VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: “NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN SẢN XUẤT HOẠT CHẤT AVG TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES SP CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TỔNG HỢP ETYLEN TRONG QUẢ TƯƠI” Giáo viên hướng dẫn: TH.S NGUYỄN VĂN NGUYỆN Sinh viên thực : LƯƠNG THỊ HỒNG Lớp : CNSH -1201 Hà Nội, năm 2016 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch- Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch hướng dẫn ThS Nguyễn Văn Nguyện Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Văn Nguyện, người định hướng, giúp đỡ, bảo tận tình cho trình hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán công nhân viên làm việc Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực tập thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cô khoa Công nghệ sinh học- Viện Đại học Mở Hà Nội, giảng dạy truyền đạt kiến thức quý giá suốt thời gian học tập trường Cuối xin gửi tới gia đình, bạn bè tôi, người động viên giúp đỡ suốt trình học tập hoàn thành khóa luận lời cảm ơn chân thành Hà Nội, ngày… tháng năm 2016 Người thực Lương Thị Hồng Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG i DANH MỤC HÌNH ii MỞ ĐẦU 1.1 Xạ khuẩn Streptomyces.sp 1.1.1 Đặc điểm Streptomyces.sp 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.1.2 Cấu trúc tế bào trao đổi chất 1.1.2 Vòng đời 1.1.3 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa 1.1.4 Yêu cầu dinh dưỡng điều kiện phát triển Streptomyces.sp 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sinh tổng hợp hợp chất amino acid chủng Streptomyces sp 1.2.1 Ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng tích lũy sản phẩm amino acid chủng Streptomyces sp 1.2.1.1 Ảnh hưởng nguồn Carbon 1.2.1.2 Ảnh hưởng nguồn Nitơ 10 1.2.1.3 Ảnh hưởng nguồn thức ăn khoáng 12 1.2.1.4 Một số môi trường dinh dưỡng thích hợp cho lên men sinh tổng hợp hoạt chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces.sp 16 1.2.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng tích lũy sản phẩm amino acid chủng Streptomyces.sp 18 1.2.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 18 1.2.2.2 Ảnh hưởng pH 19 1.2.2.3 Nhu cầu oxy thông khí trình lên men 20 1.2.2.4 Thời gian nuôi cấy thích hợp cho lên men sản xuất hợp chất amino acid từ chủng Streptomyces sp 22 Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1.3 Công nghệ lên men sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp 22 1.3.1 Một số thông tin hoạt chất AVG 22 1.3.1.1 Lịch sử phát 22 1.3.1.2 Một số thông tin hoạt chất AVG 24 1.3.2 Công nghệ lên men sản xuất chế phẩm AVG từ xạ khuẩn 25 Streptomyces sp 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu 27 2.1.1 Đối tượng 27 2.1.2 Môi trường 27 2.1.3 Hóa chất 27 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Các phương pháp chung 28 2.2.1.1 Chuẩn bị dịch lên men cho kiểm tra hoạt tính AVG 28 2.2.1.2 Xác định hàm lượng sinh khối khô 29 2.2.1.3 Định tính sắc ký mỏng (TLC): 29 2.2.1.4 Định lượng hoạt chất AVG dịch lên men sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 30 2.2.2 Bố trí thí nghiệm 31 PHẦN 3: KẾT QUẢ 34 3.1 Xác định môi trường lên men thích hợp cho sản xuất AVG 34 3.1.1 Xác định nguồn Carbon thích hợp cho trình lên men sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp.S6 34 3.1.2 Xác định nguồn Nitơ thích hợp cho trình lên men sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp S6 36 3.1.2.1 Nguồn Nitơ ảnh hưởng đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 