KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Khóa luận nà hoàn thành phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam i đ u ti n xin gửi l i cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Nguy n Mạnh Cư ng công tác làm việc phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên – ngư i th dạy dỗ, bảo tận tình suốt trình thực đề tài khóa luận ôi xin gửi l i cảm ơn đến toàn thể anh ch cán phòng thí nghiệm giúp đỡ hướng dẫn nhiệt tình tạo điều kiện cho trình nghiên cứu Tôi xin chân thành gửi l i cảm ơn đến th y cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội tru ền cho kiến thức bổ ích suốt năm học tập đâ Cuối gửi l i cảm ơn đến gia đình bạn bè điểm tựa tinh th n vững giúp đỡ th i gian thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh viên thực Nguy n Th H n gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU PHẦN I : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Paramignya 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Paramignya 1.1.2 Phân bố chi Paramignya 1.1.3 Phân loại chi Paramignya 1.1.4 Tác dụng dược lý chi Paramignya 1.1.5 Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Paramignya 1.1.5.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 1.1.5.2 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 11 1.2 Tổng quan Xáo tam phân (Paramignya trimera) 12 1.2.1 Đặc điểm thực vật 12 1.2.2 Phân bố 13 1.2.3 Tác dụng dược lý 13 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu bảo vệ gan 14 1.3.1 Phương pháp gây độc paracetamol 14 1.3.2 Phương pháp xét nghiệm 15 1.3.3 Phương pháp kiêm tra trực quan 15 1.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 15 PHẦN II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU VÀ THỰC NGHIỆM 16 2.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.1.2.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 16 2.1.2.2 Phương pháp phân lập 16 2.1.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 19 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2.1.2.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 20 2.2 Thực nghiệm 21 2.2.1 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 21 2.2.2 Thu mẫu tạo dịch chiết từ thân, rễ Xáo tam phân 21 2.2.2.1 Thu mẫu xử lý mẫu 21 2.2.2.2 Tạo dịch chiết từ thân rễ Xáo tam phân 21 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan dịch chiết clorofom 23 2.2.3.1 Nghiên cứu tác dụng dịch chiết clorofom gây độc paracetamol 23 2.2.3.2 Xét nghiệm 24 2.2.3.3 Làm tiêu mô bệnh học gan 25 2.2.3.4 Xử lý số liệu 27 2.2.4 Phân tích sắc ký TLC phân tách phần chiết clorofom (B) 27 2.2.4.1 Phân tích sắc ký TLC 27 2.2.4.2 Phân tách phần chiết clorofom (B) 28 2.5 Dữ kiện phổ hợp chất phân lập 29 2.5.1 Hợp chất MC-390 29 2.5.2 Hợp chất MC-392 30 2.5.3 Hợp chất MC-393 30 2.5.4 Hợp chất MC-424 31 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan dịch chiết clorofom (HCTN106) từ thân rễ Xáo tam phân 32 3.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết clorofom lên nồng độ aminotransferase (AST, ALT) huyết 32 3.1.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết clorofom lên nồng độ protein toàn phần 33 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.1.3.Kết nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết clorofom lên nồng độ cholesterol toàn phần 34 3.1.4 Kiểm tra ảnh hưởng dịch chiết clorofom đến khối lượng gan 35 3.1.5 Kết kiểm tra trực quan dịch chiết clorofom đến gan 36 3.1.6 Kết làm tiêu mô bệnh học gan 38 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ dịch chiết clorofom 40 3.2.1 Cấu trúc hợp chất MC – 390 (Chất mới) 40 3.2.2 Cấu trúc hợp chất MC- 392 (Chất mới) 41 3.2.3 Cấu trúc hợp chất MC–393 43 3.2.4 Cấu trúc hợp chất MC- 424 ( Chất ) 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH M C CÁC TỪ VIẾT TẮT TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography Sắc ký cột Mini - C Mini Column Chromatography Sắc ký cột tinh chế Proton-Nuclear H-NMR 13 C-NMR proton Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 Polarization Transfer Electron Spray Ionization-Mass ESI-MS Spectrometry HR-ESI-MS HSQC Resonance Distortionless Enhancement by Phổ DEPT DEPT HMBC Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ khối lượng ion hoá phun mù điện tử High Resolution Electronspray Phổ khối lượng phân giải Ionization Mass Spectrum Heteronuclear Mutiple Connectivity cao phun mù điện tử Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân Coherence Spectroscopy HCTN qua liên kết Hợp chất thiên nhiên AST Aspartate aminotransferase Enzym chuyển hóa aspartat ALT Alanine aminotransferase Enzym chuyển hóa alanine gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH M C BẢNG BIỂU Bảng 1: Hiệu suất thu nhận trình chiết 23 Bảng 2: Phân tích TLC phần chiết clorofom (B) 27 Bảng 3: Ảnh hưởng dịch chiết HCTN106, HCTN107 lên nồng độ aminotransferase (AST, ALT) huyết chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=5) 32 Bảng 4: Ảnh hưởng dịch chiết HCTN106, HCTN107 lên nồng độ protein toàn phần huyết chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=5) 33 Bảng 5: Ảnh hưởng dịch chiết HCTN106, HCTN107 lên nồng độ cholesterol toàn phần huyết chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=5) 34 Bảng 6: Khối lượng gan chuột lô thí nghiệm 35 Bảng 7: Quan sát hình thái trực quan gan chuột lô thí nghiệm 36 Bảng 8: Bảng tổng hợp kết chất phân lập 47 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH M C HÌNH VẼ Hình : Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ vỏ thân P.monophylla Hình 2: Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ vỏ thân Hình 3: Cấu trúc hóa học hợp chất Glycosit phân lập từ phần chiết nước P scandens 10 Hình 4: Cấu trúc hóa học Ostruthin 10 Hình 5: Cấu trúc hai hợp chất Tirucalane 11 Hình 6: Thân rễ Xáo tam phân 13 Hình 7: Mô tả sắc ký mỏng 18 Hình 8: Mô tả sắc ký cột 19 Hình 9: Đồ thị biểu khối lượng gan chuột sau thí nghiệm 36 Hình 10: Gan chuột cho uống NaCl 0.9% 37 Hình 11: Gan chuột cho uống NaCl 0.9% +PAR 400mg/kg 37 Hình 12: Gan chuột cho uống SPO3 10g/kg+PAR 400mg/kg 37 Hình 13: Gan chuột cho uống SPO4 10g/kg+PAR 400mg/kg 37 Hình 14: Gan chuột cho uống Silymarin 50 mg/kg+PAR 400mg/kg 37 Hình 15: Tiêu gan mẫu đối chứng PAR 38 Hình 16: Tiêu gan thử với dịch chiết HCTN106 39 Hình 17: Tiêu gan mẫu đối chứng dương Silymarin 39 Hình 18: Tiêu gan mẫu đối chứng âm 39 Hình 19: Cấu trúc hóa học hợp chất MC-390 40 Hình 20: Tương tác phổ HMBC NOESY hợp chất MC-390 41 Hình 21: Cấu trúc hóa học hợp chất MC-392 41 Hình 22: Tương tác phổ COSY, HMBC NOESY hợp chất MC392 43 Hình 23: Cấu trúc hóa học hợp chất MC-393 43 Hình 24: Tương tác phổ COSY, HMBC, NOESY hợp chất 44 Hình 25: Cấu trúc hóa học hợp chất MC- 424 44 Hình 26: Tương tác phổ COSY, HMBC, NOESY hợp chất MC-424 45 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH M SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Quá trình chuyển hóa paracetamol tạo thành NAPQI 15 Sơ đồ 2: Quy trình tạo dịch chiết phân đoạn từ thân, rễ Xáo tam phân 22 Sơ đồ 3: Quy trình phân lập hợp chất từ phân đoạn Clorofom (B) 29 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Việc sử dụng thuốc Tây lâu dài hay dùng nhiều nguyên nhân làm cho quan thể chịu nhiều tác dụng không mong muốn Gan thận quan có chức chuyển hóa thải trừ loại thuốc sau hết tác dụng dược lý Chính hai quan thường bị ảnh hưởng nhiều dẫn đến việc chức chúng bị suy giảm Từ ngàn xưa, ông cha ta biết đến thuốc cổ truyền bào chế từ thảo dược có tác dụng hữu hiệu phòng, trị bệnh Tác dụng chữa bệnh, tăng cường sức khỏe thảo dược người chủ yếu hợp chất tự nhiên sẵn có mà chúng sinh tổng hợp, tích lũy trình sinh trưởng phát triển Do sử dụng chúng để phòng