Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Hữu Nghị, NCS Ths Vũ Đình Giáp, Ths Đỗ Thị Nhuân toàn thể cán công tác phòng Sinh học Thực nghiệm – Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mọi người yêu quý, tận tình hướng dẫn, bảo ban, giúp đỡ trình thực tập phòng Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội tận tình giảng dạy, giúp đỡ suốt trình học tập khoa Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên tạo điều kiện cho học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 22 tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Hà Bích Huyền Nguyễn Hà Bích Huyền CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………1 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………… 1.1 Giới thiệu nấm ………………………………………………… 1.1.1 Nấm đảm Basidiomycota…………………………………………9 1.1.2 Nấm túi Ascomycota 11 1.1.3 Nấm Aureobasidium pullulans 13 1.2 Lignocellulose………………………………………………………… …15 1.2.1 Cellulose 17 1.2.2 Hemicellulose 18 1.2.3 Lignin 19 1.3 Enzyme esterase……………………………………………………… 13 1.3.1 Carbohydrate esterase 13 1.3.2 Acetyl esterase 21 1.4 Vai trò enzyme thủy phân từ nấm chuyển hóa carbohydrate 16 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………23 2.1 Vật liệu… …………………………………………………………… 23 2.1.1 Chủng nấm 23 2.1.2 Máy móc thiết bị dụng cụ thí nghiệm 23 2.1.3 Môi trường 24 2.2.Phương pháp nghiên cứu…….………………………………………… 25 2.2.1 Phương pháp lên men dịch thể 25 2.2.2 Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 25 2.2.3 Xác định pH nuôi cấy thích hợp 26 2.2.4 Phương pháp tách chiết tinh enzyme 26 Nguyễn Hà Bích Huyền CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.2.5 Phương pháp xác định protein tổng số 27 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme acetyl esterase 27 2.2.7 Điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) 27 2.2.8 Xác định nhiệt độ pH tối ưu enzyme acetyl esterase 28 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………….29 3.1 Nguồn chất thời gian nuôi cấy tối ưu.…………………………….29 3.2 Nhiệt độ thích hợp sinh tổng hợp enzyme acetyl esterase………………31 3.3 pH thích hợp tổng hợp enzyme acetyl esterase…………………………31 3.4 Tinh acetyl esterase từ môi trường nuôi cấy A pullulans…………32 3.4.1 Kết nghiên cứu điều kiện chiết tách enzyme 32 3.4.2 Tinh qua cột sắc ký trao đổi ion sắc ký lọc gel 34 3.5 Đặc tính acetyl esterase từ nấm A.pullulans……………………… 37 3.6 Nhiệt độ pH tối ưu enzyme… ……………………………… 38 KẾT LUẬN.…………………………………………………………………39 KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………… 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………41 PHỤ LỤC …………………………………………………………………45 Nguyễn Hà Bích Huyền CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT SDS-PAGE Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ApoAE Acetyl esterase từ nấm Audreobasidium pullulans DEAE Diethylaminoethyl Sm Acid amin nhỏ XAA Acid amin Ser Serin His Histidine Asp Aspartie Glu Glutamic Trp Tryptophan Nguyễn Hà Bích Huyền CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1: Một đại diện ngành Ascomycota, nấm Bisporella citrine phát triển gỗ mục Hình 2: Nấm Aureobasidium pullulans đĩa thạch hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) khuẩn ty bào tử nấm Hình 3: Lignocellulose thành phần cấu tạo 10 Hình 4: Cấu trúc Cellulose 11 Hình 5: Các đơn vị lignin 13 Hình 6: Nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase phức hệ ba xúc tác 14 Hình 7: Hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off thiết bị amicon Ultra Centrifugal Filters 21 Hình 8: Động học sinh tổng hợp acetyl esterase nấm Aureobasidium pullulans var nambiae môi trường sử dụng chất rơm 24 Hình 9: Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh tổng enzyme acetyl esterase môi trường nuôi cấy lỏng chủng Aureobasidium pullulans var namibiae 25 Hình 10: Ảnh hưởng pH lên sinh tổng enzyme acetyl esterase môi trường nuôi cấy lỏng chủng Aureobasidium