▓ Trường ĐHBC Tôn Đức Thắng ▪Khoa: Khoa học ứng dụng ▪Môn: Công nghệ sinh học Chuyên đề: Enzyme Papain mủ đu đủ ۩Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Thò Thu Sang ۩ Nhóm thực hiện: Trương Thò Diễm Châu Huỳnh Thò Bé Cơ Phạm Văn Cảnh Trần Ngọc Trung Mục lục Lời mở đầu Tr3 Phần I Enzyme gì? Tr4 Bản chất Tr4 Chức Tr4 Phần II Papain Tr4 I Sơ lược papain Tr5 II Phân loại- Tính chất papain II.1 Phân loại Tr5 ->7 II.2 Tính chất vật lý Tr8 II.3 Tính chất hóa học Tr8-9 III Cấu trúc chế hoạt động III.1 Cấu trúc Tr9 III.1.1 Cấu trúc không gian Tr10 III.1.2 Trung tâm hoạt động III.2 Cơ chế hoạt động Tr10 III.2.1 Hoạt hoá .Tr11 III.2.2 Cơ chế tác dụng Tr12 III.2.3 Bất hoạt Tr13 III.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Tr13-14 IV Thu nhận IV.1 Thu nhận nhựa đu đủ IV.1.1 Điều kiện thu nhận Tr15 IV.1.2 Cách lấy Tr15 IV.2 Phương pháp thu nhận papain bán tinh khiết Tr16 IV.3 Phương pháp thu nhận papain tinh khiết Tr16 ->18 V Tiêu chuẩn tinh khiết enzyme Tr18 VI Ứng dụng Tr19 VI.1 Trong y học Tr19 VI.2 Trong công nghiệp Tr19 VI.3 Trong mỹ phẩm Tr19 VII Tình hình sản xuất Việt Nam giới Tr20 Lời mở đầu Trước nghe nhiều công dụng đu đủ Chúng giúp cho việc tiêu hóa dễ dàng hơn, giúp da đẹp hơn……và sinh tố ngon miệng Quả đu đủ giá trò chín mà có giá trò cao xanh Trong mủ đu đủ xanh chứa nhiều loại enzyme có giá trò kinh tế, quan trọng papain Papain xếp vào loại protease, có tính chất gần giống pepsin loại protease khác Hiện người ta ứng dụng papain việc mở đóa đệm phẫu thuật cột sống, sản xuất mỹ phẩm……Nứơc ta nước có khí hậu nhiệt đới thích hợp cho đu đủ phát triển, lại không khai thác lợi để thu lấy nguồn papain ,có giá trò cao nhiều so với thu nhận đu đủ chín Nhưng trước hết tìm hiểu số điều papain Phần I ENZYM LÀ GÌ ? Bản chất Enzym có chất protein, vi sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào phản ứng sinh học.Enzym tạo tế bào sinh học Chức Tham gia phản ứng tế bào sống tách khoải tế bào Tham gia phản ứng điều kiện ôn hoà Enzym tham gia phản ứng từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn lượng Phản ứng enzym phản ứng tiêu hao lượng Enzym chụi điều khiển gen điều kiện phản ứng Một gen qui đònh enzym , enzym qui đònh phản ứng sinh hoá Phần II PAPAIN I SƠ LƯC VỀ PAPAIN: Từ người biết dùng đu đủ xanh nấu với thòt để làm mềm thòt nhanh tăng hương vò thòt.nhưng họ đu đủ có chất mà làm cho thòt mềm nhanh G.C.Roy người phát nhựa đu đủ nguồn enzym.Ông công bố báo cáo tạp chí “Calaitta Medical journal” Được tách từ nhưạ đu đủ xanh , papain thuộc nhóm enzym thuỷ phân có nguồn gốc thực vật nghiên cứu nhiều tính chất chế hoạt động Papain sulfhydryl protease , tách ông Bals cộng ông, sau Kimel vàSmith từ nhựa thô Đến năm 1879 Wrutz vàbouchet người sử dụng thuật ngữ “papain” để diễn tả tính chất phân huỷ protein enzym nhựa đu đủ.ngày , thuật ngữ papain tiếp tục sử dụng để miêu tả mủ đu đủ khô dùng rộng rãi công nghiệp chế phẩm enzym thuỷ phân dang kết