trị bệnh thời gian dài mà không gây độc hại cho thể không xuất hiện tượng kháng thuốc Đây ưu điểm bật vị thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên Nhiều thuốc tác dụng chữa bệnh mà giúp cân lại âm dương Ngoài công dụng chữa bệnh mạn tính, số thuốc chữa bệnh cấp tính, nan y ung thư cổ tử cung, ung thư gan, ung thư đại tràng, viêm gan siêu vi, viêm gan cấp tính… có hiệu cao Việt Nam có lợi nằm khu vực nhiệt đới, nước có y học cổ truyền phát triển từ lâu đời Việc đào sâu tìm kiếm phát thuốc, hoạt chất thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viên gan, ung thư gan nhà khoa học nước quan tâm nghiên cứu Gần đây, báo điện tử tỉnh Khánh Hòa số báo in khác có đăng tin loài Xáo tam phân (Paramignya trimera) xã Ninh Vân, tỉnh Khánh Hòa có khả chữa bệnh xơ gan cổ trướng Theo báo chí, số người bị bệnh xơ gan giai đoạn cuối sử dụng thuốc sắc từ rễ thân gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP thuốc chữa khỏi bệnh [1] Loài chưa nghiên cứu cụ thể nước nước Do vậy, đề tài này, tiến hành nghiên cứu xác định thành phần hóa học, hoạt chất có tác dụng bảo vệ gan thuốc Xáo tam phân (Paramignya trimera) họ Rutaceae Việt Nam nhằm tạo tiền đề cho việc phát triển hiệu dược liệu việc điều trị bệnh gan nói riêng bệnh khác nói chung Theo hướng nghiên cứu ấy, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng bảo vệ gan Xáo tam phân (Paramignya trimera) họ Rutacea Việt Nam” Khóa luận gồm nội dung sau: - Thu mẫu thực vật tạo dịch chiết phân đoạn - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan dịch chiết thân rễ Xáo tam phân mô hình chuột BALB/c gây độc gan paracetamol - Phân lập hợp chất từ phân đoạn CHCl3 thân rễ Xáo tam phân - Kết xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ phân đoạn CHCl3 thân rễ Xáo tam phân gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN PH L C gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Intens x105 +MS, 0.1-0.2min #(4-13) 324.0878 288.2909 244.2644 625.1780 926.2721 100 200 300 400 500 600 700 Phụ lục 1: Phổ HR-ESI-MS (+) hợp chất MC-390 Phụ lục 2: Phổ 1H- NMR hợp chất MC-390 gu n h n 800 900 m/z KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR/DEPT hợp chất MC-390 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 4: Phổ HMBC hợp chất MC-390 Phụ lục 5: Phổ NOESY hợp chất MC-390 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 6: Phổ 1H- NMR hợp chất MC-392 Phụ lục 7: Phổ COSY hợp chất MC-392 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 8: Phổ 13C- NMR/DEPT hợp chất MC-392 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 9: Phổ NOESY hợp chất MC-392 Phụ lục 10: Phổ HMBC hợp chất MC-392 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 11: Phổ 13C-NMR/DEPT MC-393 Phụ lục 12: Phổ 1H- NMR hợp chất MC-393 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 13: Phổ 13C- NMR/DEPT MC-393 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 14: Phổ COSY MC-393 Phụ lục 15: Phổ NOESY MC-393 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 16: Phổ HMBC MC- 393 Phụ lục 17: Phổ 1H-NMR hợp chất MC-424 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 18: Phổ 13C-NMR/DEPT hợp chất MC-424 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 19: Phổ NOESY hợp chất MC-424 Phụ lục 20: Phổ COSY hợp chất MC- 424 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 21: Phổ HMBC hợp chất MC-424 gu n h n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP gu n h n [...]