Chào mừng cô bạn đến với thuyết trình nhóm 8/30/16 Trường Trường Đại Đại Học Học Thủ Thủ Dầu Dầu Một Một Khoa Khoa Khoa Khoa Học Học Tự Tự Nhiện Nhiện NHÓM ĐỀ TÀI VŨ DUY HẢI PHẠM THỊ HÒA HOÀNG XUÂN ÁI LÂM THỊ MỸ HỒNG TRƯƠNG MINH HIẾU Sắc ký rây phân tử & sắc ký khí NGUYỄN THANH BÌNH NGUYỄN THỊ KIM HUYỀN 8/30/16 NỘI DUNG 8/30/16 SẮC KÝ SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ CỘT Phần I: Phương Pháp Sắc Kí Rây Phân Tử Định nghĩa:Sắc ký rây phân tử phương pháp chia tách phân tử dung dịch dựa kích thước chúng Trong đó:   8/30/16 Pha động dung môi hữu cơ,kỹ thuật gọi sắc ký thấm qua gel Pha động nước kỹ thuật gọi sắc ký lọc gel Nguyên lý hoạt động Các phân tử có kích thước lớn kích thước lỗ xốp lớn di chuyển dọc theo cột Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để vào tất Khoảng kích thước lỗ vật khoảng không gian lỗ xốp liệu nhồi cột xác định rửa giải tổng thể tích Mẫu đưa vào cột chứa khoảng kích thước phân tử thấm Vt đầy gel loại vật chia tách qua trình sắc liệu xốp, pha động ký qua khoảng trống hạt vật liệu nhồi mà không bị giữ lại, rửa giải thể tích loại trừ Vo dẫn chạy qua cột 8/30/16 Đường cột nối với detector có gắn với máy ghi tự Pha động chạy qua cột tốc độ không động đổi 04 02 CẤU TẠO 01 03 Một đầu cột nối với Một cột sắc ký có kích thước phù thiết bị phù hợp để cấp mẫu hợp 8/30/16 Sắc kí rây phân tử dùng để xác định: Xác định tỷ lệ thành phần tương đối Xác định khối lượng phân tử 8/30/16 Sự phân bố polymer theo kích thước phân tử Ví dụ: Phân bố khối lượng phân tử dextran Kiểm tra phương pháp sắc ký rây phân tử: Dung dịch hiệu chuẩn Hoà tan riêng rẽ 15 mg chất đối chiếu hóa học Dung dịch đánh dấu dextran 4,dextran 10 dùng cho hiệu chuẩn 20 mg chất đối chiếu hóa học dextran 40,dextran 70, dextran 250 dùng cho hiệu chuẩn ml pha động.t đối chiếu hóa học dextran Vo 1ml pha Dung dịch(1) Hoà tan mg dextrose chuẩn động mg chất đối chiếu hóa học Hoà tan 0,200 g mẫu thử vào pha dextran Vo 1ml pha động động pha loãng tới 10 ml pha động 8/30/16 Chuẩn hóa hệ thống sắc ký Tiến hành tiêm lặp lại vài lần thể tích định dung dịch đánh dấu  peak đầu tương ứng chất đối chiếu dextran Vo V0  peak thứ dextrose Vt Tiêm thể tích định dung dịch chuẩn Vẽ cẩn thận đường sắc ký đồ Phân chia sắc ký đồ thành p phần (ít 60) đường gạch thẳng dọc 8/30/16 Chuẩn hóa hệ thống sắc ký Trong phần, i tương ứng với thể tích rửa giải Vi, đo chiều cao (yi) đường sắc ký đồ phía đường tính hệ số phân bố Ki theo công thức: K i= Trong đó:  Vo = thể tích trống cột, xác định píc tương ứng với chất đối chiếu hóa học dextran Vo sắc ký đồ thu từ dung dịch đánh dấu,   8/30/16 Vt = thể tích thấm tổng cột, xác định píc tương ứng với dextrose sắc ký đồ thu từ dung dịch đánh dấu, Vi = thể tích rửa giải phần i sắc ký đồ thu với dung dịch chuẩn 10 ĐIỀU KIỆN: • Mẫu chất cần phân tích đặt đầu cột, phía pha tĩnh (có lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đặt phía cao • Dung môi giải ly khỏi cột phần bên cột hứng vào lọ nhỏ đặt ống dẫn cột 8/30/16 19 ƯU – NHƯỢC ĐIỂM:  Ưu điểm:  Sắc ký cột có ưu điểm pha tĩnh dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm  Có thể triển khai với lượng mẫu tương đối lớn  Nhược điểm: Tuy vậy, phương pháp thường làm cho trình tách bị chậm, hiệu thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 8/30/16 20 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: Lựa chọn chất hấp thu Lựa chọn dung môi Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột Nạp mẫu 8/30/16 21 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (1) Lựa chọn chất hấp thu: Pha tĩnh silicagel loại thường, hợp chất không phân cực giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực giải ly sau Với phân tử không phân cực, phân tử có trọng lượng phân tử lớn có tính phân cực mạnh phân tử kia, bị pha tĩnh giữ lại cột nên di chuyển khỏi cột chậm so với phân tử nhỏ, có lại lâu cột so với phân tử có tính phân cực 8/30/16 22 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: • (2) Lựa chọn dung môi: Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn dung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi dung dịch mẫu (A) Chuẩn bị 4-6 mỏng 2,5x10cm Chấm lên tấm khoảng 2-5l dd(A) Mỗi mỏng triển khai với loại dung môi giải ly khác nhau, kế phát đèn UV hay thuốc thử 8/30/16 23 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (2) Lựa chọn dung môi: Với đơn dung môi dễ dàng thấy dung môi phù hợp Từ kết đó, cố gắng tìm hỗn hợp dung môi, dung môi phân cực dung môi phân cực thí dụ ete dầu hỏa: etyl acetate 8/30/16 24 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng giá, cho dung môi loại phân cực vào khoảng 2/3 chiều cao cột Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng cột, đặn, lần lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột 8/30/16 25 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: Khi lớp chất hấp thu đạt chiều cao khoảng 2cm cột, mở nhẹ khoá bên để cột dung môi chảy ra, hứng vào becher trống để bên cột, dung môi rót lại lên đầu cột Sau nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến chất hấp thu cột đồng 8/30/16 26 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (4) Nạp mẫu: Mẫu dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu dạng rắn hoà tan mẫu chất vào lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký 8/30/16 27 8/30/16 28 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT Gồm bước sau: • • Bước 1: Mở khoá cho dung môi chảy khỏi cột để hạ mức dung môi cột xuống cho vừa sát với mặt thoáng chất hấp thu cột Bước 2: Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột Muốn nạp mẫu, sử dụng pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thu cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy theo thành cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu 8/30/16 29 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT: • • Bước 3: Mở khoá bên cho dung môi chảy khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu thấm hết vào chất hấp thu đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô Bước 4: Dùng pipet cho luợng nhỏ dung môi lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi để rửa ống mà dung dịch dính thành cột 8/30/16 30 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT: • • • Bước 5: Mở khoá cho dung môi chảy Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu, dung môi suốt không lây màu chất mẫu Bước 6: Sử dụng thủy tinh, gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt cột Bước 7: Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly cột 8/30/16 31 8/30/16 32 8/30/16 33 [...]... đó: p = số phân đoạn chia trong sắc ký đồ, y = chiều cao của đường sắc ký phía trên đường nền trong phân đoạn i Mi = khối lượng phân tử trong phân đoạn i 8/30/16 12 Điều kiện sắc ký rây phân tử:  Cột (0,3 m x 10 mm) nhồi agarose loại liên kết chéo dùng trong sắc ký hoặc một dãy các cột (0,3 m x 10 mm) nhồi gel polyether hydroxyl hóa dùng trong sắc ký  Dung dịch chứa 7g natri sulfat khan và 1g clorobutanol... khô vào cột Nạp mẫu 8/30/16 21 5 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (1) Lựa chọn chất hấp thu: Pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng lượng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử. .. trong đó một dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate 8/30/16 24 5 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột 8/30/16 25 5 CÁC... nước đ làm pha động, tốc độ dòng 0,5 - 1 ml/phút, giữ ổn định với sai số ±1%/giờ  Detector khúc xạ ánh sáng vi sai  Buồng tiêm mẫu dung tích 100 - 200 μl duy trì hệ thống hoạt động ở nhiệt độ ổn định (± 0,1°C) 8/30/16 13 Phần II SẮC KÝ CỘT 1 KHÁI NIỆM: Sắc kí cột là phương pháp dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất 8/30/16 14 2 NGUYÊN TẮC:  Sắc ký là một... • Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột 8/30/16 19 4 ƯU – NHƯỢC ĐIỂM:  Ưu điểm:  Sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm  Có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn  Nhược điểm: Tuy vậy, phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 8/30/16... lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký 8/30/16 27 8/30/16 28 6 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT Gồm 7 bước như sau: • • Bước 1: Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột Bước 2: Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột Muốn nạp... vào cột: Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này sẽ được rót lại lên đầu cột Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất 8/30/16 26 4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (4) Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột. .. mặt thoáng cảu chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu 8/30/16 29 6 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT: • • Bước 3: Mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô Bước 4: Dùng pipet cho... nhỏ  Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt 8/30/16 17 3 ĐIỀU KIỆN: • • Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh 8/30/16 18 3 ĐIỀU KIỆN: • Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một... hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh  Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là cột với chất hấp phụ đóng ai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ 8/30/16 15 2 NGUYÊN TẮC:  Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy