GGCGCGGAGGTGACGGGCGTGCCCGGCTCGGTCGGCTGGGTCGAGCTGGTGACCGACGGC TGGTGACCGACGGC ATCGGGGCCGCCCGGGACTTCTACCCGGCGACCCTCGGCCTGGCTCCGGCCGACACCGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCGGGGCCGCCCGGGACTTCTACCCGGCGACCCTCGGCCTGGCTCCGGCCGACACCGGA CTGAAGGGCGTCACCGACCCGGTCTGGCACATCGGTGACACACCGGTCGCCGGCACCCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGAAGGGCGTCACCGACCCGGTCTGGCACATCGGTGACACACCGGTCGCCGGCACCCAG GAGCTGGGCGTC GAGCTGGGCGTCACCGGCGCGGTACGGCCGCACTGGGCCGTGCTGTTCGCCGTGCACGAC ACCGGCGCGGTACGGCCGCACTGGGCCGTGCTGTTCGCCGTGCACGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGCTGGGCGTCACCGGCGCGGTACGGCCGCACTGGGCCGTGCTGTTCGCCGTGCACGAC TGCGACGCGACGGTCCGGCGCGCCGTTGAACTCGG TGCGACGCGACGGTCCGGCGCGCCGTTGAACTCGGCGGCTCCGTCGAGAACGAGCCCGCC CGGCTCCGTCGAGAACGAGCCCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCGACGCGACGGTCCGGCGCGCCGTTGAACTCGGCGGCTCCGTCGAGAACGAGCCCGCC GACACGCCCAGGGGGCGGCGGGCGGACCTGCTCGACCCGCACGGGGCCGGCTTCTCGG GACACGCCCAGGGGGCGGCGGGCGGACCTGCTCGACCCGCACGGGGCCGGCTTCTCGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| MAI THỊ LAN ANH - LỚP ỚP 12 12-02 60 2116 120 2056 180 1996 240 1936 300 1876 360 1816 420 1756 480 1696 540 1636 600 1576 660 1516 720 1456 780 Page 57 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Sbjct Query 1455 781 Sbjct 1395 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC GACACGCCCAGGGGGCGGCGGGCGGACCTGCTCGACCCGCACGGGGCCGGCTTCTCGGTG GTCGAACTGCGGGAGGGGTACCCCGCGGCGGCGGGCGGTGCCTCGTGA 828 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCGAACTGCGGGAGGGGTACCCCGCGGCGGCGGGCGGTGCCTCGTGA 1348 1396 3.4 Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV Trong đề tài sử dụng vector pIBR25làm vector biểu gen doxAV Chủng vi khuẩn E coli JM109 lựa chọn chủng vi khuẩn kiểm tra tạo thành vector tái tổ hợp chủng xạ khuẩn Streptomyces lividansTK24 tế bào vật chủ biểu gen doxAV Hình 3.8: Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV Cắt plasmid pGEM T.doxAV plasmid vector pIBR25 enzyme XbaIvà EcoRI Tiến hành cắt plasmid pGEM T.doxAV enzyme giới hạn XbaIvà EcoRI để thu nhận đoạn gen doxAV Đồng thời, cắt vector pIBR25 hai loại enzyme để tạo hai đầu dính tương ứng với gen doxAV Phản ứng cắt plasmid vector pGEM T.doxAV plasmid pIBR25 thực 300C MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 58 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ủ giờ.Sau kết thúc, sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% Hình 3.9Cắt vector pGEM-T.doxA vector pIBR25 enzymeXbaI EcoRI 1,2: Sản phẩm cắt plasmid pGEM-T.doxAV;3,4: Sản phẩm cắt plasmid vector pIBR25;M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder Từ kết điện di hình cho thấy hai giếng số xuất hai băng vạch, băng vạch phía nằm vạch 2kb 2,5kb thang marker chuẩn tương đương với kích thước gen doxAV 2100bp, băng vạch phía có kích thước tương đương với vạch 3kb thang marker phù hợp với kích thước vector pGEM-T Easy vector 3015bp Trên giếng số thấy xuất băng vạch gần vạch 8kb thang marker chuẩn tương ứng với kích thước 7500bp vector pIBR25 Như cắt thành công vector pGEM T.doxAV tạo vị trí tương thích để gắn gen doxAV vào vector pIBR25 Tiến hành cắt lấy băng vạch có gen doxAV băng vạch vector pIBR25đem tinh Kết sau tinh điện di gel agarose 1% thể hình 3.10 MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 59 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hình 3.10 Tinh sản phẩm cắt plasmid vector pGEM T.doxAV vector pIBR25 enzyme XbaI EcoRI ; Giếng 1: Plasmid vector pGEM T.doxAV; Giếng 2: Plasmid vector pIBR25 ; Giếng M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder Biến nạp vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV vào vi khuẩn E.coli JM109 Thực phản ứng nối gen doxA vào vector pIBR25 enzyme T4 DNA ligase 40C, để ủ qua đêm (14-16h) Để kiểm tra tạo thành vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV, tiến hành biến nạp sản phẩm vào vi khuẩn E coli JM109 Sàng lọc chủng mang vector tái tổ hợp môi LB có bổ sung kháng sinh Amp(100µg/ml) Sau nuôi cấy 16h 370C, đĩa thạch xuất khuẩn lạc Tiến hành nuôi cấy ngẫu nhiên năm khuẩn lạc 3ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp(100µg/ml), nuôi lắc với tốc độ 150 rpm nhiệt độ 370C 16h Sau tiến hành tách plasmid , thực phản ứng cắt emzym XbaI EcoRI Sau kết thúc, sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% hình 3.11: MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 60 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hình 3.11 Kiểm tra khuẩn lạc chuyển vector pIBR25 cắt hai enzyme EcoRI/XbaI ; Giếng M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder;Giếng 1-5 : Plasmid dòng đánh số từ đến Qua ảnh điện di kết rõ khuẩn lạc số 2, khuẩn lạc xác chuyển thành công vector pIBR25.doxAV bởitrên ba giếng số , xuất hai băng vạch, băng vạch phía nằm vạch 2kb 2,5kb thang marker chuẩn tương ứng với kích thước gen doxAV 2100bp, băng vạch phía có kích thước vạch 7kb thang marker phù hợp với kích thước vector pIBR25 7500bp Do đó, khẳng định tạo thành công vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV E coli JM109 MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 61 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẦN : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Từ kết thu trên, xin rút kết luận sau: Thiết kế thành công vector tách dòng pGEM-T.doxAV Thiết kế thành công vector biểu mang đoạn gen doxAV vector pIBR25 biến nạp thành công vào tế bào xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 4.2 Đề xuất Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu thu trên, xin đề xuất số kiến nghị sau: Biểu thành công gen doxA dnrV Streptomyces lividans TK24 Thực thành công việc chuyển hóa DNR thành DXR nhờ protein tái tổ hợp biểu Streptomyces lividans TK24 MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 62 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Văn Thu, (2000), giảng kháng sinh vitamin, Bộ môn công nghệ Dược - trường Đại Học Dược Hà Nội Lê Xuân Phương (2000), vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất xây dựng Hà Nội, tr 47-49 PGS.TS Kiều Hữu Ảnh, giáo trình vi sinh vật học tập Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập III, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1978 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường đại học sư phạm Thái Nguyên Nguyễn Bảo Hưng(2010), Tạo dòng biểu gen chitinase từ nấm trichoderma, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường đại học khoa học, Đại học Huế Tiếng Anh 15 Weiss RB (December 1992): "The anthacylines will we ever find a better Doxorubicin " Seminars in Oncology 19 (6): 670- 86 16 Tan C, Tasaka H, Yukp, Murphy ML, Karnofsky DA (March 1967): " Daunorubicin an antitumor antibiotic in the treatment of neoplastic disease clinical evaluation with special reference to childhood leukemia ", Cancer 20 (3): 333-53 MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 63 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 17 Arcamone F, CassineHG, Fantini G et al (1996): " Adriamycin 14Hydroxydaunomycin, a new antitunmor antibiotic from Streptomyces Peucetius Varaesius " , Biotechnol Bioeng 11 (6): 1101-10 18 Lomovskaya N, Otten SL, Doikatayama Y et al (1999) : " Daunorubicin over production in Streptomyces Peucetius: Cloning and characterization of the dnrU keto recductase and dnrV gene and the Dox a Cytochrome P-450 hydroxylase gene", J Bacteriol 181 (1): 305-18 19 Di Marco A, Gaetani M, Scarpinato B (February 1969) : "Adriamycin (NSC123,127): a new antibiotic with antitumor activity" Cancer Chemother Rep 53 (1): 33–7 20 Walcazak RJ, Dickens ML, Priestley ND, Strohl WR (1999): "Purification, Properties, and Characterization of Recombinan Streptomyces sp Strain C5 DoxA, a Cytochrome P-450 Catalyzing Multiple Steps in Doxorubicin Biosynthesis 21 Fornari FA, Randolph JK, Yalowich JC, Ritke MK, Gewirtz DA (April 1994): "Interference by doxorubicin with ADN unwinding in MCF-7 breast tumor cells" Mol Pharmacol 45 (4): 649–56 22 Momparler RL, Karon M, Siegel SE, Avila F (August 1976) : "Effect of adriamycin on ADN, RNA, and protein synthesis in cell-free systems and intact cells" Cancer Res36 (8): 2891–5 23 "National Academy of Sciences: NAS Award in Molecular Biology" National Academy of Science Retrieved 2009-01-07or Unwinding the ADN Topoisomerase Story: the Work of James C Wang 24 Yves (May 28, 2010) "ADN topoisomerases and their poisoning by anticancer and antibacterial drugs" Chemistry & Biology Retrieved May 28, 2010 MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 64 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 25 Champoux JJ (2001) "ADN topoisomerases: structure, function, and mechanism" Annu Rev Biochem 70: 369–413 doi:10.1146/annurev.biochem.70.1.369 26 Caroline A.A , Katherline L.M ,(1998) Eukaryotic ADN Topoisomease II beta Review BioEssays 20:215-226 27 Lown J.W.,(1993) Anthracyline and anthraquinone anticancer agents:current status and recent developments Phamacol Ther 60(2): 185-214 28 Ronal M Atlas, Microoganism in our world, Publish by Mosby-year book, Inc, 1995 29 Waksman, S.A The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, 1961, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 30 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro, Transpl Immunol, 2007/4, 17 (3): 162 - 170 31 Waksman, S A (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams Wilkins Co, Baltimore, USA 32 Jiang H, Hutchinson C R., (2006) "Feedback regulation of doxorubicin biosynthesis in Streptomyces peucetius" Res Microbiol 157 (7): 666–74 33 Doxorubicin Overproduction Characterization of the in dnrU Streptomyces peucetius: Ketoreductase and Cloning dnrV and Genes and the doxA Cytochrome P-450 Hydroxylase Gene 34 Physical map of the Streptomyces lividans 66 genome and comparison with that of the related strain Streptomyces coelicolor A3 MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page 65 [...]... NGHỆ SINH HỌC nghiệm sinh học phân tử em đã thực hiện đề tài nghiên cứu mang tên : Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện nhóm gen doxA và dnrV tham gia điều hòa sinh tổng hợp DXR trong Streptomyces lividansTK24” 1.7.1 Mục tiêu đề tài • Tách dòng thành công gen doxA. dnrV bằng pGEMT – easy vector • Thiết kế vector biểu hiện pIBR25.doxAV mang 2 gen doxAv dnrV dùng biểu hiện các gene trong hệ xạ khuẩn. .. chế sự sinh tổng hợp của màng tế bào • Nhóm 3: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của Protein của vi khuẩn • Nhóm 4: Kháng sinh ức chế sự tổng hợp ADN của vi khuẩn • Nhóm 5: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp axit Folic • Nhóm 6: Kháng sinh ức chế một số quá trình tổng hợp khác 1.1.3.3 Phân loại kháng sinh dựa vào mức độ tác dụng Dựa vào mức độ tác dụng, kháng sinh được chia thành 2 nhóm sau: • Nhóm. .. trong hệ xạ khuẩn làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh Doxorubicin 1.7.2 Nội dung đề tài - Thiết kế mồi cho quá trình tạo vector biểu hiện dòng gen doxA và dnrV - Tách dòng gen doxA , dnrV trong pGEMT – easy vector - Giải trình tự gen doxA , dnrV và so sánh với trình tự gen doxA , dnrV ược công bố trên ngân hàng Genbank - Thiết kế vector biểu hiện pIBR25.doxAV MAI THỊ LAN ANH - LỚP 12-02 Page... nghiệm sinh học phân tử khoa CNSH Viện Đại học Mở Hà Nội Đây là chủng xạ khuẩn tự nhiên sản sinh ra kháng sinh DXR được dùng để tách chiết ADN tổng số phục vụ việc tách dòng gen doxA , dnrV bằng pGEM-T Easy vector Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 Chủng xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24sử dụng làm vật chủ biểu hiện gen doxA và dnrV Khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh do có chứa promoter biểu hiện. .. KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC xạ khuẩnStreptomyces peucetius ATCC27952 Gen dnrV là gen điều hòa luôn đi cùng với gen doxA để hỗ trợ cho quá trình sinh tổng hợp chuyển hóa DNR thành DXR đạt hiệu suất cao hơn 1.6 Vector biểu hiện pIBR25 trong hệ xạ khuẩn Biểu hiện gen của các chủng vi sinh vật thuộc nhóm xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật gram dương vô cùng phức tạp và khó khăn bởi cấu trúc genome của xạ khuẩn có tỷ... 1: Kháng sinh diệt khuẩn bao gồm những kháng sinh tác dụng đến khả năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp ADN và ARN … • Nhóm 2: Kháng sinh kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào các enzyme hay các ribosome 30S, 50S và 70S 1.1.3.4 Phân loại kháng sinh dựa vào phổ tác dụng Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh được phân thành 5 nhóm sau: • Nhóm1 : Nhóm kháng sinh có... này nhóm gen điều hòa được chuyển vào vector có chứa promotor mạnh ( ermE*), sau đó chuyển vào tế bào vật chủ để tạo ra chủng tái tổ hợp đã tăng khả năng sinh tổng hợp Doxorubicin cao hơn gấp 3-4,3 lần so với tế bào ban đầu 1.5.3 Vai trò liên kết hỗ trợ của doxA và dnrV Lý do mồi ngược của gen dnrV lại giống mồi ngược của gen doxA là do gen doxA là gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh. .. hoạt dịch, u quái và u nguyên bào võng mạc 1.4.6.2 Thành tựu nghiên cứu Hiện nay với nền khoa học hiện đại nghiên cứu tạo ra thuốc chống ung thư đã áp dụng các phương pháp sinh tổng hợp, hóa tổng hợp hoặc kết hợp bán tổng hợp tạo ra thư viện dự trữ, tổ hợp lại các hợp chất có hoạt tính chống ung thư Kết hợp với việc áp dụng công nghệ enzyme, kết hợp các enzyme để sinh tổng hợp kháng sinh tạo ra nhiều... của xạ khuẩn Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm Tên xạ khuẩn là actinomycete, bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) Ban đầu xạ khuẩn được coi là nấm nhỏ vì chúng sinh trưởng giống với nấm Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn Gram (+) và xạ khuẩn) ,... loại vector đặc biệt để chuyển vào tế bào xạ khuẩn đã và đang nghiên cứu bởi rất nhiều nhóm nghiên cứu về xạ khuẩn Tuy nhiên cho tới nay chưa có bất kỳ một loại vector biểu hiện đặc biệt nào dùng cho tế bào xạ khuẩn được thương mại hóa Vì vậy khi thực hiên các nghiên cứu về biểu hiện gen của xạ khuẩn thường phải tự thiết kế vector phù hợp để sử dụng cho nghiên cứu của mình Nhóm nghiên cứu của Sohng và