36 Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.1.2.2 Nguồn Nitơ đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 37 3.1.3 Ảnh hưởng nguồn chất khoáng đến sinh trưởng tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 37 3.1.3.1 Ảnh hưởng nguồn chất khoáng 37 3.1.3.2 Ảnh hưởng nồng độ FeSO4 39 3.1.3.3 Ảnh hưởng nồng độ MnCl2 40 3.2 Xác định quy trình công nghệ lên men thích hợp cho sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp.S6 42 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 42 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 43 3.2.3 Ảnh hưởng độ oxy hòa tan đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 45 3.2.4 Xác định thời gian lên men thích hợp cho sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 46 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Nguồn C vi sinh vật sử dụng Bảng 1.2 : Nguồn N vi sinh vật sử dụng 10 Bảng 1.3 : Muối vô chức sinh lý chúng 13 Bảng 1.4: Tác dụng sinh lý nguyên tố vi lượng 15 Bảng 3.1: Ảnh hưởng nguồn C đến sinh trưởng 34 Bảng 3.2: Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 37 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nhân tố, muối khoáng đến trưởng sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 38 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 42 Bảng 3.5: Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 44 Bảng 3.6: Khảo sát khoảng thời gian thu hồi thích hợp hoạt chất AVG lên men từ chủng Streptomyces sp.S6 46 Lương Thị Hồng i Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái xạ khuẩn Streptomyces Hình 1.2: Khả ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh cháy Erwinia amylovora 23 Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất AVG 24 Hình 3.1: Ảnh hưởng nguồn Carbon đến sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 35 Hình 3.2: Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 36 Hình: 3.3: Ảnh hưởng nguồn chất khoáng đến sinh tổng hợp AVG 38 Hình 3.4 : Ảnh hưởng FeSO4 đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 39 Hình 3.5: Ảnh hưởng FeSO4 đến sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 40 Hình 3.6: Ảnh hưởng MnCl2.2H2O đến sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 41 Hình 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh tổng hợp AVG lên men Streptomyces sp.S6 43 Hình 3.8: Ảnh hưởng pH đến sinh tổng hợp AVG dịch lên men 44 Hình 3.9: Ảnh hưởng độ oxy hòa tan đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 45 Hình 3.10: Thời gian thu hồi thích hợp hoạt chất AVG lên men từ chủng Streptomyces sp.S6 47 Lương Thị Hồng ii Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Ở nước ta, sản phẩm trái ngày đóng vai trò quan trọng kinh tế Năm 2010, sản lượng trái Việt Nam đạt gần 6,1 triệu tấn, đứng hàng thứ 22 giới thứ khu vực châu Á, sau Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines, Indonesia, Iran, Thái Lan Pakistan Tuy nhiên thu hái bảo quản sau thu hoạch gặp nhiều khó khăn, vào vụ rau thu hoạch ạt khiến giá giảm mạnh, tiêu thụ không kịp, khi hết mùa vụ lại không đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng Theo thống kê, nước ta thiệt hại khoảng 3000 tỉ năm hư hỏng nông sản sau thu hoạch Do đó, nhu cầu bảo quản hoa tươi lâu đảm bảo an toàn cao Từ lâu nghiên cứu etylen tác nhân kích thích chín quả, già hoá quan toàn Việc sử dụng chất chống lại hoạt động etylen (kháng etylen) có tác dụng làm chậm chín già hóa quả, nhờ kéo dài thời gian bảo quản tươi sau thu hoạch Rất nhiều chất ứng dụng để giúp chín chậm sử dụng