... tính sinh học Sau khi nhóm tác giả Nguyễn Mạnh Cường công bố kết quả ban đầu về thành phần hóa học rễ cây Xáo tam phân gồm ninhvanin, ostruthin [18], Viện Dược liệu đã công bố trên Tạp chí Dược liệu về nghiên cứu nghiên cứu thành phần hoá học, độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan và tác dụng gây độc tế bào ung thư của cây Xáo tam phân [16] Viện Dược liệu đã chỉ ra rằng loài cây này có chứa hợp chất có... khi nghiên cứu thành phần hoá học, độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan và tác dụng gây độc tế bào ung thư của cây Xáo tam phân Viện Dược liệu đã chỉ ra rằng cây có chứa hợp chất có tên là Ostruthin (19), qua các thử nghiệm lâm sàng trên chuột cho thấy hợp chất này có hoạt tính bảo vệ gan tốt nhưng chưa có khả năng ức chế 5 dòng tế bào ung thư [16] Hình 4: Cấu trúc hóa học cả Ostruthin Năm 2014, nhóm nghiên. .. trên máy Boetius tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam gu n h n 19 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - Phổ hồng ngoại (FT- IR): phổ hồng ngoại được đo trên máy IMPACT– 410 của hãng Nicolet (Mỹ) tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2.1.2.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học Nhằm xác định khả năng bảo vệ gan của cao chiết clorofom từ cây Xáo tam phân, chúng tôi đã phân... tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu thân và rễ loài Xáo tam phân được thu hoạch vào tháng 2 năm 2013 tại xã Ninh Vân – Khánh Hòa Tên khoa học được TS Nguyễn Văn Bách, Viện Sinh Thái và Tài nguyên sinh vật giám định Mẫu tiêu bản (C499) được lưu tại Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.2.1 Phương pháp thu và xử... gà) có lá và quả đun sôi uống chữa viêm phế quản, ho…[6] Paramignya monophylla Wight (Xáo một hoa) chống siêu khuẩn R.D in vitro, trị bạch đái hạ [2] 1.1.5 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Paramignya 1.1.5.1 ghi n cứu về thành ph n hóa học  Một số nghiên cứu trên thế giới Chi Paramignya được nghiên cứu từ năm 1990, tập trung chủ yếu vào 2 loài P monophylla và P griffithii... Hiệu suất 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết clorofom 2.2.3.1 ghi n cứu tác dụng của d ch chiết clorofom khi gâ độc bằng paracetamol Sau khi thu được các dịch chiết phân bố, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra hoạt tính của chúng bằng phương pháp gây tổn thương gan thực nghiệm dưới tác dụng của paracetamol  Mẫu nghiên cứu Dịch chiết clorofom (HCTN106) và dịch chiết etyl axetat... Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Phổ khổi lượng ion hóa phun sương điện tử (ESI – MS) được ghi trên máy Agilent 6310 Ion Trap tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Phổ khối lượng APCI-ESI-MS được ghi trên máy LC-MSD-Trap-SL Agilent 1100 series tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. .. thấp, Xáo tam phân khá an toàn khi sử dụng [16] 1.3 Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu bảo vệ gan 1.3.1 Phương pháp gây độc bằng paracetamol - Tác nhân: Paracetamol liều cao (cấp tính) - Cơ chế gây tổn thương gan của paracetamol thông qua sự tạo thành quá nhiều chất chuyển hóa hoạt động N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) + NAPQI là một sản phẩm chuyển hóa paracetamol do hệ enzym cytochrome P-450 ở gan. .. phân, có trong bộ Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [5] Xáo tam phân đã được người dân địa phương biết đến và sử dụng từ lâu, vị thuốc Xáo tam phân được bào chế kết hợp với các vị thuốc khác điều trị những bệnh nan y như ung thư máu, ung thư gan, ung thư vú, ung thư đại tràng, viêm gan siêu vi và sử dụng để bồi bổ sức khỏe gu n h n 13 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Viện Dược liệu đã bước đầu nghiên cứu cho thấy loài... trúc hóa học 5 hợp chất được phân lập từ vỏ thân cây P griffithii  Một số nghiên cứu trong nước Ở nước ta, năm 2014, nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Toàn Phan cùng các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất Glycosit từ phần chiết nước của cây Xáo leo (P scandens) [15] gu n h n 9 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 3: Cấu trúc hóa học 5 hợp chất Gl cosit được phân lập từ ph n chiết nước của cây P scandens