pullulans var namibiae 26 Hình 11: Tinh acetyl esterase qua bước sắc ký lỏng: sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose sắc ký lọc gel SuperdexTM 75 30 Hình 12: Protein tinh biểu hoạt tính acetyl esterase (ApoAE) gel điện di SDS-PAGE 31 Hình 13: Nhiệt độ pH enzyme acetyl esterase tinh từ dịch nuôi cấy nấm Aureobasidium pullulans var namibiae điều kiện nhiệt độ pH khác 32 Nguyễn Hà Bích Huyền CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần số nguồn sinh khối giàu lignocellulose 10 Bảng 2: Kết cô, chiết tách protein enzyme từ dịch nuôi cấy nấm 27 Bảng 3: Các bước tinh protein enzyme có hoạt tính acetyl esterase 29 Nguyễn Hà Bích Huyền CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Carbohydrate cấu tạo nên hầu hết vật chất hữu Trái Đất, chúng có nhiều vai trò quan trọng thể sống tích trữ vận chuyển lượng (tinh bột, glycogen) tham gia vào thành phần cấu trúc (như cellulose thực vật chitin động vật) Sinh khối thực vật nguồn carbohydrate có khả tái tạo lớn trái đất, quang tổng hợp khoảng 200 tỷ năm, lignocellulose chiếm 60% tổng sinh khối (Pérez et al 2002, Zhang et al 2007) Lignocellulose từ sinh khối thực vật polymer sinh học có tất hệ sinh thái đất liền nguồn hợp chất hữu tái tạo lớn sinh (Peters 2007) Việt Nam nước nhiệt đới kinh tế phụ thuộc chủ yếu vào sản xuất nông nghiệp, có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, sản lượng trồng dồi nguồn phụ phẩm lignocellulose thu lớn Tuy nhiên trình độ kinh tế, khoa học kỹ thuật chưa cao, lignocellulose để huỷ loại tự nhiên sử dụng cách thô sơ theo tập quán (làm thức ăn gia súc, đốt, ủ compost) với hiệu thấp Để sử dụng nguồn sinh khối cách hiệu cần phải can thiệp vào cấu trúc thay đổi tính chất vật liệu đầu vào cho phù hợp với sản phẩm mong muốn Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo vững thành phần cellulose, hemicellulose lignin nên để phá hủy phần toàn chúng, người ta sử dụng phương pháp hóa - lý xử lý nhiệt độ, áp suất cao, axit mạnh hay kiềm mạnh Do chi phí để xử lý thường cao gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường sinh thái tự nhiên nên phương pháp không ứng dụng rộng rãi Ngoài ra, lignocellulose có liên kết ester Nguyễn Hà Bích Huyền CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp polysaccharit thành tế bào đơn vị acid hydroxycinnamic lignin; liên kết cầu nối chuỗi xylan, xylan với lignin Để tách riêng phần lignin khỏi cấu trúc lignocelluloses dễ dàng phân hủy thành chất đơn giản dễ xử lý mang tính ứng dụng cao thực tiễn cần sử dụng chất xúc tác sinh học – enzyme thủy phân liên kết ester cấu trúc lignocellulose Đó enzyme thủy phân carbohydrate esterase (CE) bao gồm: acetyl esterase (EC 3.1.1.6) feruloyl esterase (EC 3.1.1.73) Đặc biệt, enzyme acetyl esterase có liên quan đến chuyển hóa xylan công cụ quan trọng nghiên cứu chế cấu trúc thành tế bào thực vật Việc sử dụng enzyme giai đoạn đầu trình chuyển hóa phá vỡ phần cấu trúc loại bỏ phần thành tế bào thực vật (Benoit I, 2006) Do đó, phức hợp lignin - cacbohydrate trở nên dễ bị công xúc tác enzyme hòa tan sản phẩm chuyển hóa trở nên tốt Enzyme thủy phân carbohydrate esterase tìm thấy loài nấm Trong số loài nấm đó, nấm Aureobasidium pullulans biết đến nấm có tầm quan trọng cao ứng dụng nhiều công nghệ sinh học để sản xuất siderophores (chất mang Fe3+) enzyme có liên quan đến chuyển hóa lignocellulose Từ sở trên, chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu, tách chiết tinh enzyme acetyl esterase từ nấm Aureobasidium pullulans var namibiae” Mục tiêu đề tài nhằm: - Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho trình lên men sinh tổng hợp enzyme acetyl esterase chủng nấm Aureobasidium pullulans var namibiae chất giàu lignocellulose - Tách chiết, tinh nghiên cứu đặc tính enzyme acetyl esterase Nguyễn Hà Bích Huyền CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nấm Giới Nấm nhóm sinh vật đơn