ion kim loại nặng Ag, Ti, Co, Hg, Pd Tuy nhiên tồn dư kim loại nặng việc bảo quản tươi ảnh hưởng xấu đến môi trường sức khỏe người Do đó, việc sản xuất hợp chất an toàn, hiệu để bảo quản rau nhiều nhà khoa học quan tâm Trong hoạt chất, Aminoethoxy Vinyl Glycine (AVG) – amino acid sinh tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces có khả kết hợp, ức chế hoạt động enzyme ACC synthase – enzyme định đường hình thành ehtylene tươi ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam, AVG nhập để sử dụng kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản tươi tên thương mại Retain AVG đến sản xuất trình lên men vi sinh vật mà cụ thể chủng Streptomyces Trong lên men sản xuất AVG, bên cạnh chủng giống vi sinh vật yếu tố môi trường dinh dưỡng (nguồn carbon, nitơ, nguyên tố Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp khoáng) điều kiện lên men (pH, nhiệt độ, oxy…) có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp AVG chủng vi sinh vật Do đó, để sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp với hàm lượng cao, đạt hiệu kinh tế cần thu hồi sản phẩm vô cần thiết Nắm bắt tình hình chúng nghiên cứu để lựa chọn môi trường dinh dưỡng phù hợp, chi phí thấp tập hợp điều kiện công nghệ tối ưu hóa nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan, thời gian thu hồi sản phẩm vô cần thiết Nắm bắt tình hình tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu công nghệ lên men sản xuất hoạt chất AVg từ xạ khuẩn Streptomyces sp có khả ức chế sinh tổng hợp etylene tươi.” Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC TIÊU Xác định yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sinh tổng hợp AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp S6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 - Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Cacbon đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 - Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 - Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn chất khoáng đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp - Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 - Nghiên cứu ảnh hưởng độ oxy hòa tan đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 - Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 - Nghiên cứu xác định thời gian thu hồi hiệu AVG sản xuất từ chủng Streptomyces sp.S6 Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hàm lượng AVG 74,88 74,88 74,88 74,88 Hàm lượng AVg(mg/l) 75 74 73 72 71,2 Hàm lượng AVG 71 70 69 0.005g/l 0.01g/l 0.015g/l 0.02g/l 0.025g/l Hàm lượng MnCl2( g/l) Hình 3.6: Ảnh hưởng MnCl2.2H2O đến sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 Kết đồ thị cho thấy, bổ sung Mn2+ hỗ trợ tốt cho sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 giúp tăng cường tích lũy AVG dịch lên men Hàm lượng sinh khối hàm lượng AVG sinh tổng hợp tăng tăng nồng độ MnCl2 đạt cao nồng độ 0,01g/l, đạt 8,84g sinh khối/l dịch môi trường hàm lượng AVG đạt 74,88mg/l Tăng nồng độ MnCl2 0,01g/l không làm tăng sinh khối lượng AVG, điều Mn 2+ không cạnh tranh hoạt động với Fe2+ Từ kết nghiên cứu trên, đề tài lựa chọn nồng độ MnCl2 bổ sung vào môi trường 0,01g/l dịch môi trường Từ kết nghiên cứu trên, đề tài xác định môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp AVG từ chủng Streptomyces sp S6 là: Glucose-10,0 g/l, Pepton-10,0 g/l, nước chiết thịt-30ml/l; FeSO4.6H2O-0,03g/l; MnCl2.2H2O -0,01g/l; Từ kết nghiên cứu trên, đề tài xác định môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp AVG từ chủng Streptomyces sp S6 là: Glucose: 10,0 g/l, Pepton: 10,0 g/l, cao nấm men: g/l; Nước chiết thịt: 30ml/l; NaCl: 10,0 g/l; FeSO4: 0,03g/l; CaCO3: 2,0 g/l Sau gọi môi trường AVG-TH Lương Thị Hồng 41 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.2 Xác định quy trình công nghệ lên men thích hợp cho sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp.S6 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 Nghiên cứu khả sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 điều kiện nhiệt độ khác nhau, kết trình bày bảng 3.4: Bảng 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 TT Nhiệt độ Hàm lượng sinh khối (g/l) (0C) 12 24 36 48 60 72 26 5,44 6,05 6,55 6,92 7,08 7,10 28 7,05 8,84 8,85 8,86 8,88 8,88 30 7,08 8,84 8,85 8,86 8,88 8,88 32 6,54 7,23 7,23 7,27 7,30 7,31 Hàm lượng sinh khối (g/l) Ảnh hưởng nhiệt độ (độ C) đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 10 26 28 30 32 12 24 36 48 60 72 Kết bảng cho thấy, khảo sát điều kiện nhiệt độ 26-320C, lượng sinh khối tạo thành nhiệt độ khác khác Lượng sinh khối đạt cao nhiệt độ 280C 300C tương đương nhau, đạt 8,84g/l sau 24 lên men Nhiệt độ 300C 280C không thích hợp cho sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 Lương Thị Hồng 42 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Nghiên cứu lên men chủng Streptomyces sp S6 nhiệt độ khác nhau, đánh giá khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 thông qua HPLC Kết trình bày đây: Hàm lượng AVG 74,72 Hàm lượng AVG(mg/l 80 70 73,92 63,68 61,12 60 50 40 Hàm lượng AVG 30 20 10 26 28 30 32 Nhiệt độ( oC) Hình 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh tổng hợp AVG lên men Streptomyces sp.S6 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 Nghiên cứu khả sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 điều kiện pH khác nhau, kết trình bày bảng 3.5 : Lương Thị Hồng 43 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.5: Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng Streptomyces sp S6 TT Hàm lượng sinh khối (g/l) pH 12 24 36 48 60 72 6,2 2,11 3,26 3,36 3,38 3,39 3,42 6,4 5,01 5,88 5,91 5,93 5,96 5,98 6,6 6,57 7,02 7,06 7,10 7,12 7,14 6,8 7,05 8,84 8,85 8,86 8,88 8,88 7,0 6,78 7,13 7,16 7,20 7,23 7,23 7,2 6,22 6,56 6,67 6,69 6,71 6,72 7,4 3,14 3,43 3,45 3,48 3,50 3,53 Kết nghiên cứu cho thấy, pH 6,8 thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng Streptomyces sp S6, đạt sinh khối cao sau 24 lên men 8,84g/l pH cao thấp 6,8 cho sinh khối thấp Tiếp tục đánh giá khả sinh tổng hợp AVG pH khác nhau, kết trình bày Đánh giá khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 thông qua HPLC Kết trình bày hình 3.8: Hàm lượng AVG(mg/l) Hàm lượng AVG 80 70 60 50 40 30 20 10 74,88 65,92 67,84 61,44 56,8 41,76 30,88 Hàm lượng AVG 6,2 6,4 6,6 6,8 7,2 7,4 pH Hình 3.8: Ảnh hưởng pH đến sinh tổng hợp AVG dịch lên men chủng Streptomyces sp.S6 Lương Thị Hồng 44 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Kết nghiên cứu cho thấy, chủng Streptomyces sp S6 cho khả sinh tổng hợp AVG cao pH 6,8, pH thích hợp cho sinh trưởng, pH 6,8 pH thích hợp bền vững cho phản ứng hình thành tích lũy AVG 3.2.3 Ảnh hưởng độ oxy hòa tan đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 Từ nghiên cứu trước đây, tác giả lựa chọn độ oxy hòa tan tương ứng với độ lắc 240rpm tốc độ lân cận để khảo sát độ oxy hòa tan thích hợp cho sinh tổng hợp AVG Kết trình bày hình 3.9: Hàm lượng AVG 80 74,92 68,53 Hàm lượng AVG(mg/l) 70 60 70,08 75,05 72,43 67,42 58,56 50 40 Hàm lượng AVG 30 20 10 210 220 230 240 250 260 Tốc độ lắc(rpm) 270 Hình 3.9: Ảnh hưởng độ oxy hòa tan đến khả sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 Kết biểu đồ cho thấy, sinh tổng hợp AVG đạt cao độ oxy hòa tan tương ứng với tốc độ lắc 250 rpm, hàm lượng AVG không tăng tốc độ khuấy cao chủng Streptomyces sp S6 bão hòa nhu cầu oxy Hàm lượng AVG dịch lên men thấp tốc độ lắc thấp 250 tốc độ khuấy thấp không cung cấp đủ oxy cho sinh trưởng phát triển chủng, gây bất lợi cho hoạt động sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 Từ kết trên, tác giả lựa chọn độ oxy hòa tan Lương Thị Hồng 45 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp tương ứng với tốc độ lắc 250rpm tốc độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp chủng Streptomyces sp S6 3.2.4 Xác định thời gian lên men thích hợp cho sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 Để xác định thời gian thu hồi AVG thích hợp, tiến hành phân tích xác định hàm lượng AVG dịch lên men thời điểm khác Đề tài khảo sát lần khoảng nhiệt độ theo bố trí 12 kiểm tra lần kết sau: Bảng 3.6: Khảo sát khoảng thời gian thu hồi thích hợp hoạt chất AVG lên men từ chủng Streptomyces sp TT Thời gian (giờ) Hàm lượng AVG (mg/L) 12 46,33 24 50,15 36 53,46 48 58,25 60 72,04 72 75,05 84 75,05 96 75,05 108 75,05 10 120 75,05 Kết bảng 3.7 : cho thấy, hàm lượng AVG đạt cao sau thời gian lên men 72 không tăng thời điểm tiếp theo, từ kết trên, để xác định thời gian xác giúp tiết kiệm chi phí sản xuất sau này, đề tài tiến hành nghiên cứu tiếp khoảng thời gian lên men từ 60-72 để tìm thời gian thu hổi tối ưu hơn, kết trình bày bảng sau: Lương Thị Hồng 46 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Thời gian thu hồi AVG thích hợp Hàm lượng AVG (mg/L) 80 70 60 50 40 30 20 10 60 62 64 66 68 70 72 Thời gian (giờ) Hình 3.10: Thời gian thu hồi thích hợp hoạt chất AVG lên men từ chủng Streptomyces sp.S6 Kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng AVG sinh tổng hợp đạt cực đại 75,05mg/l sau 68 không tích lũy thời gian Từ kết nghiên cứu trên, đề tài lựa chọn thời điểm thích hợp để thu hồi AVG từ chủng Streptomyces sp S6 Là 68 Lương Thị Hồng 47 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN Đã lựa chọn nguồn C thích hợp cho sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 glucose Đã lựa chọn nguồn N thích hợp cho sinh tổng hợp AVG từ chủng Streptomyces sp S6 pepton với môi trường tương ứng Môi trường (MTN3) (g/l): glucose: 10,0, Pepton: 10,0, NaCl: 10,0, CaCO3: 2,0 Đã lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp AVG từ chủng Streptomyces sp S6 AVG-TH với thành phần sau: Glucose: 10,0 g/l, Pepton: 10,0 g/l, nước chiết thịt: 30ml/l; FeSO4.6H2O: 0,03g/l; MnCl2.2H2O: 0,01g/l; NaCl: 10,0 g/l; CaCO3: 2,0 g/l - Đã lựa chọn tỉ lệ tiếp giống thích hợp cho nhân nuôi ống nghiệm sang bình tam giác 107CFU/ml; Tỉ lệ tiếp giống thích hợp để nhân nuôi giống từ dịch tế bào lỏng sang môi trường lỏng 10%; Tỉ lệ tiếp giống hiệu cho lên men sinh tổng hợp AVG từ chủng Streptomyces sp S6 10% - Đã xác định nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 280C - Đã xác định pH 6,8 thích hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp S6 - Đã xác định độ oxy hòa tan thích hợp cho lên men sinh tổng hợp AVG từ chủng Streptomyces sp S6 tương ứng với tốc độ lắc 250rpm - Đã xác định thời gian thu hồi AVG lên men từ chủng Streptomyces sp S6 68 sau lên men Kiến nghị Cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu để tăng cường thêm khả sinh tổng hợp, tạo tích lũy AVG cao lên men sinh tổng hợp AVG từ chủng Streptomyces sp S6 Lương Thị Hồng 48 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh m t số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên Luận án Tiến sĩ Sinh học, chuyên ngành: Vi sinh vật học, Đại học Sư phạm Hà Nội Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 3-48 Cao Văn Thụ cộng (2010), Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29-Streptomyces microflavus, tạp chí khoa học công nghệ tập 48, số5, 2010 tr 105-111 Egorov N.X (1983), Thực tập Vi sinh vật, NXB Mir, Maxcơva Nguyễn Lân Dũng dịch, NXB ĐH&THCN Hà Nôi, Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006), Khảo sát đặc điểm vai trò chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii, Luận văn Thạc sỹ khoa học, Đại học sư phạm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng (2009), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục Việt Nam Nguyễn Thành Đạt (2000), Sinh h c vi sinh vật, NXB Giáo dục Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật h c, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Tài liệu tiếng anh AIDA, K., 1986, An overview of the micrpobial production of amino acids In: Biotechnology of amino acid production (eds K Aida, I Chibata, K Nakayama, K Takinami and H Yamada), vol 24, Kodansha Ltd., Tokyo 10.ALI, N.M., SHAKOORI, F.R AND SHAKOORI, A.R., 2011 Improvement in cysteine production by local bacterial isolates Pakistan J Zool., 43: 805-808 Lương Thị Hồng 49 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 11.Armstrong et al, 2010, Control of erwinia amylovora with vinylglycines and bacteria that produce vinylglycines, US 2010/0189798 A1 12.Bergey’s, 1989, Manual of Systematic Bacteriology, Vol Williams Wikins 13.DAS, K., ANIS, M., AZEMI, B.N.N.M AND ISMAIL, N., 1995 Fermentation and recovery of glutamic acid from palm waste hydrolysate by ion-exchange resin column Biotechnol Bioeng., 48: 551-555 14.David B Berkowitz et al, 2006, α-Vinylic amino acids: occurrence, asymmetric synthesis, and biochemical mechanisms, Tetrahedron: Asymmetry 17 (2006) 869–882 15.DAVIDL PRUES et al, 1973, Antimetabolites produced by microorganisms x1) l-2-amino-4- (2-aminoethoxy) - trans- 3-butenoic acid, Chemical Research Department, Hoffmann-La Roche Inc Nutley, New Jersey 07110, U S A 16.E B Shirling and D Gottlied, 1972, International Journal of Systematic Bacteriology, 22: 265-394 17.Farah Rauf Shakoori, 2012, Optimization of Fermentation Media for Enhanced Amino Acids Production by Bacteria Isolated from Natural Sources, Pakistan J Zool., vol 44(4), pp 1145-1157 18.Hidehiko Tanaka* et al, 1983, Synthesis of Amino Acids with Pyridoxal 5'-phosphate Enzymes, Bull Inst Chem Res., Kyoto Univ., Vol 61, No 19.Julius Berger et al,1975, Fermentative preparation of L-2-amino-4(2aminoethoxy) butanoic acid, United States Patent 3,865,694 20.Julius Berger, 1973, L-trans-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butenotc acid, US patent 3,751,459; 21.K Madhavan Nampoothiri, 1999, Fermentation and recovery of Lglutamic acid from cassava starch hydrolysate by ion-exchange resin Lương Thị Hồng 50 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp column, Rev Microbiol vol.30 n.3 São Paulo July/Sept ISSN 00013714 22.KARLSTORM, O., 1965 Methods for production of mutant suitable as amino acid fermentation micro-organisms Biotechnol Bioeng., 7:245268.; NADEEM, S AND AHMAD, M.S., 1999 Amino acid fermentation: a recent perspective Proc Pak Acad.Sci., 36: 193-206 23.Keith et al, 1980, D, L-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-trans-butenoic acid derivatives, United States Patent, 4,238,622 24.Khattab AA, Mohamed SAA (2012), Mutation induction and protoplast fusion of Streptomyces spp for enhanced alkaline protease production J Appl Sci Res.;8:807–814 25.Kuster E., and S.T Williams, (1964) Selection of media for isolation of streptomyces Nature (London) 202: 928 – 929 Method for isolation 26.MAJUMDAR, M K (Calcutta University, Calcutta, India), AND S K MAJUMDAR Effects of minerals on neomycin production by Streptomyces fradiae Appl Microbiol 13:190-193 1965 27.Mónica Fernández et al, 2004, Role of homoserine and threonine pathway intermediates as precursors for the biosynthesis of aminoethoxyvinylglycine in Streptomyces sp NRRL 5331, Microbiology (2004), 150, 1467–1474 28.Nonomura H., 1974, Ferment Technol., 52(20): 78-92 29.P.D.A.James, C Edwards and M Dawson (1991), the effect of temperature,pH and growth rate on secondary metabolism in Streptomyces thermoviolaceus grown in a chemostat 30.S A Waksman (1st ed., 1945; 2nd ed., 1947), Microbial Antagonisms and Antibiotic Substances, The Commonwealth Fund, N.Y., 31.S A Waksman (1919), Cultural studies of species of actinomyces, Soil Sci., 71-215 Lương Thị Hồng 51 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 32.S A Waksman, E S Horning, M Welsch, and H B Woodruff (1942), Distribution of antagonistic actinomycetes in nature, Soil Sci., 54 281296 33.Sunita Bundale et al (2015), Optimization of Culture Conditions for Production of Bioactive Metabolites by Streptomyces spp Isolated from Soil,Advances in Microbiology, 2015, 5, 441-451 34.Tsuyoshi Yasuta, Shigeru Satoh and Kiwamu Minamisawa, 1999, New Assay for Rhizobitoxine Based on Inhibition of 1-Aminocyclopropane-1Carboxylate Synthase, Appl Environ Microbiol 1999, 65(2):849 35.US Patent 3,751,459 (1973) 36.US Patent 3775255 37.Y Cuadrado et al, 2004, Characterization of the ask–asd operon in aminoethoxyvinylglycine-producing Streptomyces sp NRRL 5331, Appl Microbiol Biotechnol (2004) 64: 228–236 38.Yegneswaran PK, Gray MR, Thompson BG (1991) Effect of dissolved oxygen control on growth and antibiotic production in Streptomyces clavuligerus fermentations Tài liệu internet 39.http://vi.wikipedia.org/wiki/Streptomyces 40.http://www.chemspider.com/ChemicalStructure.4940920.html?rid=10adfb80-68bf-4095-9238-61e01fce96b7 41.http://www.globethesis.com/?t=2231330371992196 42.http://voer.edu.vn/c/vi-sinh-vat-hoc/7da56961/2022f46b 43.http://www.nature.com/ja/journal/v63/n8/full/ja201078a.html Lương Thị Hồng 52 Lớp: CNSH-1201 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp PHỤ LỤC Hình 1: Chủng Streptomyces sp.S6 Hình 2: Đối kháng với chủng ER Hình 3: Lên men Streptomyces sp.S6 Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình : Sắc kí HPLC AVG chuẩn Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 5: Định tính sinh tổng hợp AVG chủng Streptomyces sp.S6 sắc kí mỏng (TLC) Lương Thị Hồng Lớp: CNSH-1201 [...]... HD58 sinh tng hp cht khỏng sinh chng nm Fusarium oxysporum FO47 t cc i Theo nghiờn cu ca o Th Lng v cng s (2008), chng Streptomyces sp L30 sinh tng hp cht khỏng sinh thớch hp trong khong nhit t 28-300C Nm 2006, Bựi Th Vit H ó cụng b nhit 25-350C l nhit ti u cho 3 chng x khun Streptomyces T-41, Streptomyces D-42, Streptomyces TC-54 sinh cht khỏng sinh mnh [2].Theo cỏc nh khoa hc Vin Cụng ngh sinh. .. nhit thớch hp cho sinh trng v sinh tng hp khỏng sinh Vancomycin t chng x khun Streptomyces orientalis 4912 l 280C Cng cú mt s x khun