tinh từ mủ.Chế phẩm enzym gồm hai enzym khác gọi papain peptidase papain peptidase Theo danh pháp quốc tế , papain mang mã số 3.4.4.10, có hoạt tính xúc tác tương tự bromelin dứa II PHÂN LOẠI- TÍNH CHẤT II.1 Phân loại Nhựa đu đủ hỗn hợp enzym chứa protease sau:papain, chymopapain A,B,proteinase III,IV,thiolprotease Trong papain có hàm lượng 5-8% enzym có ý nghóa quan trọng Hình 1:Cấu tạo không gian peptidase Hình 2:Cấu tạo không gian chymopapain Thông thường chế phẩm thương mại chứa 5-8% papain, lại chymopapain peptidase Chế phẩm thương mại thường nhựu đu đủ (latex) sấy khô phươgn pháp khác nhau, so với nhựa tươi chế phẩm đông khô Việt Nam chúng có hoạt tính khoảng lần (bảng 4.13), hàm lượng pro tein tan nhỏ hơn:175mg/g chế phẩm thương mại so vớ 675mg/g chế phẩm đông khô Bảng 3: Hoạt tính thủy giải protein chế phẩm papain Việt Nam Chế phẩm Hoạt tính protease Hoạt tính amidase (UI/mg) (UI/mg) Thương mại (Merk) 19.9 1.5 Đông khô(VN) 53.5 3.1 Tươi (VN) 42.2 1.9 Các chế phẩm có thành phần tương tự chạy điện di gel polyacrylamide hệ B-amilane có pH4.3 (H.4.18) Chúng có năm tiểu phần có la p, ba tiểu phần chymopapain va tiểu phần peptidase A A 5 B C Hình: điện di đồ chế phẩm papain A-chế phẩm thương mại B-chế phẩm đông khô C-chế phẩm tươi 1-papain 2,3,4-chymopapain 5-peptidase Các kế thu trình bày bảng cho thấy loai enzym có hoạt tính protease chúa nhựa đu đủ có chứa chế phẩm thu nhận Việt Nam, papain chiếm 4,7-9,6%; chymopapain chiếm 45,1-65,9%; peptidase D từ 6,9-39,7%; peptidase a từ 5,5-9,6% Bảng 4: Thành phần enzym thủy giải chế phẩm papain Chế phẩm Thành phẩm protein Hoạt tính thủy giải (%) (%) Chế phẩm thương mại Papain 4,7 3,7 Chymopapain 66,2 40,5 Pepetidase A 15,2 32,9 Pepetidase B 13,5 16,7 Chế phẩm đông khô(VN) Papain 7,6 1,4 Chymopapain 65,9 33,0 Pepetidase A 16,9 39,7 Pepetidase B 9,6 13,2 Chế phẩm tươi (VN) Papain 9,6 3,7 Chymopapain 45,1 40,2 Pepetidase A 39,7 43,0 Pepetidase B 5,5 10,3 II.2Tính chất vật lý Bảng 1:tính chất vật lý papain Điểm đẳng điện Hằng số lắng S20 Hằng số phân tán D20(10 sec.cm2) Phân tử lượng Độ triền quang Độ xoắn Pi = 8.75 2.42 ± 0.04 10.27 ± 0.13 20.700 -66.7 17% Vòng hiệu ứng coton 290mm Thể tích riêng phần V(ml/g) 0.724 Trò số ma sát f/f0 1.16  Bột màu vàng hay nâu nhạt tuỳ thuộc vào phương pháp sấy, không tan hầu hết chất hữu tan phần H2O hay glycerine Bền nhiệt II.3 Tính chất hoá học Cấu tạo hoá học Papain endoprotease có chứa 16.1%N 1.2%S.Papain protease thiol, theo nghiên cứu R.L Hill E L.Smith, papain chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử 20.900 Dalton Bảng 2:Thành phần amino acid papain Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng Alanin 13 Lysine Arginine 10 Phenylalanine Aspartic acid 17 Proline Hafl-cysteine Serine 11 Glutamic acid 17 Threonine Glicine 23 Tryptophan Histidine Tyrosine 17 Isoleucine 10 Valine 15 Leucine 10 Methionine Tổng cộng : 185 Theo kết phân tích tia X, phân tử papain cấu tạo 212 amino acid không chứa methionine Phân tử lượng 3.350Da, phân tử mạch polypeptide với đầu N isoleucine, đầu C asparagine, có gốc cysteine tạo thành ba cầu disulfur vò tri 22-63, 56-95, 153-200, chức sinh học, làm tăng tính chất bền vững cấu trúc nhóm –SH tự vò trí 25 Thành phần papain chứa hoạt hoá hỗn hợp protein disulfurcysteine Khi hoạt hoá papain KCN giải phóng nhóm thiol enzym β-thio cyanatalanine tương tác cyanur cysteine Sau đó, β - thio cyanatalanine khép vòng tạo thành α-iminotiazolidin Khi có oxy không khí, chế xảy theo chiều ngược lại, tức cysteine kết hợp với nhóm sulfurhydride papain hoạt hoá tạo thành sản phẩm không hoạt hoá III Cấu trúc chế hoạt động III.1Cấu trúc - Gồm 16% N, 1.2% S - Có 212 aa, không chứa methionin - Đầu N Ile, đầu C Asp - Có gốc cystein tạo thành cầu nối disunfua vò trí 22-63, 56-95 , 153-200 chúng chức sinh học, giữ vững cấu trúc - Có nhóm –SH tự vò trí 25 giữ chức sinh học III.1.1Cấu tạo không gian Hình 3-4 : Cấu tạo không gian papain III.1.2 Trung tâm hoạt động Gồm: –SH cysteine 25 liên kết N bậc hystidine 159 -vòng imidazol nhóm hystidine 159 liên kết với Asp 175 liên kết H Hình 5: Trung tâm hoạt động papain III.2 Cơ chế hoạt động Tác dụng : thuỷ phân protein thành polypeptit axit amin, có vai trò endopeptidase (thuỷ phân protein thành peptide) exopeptidase (thủy phân protein thành aa) Như papain thủy phân sâu so với protease lấy từ nguồn động vật vi sinh vật khác Do dùng để thuỷ phân tiếp sau thủy phân trypsin hay chymotripsin Tính đặc hiệu papain rộng, thuỷ phân hầu hết liên kết peptide trừ liên kết với prolin a.glutamic Khả thuỷ phân papain phụ thuộc vào trạng thái chất có bò biến tính hay không, bò biến tính papain dễ tác dụng III.2.1 Hoạt hóa 10 Do trung tâm hoạt động papain gồm cysteine 25 nytrogen bậc histidine 159 có tính khử nên chất hoạt hóa chât có tính khử như:cysteine,glutation axit,hydrocyanic… Khi có mặt nhóm –SH trung tâm hoạt động phục hồi làm tăng hoạt tính Khi có mặt chất kết hợp với kim loại nặng mủ đu đủ EDTA hoạt tính tăng Hình 6: Cơ chế họat hóa bất họat papain III.2.2Cơ chế tác dụng Papain xúc tác phản ứng thuỷ phân dẫn xuất acyl: Hình 7:Phản ứng thủy phân chất có liên kết –CO-NHRCOX + PAP-SH PAP-S- C O + HX R PAP-S- C O + H2O PAP-SH + RCOOH 11 R Phản ứng xảy tính nhân S –SH, C chất có khuynh hướng phản ứng với nguyên tử có tính nhân Papain nhận biết chuỗi aa ưu tiên cắt sau:  Nếu chuỗi có dạng :NH2- A-B –Phe –C-D-E-F-COOH (trong A,B,C,D,E,F aa) papain cắt đoạn C – D N C Vò trí thuỷ phân P4 S4 P3 S3 P1 S2 S1 , P1 , S , P , Cơ chất P2 , S2 , S3 Hình 8: Vò trí cắt chất papain Còn chuỗi có nhóm Phe vò trí thứ đầu tận C papain không thuỷ phân mà chất kìm hãm cạnh tranh với papain III.2.3 Bất hoạt papain bò kìm hãm chất oxy hóa như:oxy,ozone,H 2O2 …đặc biệt H2O2, phản ứng với nhóm –SH làm phá vỡ cấu trúc trung tâm hoạt động papain bò bất hoạt thuận nghòch không khí,cysteine nồng độ thấp,ion kim loại nặng Cd+,Cu2+, Zn2+,Hg2+,Fe2+ … 12 aldehyde ức chế papain,carborxy_L_ glutamic acid ức chế không cạnh tranh pH = 3,9- 4.5 Chất có nhóm Phe vò trí thứ kể từ đầu mạch C chất kìm hãm cạnh tranh mạnh ,do chiếm phần trung tâm hoạt động Các chế phẩm papain sau bảo quản vài tháng hoạt tính 30% Đặc biệt papain bền với tác nhân biến tính dung môi hữu cơ: độ quay cực papain không đổi etanol 70% ,ure 6-8 M/l III.2.4Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính a)Nhiệt độ :papain chòu nhiệt độ cao + dạng nhựa khô papain không bò biến tính 3h ,100oC + Ở dạng dung dòch ,bò bất hoạt sau 30’ 82.5oC cấu trúc trung tâm hoạt động bò phá huỷ + Ở dạng tinh thể độ bền nhiệt thấp mủ nhựa mủ nhựa có protein khác có tác dụng bảo vệ + Ở dung dòch NaCl 4o C, dung dòch dẫn xuất thuỷ ngân papain giữ bền nhiều tháng Tuỳ loại protein mà có nhiệt độ thuỷ phân thích hợp VD : casein 37 o C b)pH : papain hoạt động khoảng 4.5-8.5 , bò bất hoạt pH12 Hình 9: Mức độ ảnh hưởng pH đến họat độ papain 13 tuỳ thuộc vào chất chất mà có pH tối ưu khác nhau.VD : với casein 7-7.5, với albumin 4.5-7.1 papain dạng ổn đònh (tức ổn đònh cấu trúc) chòu pH từ 1.5- 8.5 c)Dung môi : papain không thay đổi độ quay quang học methanol 70% không thay đổi độ nhớt methanol 50% không bò giảm hoạt tính ure 8M bò biến tính thuận nghòch TCA 10%, guanidin hydrochloride 6M IV.Thu nhận enzym papain IV.1 Thu nhận nhựa đu đủ IV.1.1 Điều kiện lấy nhựa Câây: sinh trưởng tốt, không bò sâu bệnh, thân mập mạp cho nhựa nhiều Quả: lấy xanh, vỏ mòn, có trọng lượng từ 0.3-1kg tốt Quả non cho nhựa, già to vừa cho nhựa vừa không sánh sệt, hoạt tính enzym không cao Qua có vỏ sần sùi, chia thùy cho nhựa Để thu chế phẩm enzym có hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa có độ 10 tuần tuổi Thời gian lấy nhựa : sáng sớm, kết thúc vào buổi sáng (giai đoạn độ ẩm không khí cao) Khi độ ẩm không khí thấp, dòng nhựa chảy chậm đặc, khó thu nhận -Mùa khô: nhựa ít, đặt, nồng độ protein cao -Mùa mưa: nhựa nhiều loãng, nồng độ protein thấp IV.1.2 Tiến hành -Nhựa đu đủ lấy xanh - Dùng dao inox rạch vài đường dọc theo chỗ có đường kính to nhất, látư khía cách 3-5cm (không rạch sâu 2cm, không dòch nước tinh bột từ trộn lẫn vào nhựa làm giảm chất lượng nhựa thu được) -Hứng lấy nhựa chảy lọ thủy tinh màu miệng rộng 4-6 phút, sau lấy nhựa xong đậy nắp kín để tối -Bảo quản lạnh, mang phòng thí nghiệm Mục đích giai đoạn tránh không cho nhựa tiếp xúc với không khí để đảm bảo hoạt tính papain có nhựa -Khi lấy nhựa cần tránh không cho chất bẩn côn trùng lẩn vào 14 -Không nên trộn nhựa tươi với nhựa khô làm giảm chất lượng -Quả rút nhựa suốt khoảng thời gian từ 4-7 ngày Lần cần rạch đủ, lần thu nhựa sau, rạch 2-3 đường đường rạch trước -Khi tiến hành thao tác với nhựa tươi tránh không cho nhựa tiết xúc vào da gây bỏng Đồng thời không nên để nhựa tiếp xúc vơi dụng cụ làm từ kim loại nặng sắt, đồng … làm biến màu giảm hoạt tính enzym Lo, dao, muỗng,… phải làm thép không rỉ -Nhựa tươi không