ngành nhân thực dị dưỡng với thành tế bào cấu tạo chitin; giới riêng biệt lớn với khoảng 1,5 triệu loài, có nguồn gốc hoàn toàn khác biệt so với sinh vật có hình thái tương tự nấm nhày (Myxomycetes) hay Mốc nước (Oomycetes) Chúng sống phần lớn đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh ký sinh thể thực vật, động vật Nấm phần lớn phát triển dạng sợi đa bào gọi sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), số loài khác lại phát triển dạng đơn bào Quá trình sinh sản (hữu tính vô tính) thường qua bào tử, tạo cấu trúc đặc biệt hay thể Một số loài lại khả tạo nên cấu trúc sinh sản đặc biệt nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng Một số đại diện tiêu biểu giới nấm Nấm men, Nấm mốc Nấm lớn Nấm diệp lục, sống hoại sinh khả sử dụng trực tiếp chất dinh dưỡng lại tiết enzyme vào môi trường xung quanh để phân hủy phân tử phức tạp thành chất hòa tan để nấm hấp thụ Trong số loài nấm sợi có khả tiết enzyme có khả phân hủy tốt Đó phân giới Dikarya - Nấm bậc cao, bao gồm hai ngành Ascomycota – Nấm túi Basidiomycota - Nấm đảm, hai ngành có nhân kép, chúng có dạng sợi đơn bào, lông roi 1.1.1 Nấm đảm Basidiomycota Đa phần loài nấm lớn thuộc ngành này, nấm đảm sản xuất bào tử đảm chứa thân hình dùi gọi đảm Hệ sợi nấm nấm đảm phát triển, sợi nấm có vách ngăn ngang chưa hoàn chỉnh Sinh sản vô tính bào tử đính, sinh sản hữu tính bào tử đảm hình thành đảm Quá trình sinh sản hữu tính diễn sau: Các bào tử đảm Nguyễn Hà Bích Huyền CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp hình thái giống mặt sinh lý có khác nhau, nảy mầm cho loại sợi nấm sơ cấp khác tính (gọi sợi âm sợi dương) Mỗi tế bào sợi mang nhân đơn bội Khi tế bào đầu sợi gặp kết hợp thành tế bào nhân phát triển thành sợi thứ cấp có đời sống kéo dài Ðến lúc tế bào đầu sợi mọc ống nhỏ hướng phía gốc tế bào, hai nhân phân chia thành 4, đồng thời xuất vách ngăn, tách thành tế bào: tế bào đỉnh chứa nhân, tế bào ống tế bào chân gốc chứa nhân (2 tế bào sau hợp lại thành tế bào có nhân) Tế bào đỉnh phát triển thành đảm: nhân kết hợp với phân chia liên tiếp lần, lần đầu giảm nhiễm, nhân Tế bào phình to ra, phía mọc u nhỏ, nhân chui vào u biến thành bào tử đảm mọc bên đảm Cũng nấm túi, đảm hình thành trực tiếp hệ sợi nấm nằm thể bảo vệ lớp mô giả sợi nấm phát triển cài chặt lại, khác với thể nấm túi, thể nấm đảm sợi thứ cấp tạo nên Tùy theo cách hình thành đảm vách ngăn mà phân chia loại đảm: - Đảm đơn bào (hay đảm không vách) gặp phần lớn nấm đảm - Đảm đa bào (hay đảm có vách ngăn ngang vách ngăn dọc) Phân loại: dựa vào đặc điểm đảm, số tác giả chia lớp nấm đảm thành phân lớp: - Phân lớp nấm đảm đơn bào (Holobasidiomycetidae) - Phân lớp nấm đảm đa bào (Phragmobasidiomycetidae) - Phân lớp nấm đảm có bào tử đông (Teliosporomycetidae) Nguyễn Hà Bích Huyền 10 CNSH 12-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp dung môi phân cực axeton, ethanol muối vô ammonium sulfate nồng độ cuối khác (40, 50, 55, 60, 65 70%; v/v) Quá trình tủa protein tiến hành 4oC 12 giờ, sau ly tâm thu cặn protein Các phân đoạn thu sau ly tâm bay dung môi hòa lại với đệm phosphate 10mM (pH 6,0) để xác định hàm lượng protein hoạt lực enzyme Nhìn chung, kết thu cho thấy nồng độ protein tổng hoạt tính acetyl esterase phân đoạn tủa muối ammonium sulfate thấp, phân đoạn tủa aceton nồng độ protein cao hoạt tính enzyme không cao Nồng độ protein hoạt lực acetyl esterase cao xác định phân đoạn tủa ethanol với nồng độ dung môi 60% (v/v) hoạt lực enzyme 125,1U mg-1 (Bảng 2) Bên cạnh đó, phương pháp lọc 10 kDa cut-off 11oC nghiên cứu so sánh Ở phương pháp cho thấy lượng protein thu tương đối thấp (do protein có trọng lượng phân tử [...]... 3.4.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel Sơ đồ quy trình tinh sạch: Dịch chiết thô Siêu lọc 10 kDa cut-off Sắc ký trao đổi anion DEAE Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75 Enzyme acetyl esterase tinh sạch Dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 3 tuần được cô đặc bằng siêu lọc (màng lọc 10 kDa cut-off) Sau đó protein enzyme biểu hiện hoạt tính acetyl esterase được tinh sạch. .. thang pH khác nhau là 5; 5,5; 6; 7 và 8 Thu sinh khối, thử hoạt tính enzyme và so sánh để từ đó tìm ra giá trị pH thích hợp nhất cho nấm phát triển sinh enzyme cao 2.2.4 Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện tối ưu, dịch lên men nấm được lọc sơ bộ qua vải thô và giấy lọc Dịch chiết có hoạt tính enzyme esterase được loại khuẩn ty nấm và cơ chất bằng ly tâm 5000-10000... nghiệp Hình 8: Động học sinh tổng hợp acetyl esterase của nấm Aureobasidium pullulans var namibiae trên môi trường sử dụng cơ chất rơm Theo nghiên cứu này hoạt tính enzyme acetyl esterase A pullulans cao hơn rất nhiều so với chủng Xylaria polymorpha (X polymorpha) mà tác giả Đỗ Hữu Nghị & cs, (2015) đã nghiên cứu, theo đó hoạt tính acetyl esterase là 989,73 UL-1 của nấm A pullulans lớn hơn so với chủng X... là pH 7 Tại đây hoạt tính enzyme acetyl esterase của chủng A pullulans đạt giá trị cao nhất 1567,7 U/l và thấp nhất 343,2 U/l tại pH 5, tại pH 7 sinh khối thu được cũng là cao nhất 4,3 g/l 3.4 Tinh sạch acetyl esterase từ môi trường nuôi cấy A pullulans 3.4.1 Kết quả nghiên cứu điều kiện chiết tách enzyme Để thu được lượng dịch lên men đủ lớn cho các nghiên cứu tiếp theo khi enzyme được sinh tổng hợp... 2012) Một trong số các carbohydrate esterase tham gia vào chuyển hóa lignocellulose là enzyme acetyl esterase 1.3.2 Acetyl esterase Acetyl esterase (EC 3.1.1.6) là enzyme thủy phân xúc tác cho phản ứng giải phóng nhóm acetyl từ các polysaccharit acetyl hóa như pectin hay xylan của lignocellulose (Biely, 2012) Acetyl esterase cùng với hệ enzyme thủy phân cellulose và xylan đóng vai trò quan trọng trong... enzyme acetyl esterase và sinh khối của các dịch nuôi cấy được thể hiện hình 9 Hình 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh tổng hợp acetyl esterase trên môi trường nuôi cấy lỏng của chủng Aureobasidium pullulans var namibiae Hoạt tính enzyme acetyl esterase của chủng A pullulans trong dải nhiệt độ từ 230C đến 370C như sau: Tại nhiệt độ t = 280C hoạt tính acetyl esterase đạt cực đại là 112336 U/L và thấp nhất... bốn loài Aureobasidium pullulans được công nhận từ các đặc điểm vùng sinh thái khác nhau là: var pullulans trên các cơ chất có tính thẩm thấu thấp và lá cây; var melanogenum từ môi trường gần các nguồn nước; var subglaciale từ các vùng lạnh và băng giá; và var namibiae được mô tả chỉ có một chủng phân lập từ đá cẩm thạch và bột đôlômit ở Namibia (Zalar et al, 2008) Hình 2: Nấm Aureobasidium pullulans. .. CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Chủng nấm Chủng giống để nghiên cứu điều kiện tối ưu sinh tổng hợp enzyme acetyl esterase là chủng nấm Aureobasidium pullulans var nambiae (A Pullulans) Chủng nấm trên được phân lập từ các mẫu vật thu được từ vườn Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Nấm A Pullulans được phát triển trên... thực vật bởi hệ enzyme thủy phân Trong số các sinh vật phân hủy lignocellulose, các loài nấm thuộc Basidiomycota và Ascomycota được biết là có hệ xúc tác sinh học hiệu quả nhất và được chia thành 3 nhóm: nấm mục trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm Trong khi có nhiều nghiên cứu tập trung vào nhóm nấm mục trắng và mục nâu (chủ yếu thuộc ngành Basidiomycota), có rất ít các nghiên cứu trên hệ enzyme chuyển... enzyme acetyl esterase Để xác định nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối và sinh tổng hợp enzyme acetyl esterase chủng nấm A pullulans, chúng tôi tiến hành xác định với môi trường nuôi cấy được bổ sung thêm nguồn cơ chất rơm, pH được điều chỉnh về pH 7 Nấm được nuôi cấy dưới điều kiện lắc 200 vòng/phút trong dải nhiệt độ khác nhau: 23oC, 25oC, 28oC, 30oC và 37oC Kết quả đo hoạt độ enzyme acetyl