thuc chng Streptomyces sp l x khun a nhit nh S thermoviolaceus cú s sinh trng nhit 25-57oC vi kh nng sinh tng hp khỏng sinh trong khong 30-55oC, nhng ti u 45oC (James & Edwards, 1989) i vi x khun Streptomyces. sp l vi sinh vt a m, nhit thớch hp cho s sinh trng v phỏt... S andalkalophilic Trong lờn men sn xut AVG t Streptomyces sp X-11085, pH tớch hp cho sinh trng, phỏt trin v sinh tng hp AVG l 6,8 (US Patent 3,775,255) 1.2.2.3 Nhu cu v oxy v s thụng khớ trong quỏ trỡnh lờn men * hũa tan ca oxy trong nc T bo s dng ụxy hụ hp v lm gim lng ụxy trong mụi trng Vỡ th trong nuụi cy hiu khớ phi cung cp ụxy mt cỏch u n Thiu ụxy nht thi ti mt thi im no ú trong mụi trng s dn... cha sinh khi x khun em sy nhit 1050C n khi lng khụng i 2.2.1.3 nh tớnh bng sc ký bn mng (TLC): Mu xỏc nh AVG: dch lờn men chng Streptomyces sp. S6 sau li tõm: bo t chng Streptomyces sp. S6 c nuụi cy trong mụi trng TBO 300C sau ú chuyn sang lờn men mụi trng YEPEG Sau 72 gi nuụi cy (3 ngy), dch lờn men c ly tõm 8000v/ph trong 15 phỳt 4 0C loi b xỏc t bo, thu dch ni Ly dch ni xỏc nh AVG + Chun AVG: ... 2448h , tuy nhiờn vi chng Streptomyces clavuligerus DAUFPE-3133 v Streptomyces clavuligerus DAUFPE-3094 li cn thi gian khong 72 gi t nng sinh khi ti a Sau 96 gi cỏc giai on tng trng (logarit) ca sinh vt thng dng li (Viana et al, 2010; Viana Marques et al, 2011) Trong lờn men sn xut AVG t Streptomyces sp X-11085, thi gian nuụi cy cho sinh trng l 72 gi, thi gian lờn men cho thu hi AVG l 41 gi (US Patent... mt trong peroxyd dismutase, carboxylase ciitric synthetase Mo Cú mt trong reductase nitrate, nitrogenase, dehydrogenase formic Se Cú mt trong reductase glycin, reductase formic Co Cú mt trong mutase glutamic Cu Cú mt trong cytochrome oxydase W Cú mt trong dehydrogenase formic Br Cú mt trong urease, cn cho s sinh trng ca vi khun hydrogen Nu thiu nguyờn t vi lng trong quỏ trỡnh sinh trng thỡ hot tớnh sinh. .. Cụng ngh lờn men sn xut ch phm AVG t x khun Streptomyces. sp Chng Streptomyces sp X-11085 c phõn lp t Arlington, bang California v c b sung vo b su tp NRRL ca Hoa K di tờn Streptomyces sp NRRL 5331 Bo t chng Streptomyces sp X-11085 t mụi trng dinh dng cy vo 2 bỡnh tam giỏc, mi bỡnh dung tớch 6 lớt cha 2 lớt mụi trng dch Trypti case soy (Baltimore Biological Laboratories) Nuụi cy 280C trong 72 gi trờn... chung 2.2.1.1 Chun b dch lờn men cho kim tra hot tớnh AVG Bo t chng Streptomyces sp c nuụi cy trong mụi trng TBO 300C sau ú chuyn sang lờn men Sau 72 gi nuụi cy (3 ngy), dch lờn men c ly tõm 8000v/ph trong 15 phỳt 4 0C loi b xỏc t bo, thu dch ni Ly dch ni xỏc nh AVG Lng Th Hng 28 Lp: CNSH-1201 Vin i hc M H Ni Khúa lun tt nghip 2.2.1.2 Xỏc nh hm lng sinh khi khụ Dch lờn men c lc qua giy lc Whatman... sc khớ 1VVM m bo lng khỏng sinh c sn xut l ln nht Trong lờn men sn xut AVG t Streptomyces sp X-11085, oxy hũa tan trong nhõn ging cp 1 tng ng vi tc lc 200rpm, trong tank l 85l/phỳt v khuy 200rpm (US Patent 3,775,255) Lng Th Hng 21 Lp: CNSH-1201 Vin i hc M H Ni Khúa lun tt nghip 1.2.2.4 Thi gian nuụi cy thớch hp cho lờn men sn xut cỏc hp cht amino acid t chng Streptomyces sp Thi gian nuụi cy cú nh... khỏng sinh( Ketaki Basak and S K Majumdar, 1975) Nhỡn chung i vi chng Streptomyces sp cỏc khoỏng cht nh phospho (Martin, 2004), kali, st, km v mangan cp mc vt (liu lng nh) lm tng mc sn xut khỏng sinh (Gesheva, Ivanova, & Genava 2005) 1.2.1.4 Mt s mụi trng dinh dng thớch hp cho lờn men sinh tng hp cỏc hot cht t chng x khun Streptomyces. sp Cỏc nghiờn cu cho thy, mi chng khỏc nhau v tựy mi mc ớch lờn men