bền, nên sấy khô tới 5% độ ẩm -Sau 2-3 tháng, đu đủ chín, lấy khỏi Đu đủ chín ăn khó bán bề không đẹp Tuy nhiên đu đủ chín xanh có chứa khoảng 10% pectin, dùng để thu nhận pectin IV.2.Mố số phương pháp thu nhâïn papain bán tinh khiết Vấn đề tinh papain nghiên cướu rộng rãi từ trước tới nay, chủ yếu dùng dung môi hữu đẻ tinh papain Nhựa đu đủ đủ tuổi sau lấy chiết rửa 2-3 lần cồn 90 0, lọc lấy cặn lam bay cồn.Cặn hòa tan nước cất, sau dùng cồn để xác đònh lại, sấy 30-400C, Thu nhận papain Ngâm papain thể tích nước cất đònh vài hòa tan nhựa tươi nước cất, bổ sung glyxerine cho tạo thành dòch nhủ tan đều, lọc lấy dòch qua vài lớp vải Dùng acetone lạnh với tỷ lệ 1:2 so với thể tchs dung dòch lọc.sau ly tâm lạnh thu lấy kết tủa Sấy kết tủa nhiệt độ 450C, sấy chân không phơi khô, sau nghiền thành bột Tinh chế papain phương pháp kết tủa phân đoạn sửu dụng (NH 4)2SO4 NaCl Để nâng cao mức độ tinh với papain, người ta sử dụng phương pháp sắc ký cột vói CMC IV.3 Phương pháp thu nhận papain tinh khiết a Chuẩn bò: thành phần nhựa đu đủ tươi enzym papain, chymopapain chứa số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… chất tạp khác Để có quy trình tách làm papain từ nhựa đu đủ có hiểu phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích để 15 hòa tan chất nhựa, cặn, tạp lớn,… trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite 150g cát sạch, nghiền kỹ cối nhiệt độ phòng với 200-300 ml dung dich cysteine 0,04 M hòa tan 6,3g cysteine hydrochloride 1000 ml dung dòch NaOH 0,045 M, kiềm sử dụng để đưa pH dòch chiết tới 5,70 dòch nhựa tạo thành thể huyền phù, gan bỏ lớp Quá trình nghiền trích lặp lại với 300 ml dung dòch cysteine Sau rửa cối với dung dòch cysteine để điều chỉnh thể tích dòch chiết lên 1l dòch huyền phù sau lọc lạnh (có thể hút nhẹ) giấy lọc Whatman số thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khô sử dụng trình chậm Nước lọc có màu trắng sữa vàng xanh, pH gần 5,7 Các bước lại trình làm tinh enzyme tiến hành điều kiện lạnh b.Loại bỏ chất không tan pH Dòch chiết thu bước chỉnh lên pH cách thêm từ từ khuấy lượng khoảng 110 ml dung dòch NaOH 1M Tủa xám tạo thành loại cách lọc ly tâm 2600 rpm Dòch trích phải tủa gây biến tính protein loại bỏ c Quá trình phân đoạn amonium sulfate Cho mamonium sulfate vào dòch enzym đến 40% dòch bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm 2500rpm, Thu nhận tủa, bỏ dòch lỏng giữu lại để lấy chymopapain Tủa rửa lần với 400-500ml dung dòch ammonium sulfate 41% bão hòa d Quá trình phân đọan NaCl Hòa tan tủa 600 ml dung dòch cysteine 0,02M (pH7-7,5), Tủa papain tạo thành thêm từ từ 60g NaCl rắn Sau ly tâm 2500rpm để thu tủa, bỏ dòch lỏng e Kết tinh Tủa thành dòch huyền phù với 400 ml dung dòch cysteine 0,002M, pH6,5 nhiệt độ phòng pH dung dòch huyền phù điều chỉnh lại đến 6,5 sau cho protein vào Giữ nhiệt độ phòng 30 phút để tinh thể tạo thành sau trì 40C qua đêm sau ly tâm lạnh 2500rpm 4-5 giòe để thu nhận tinh thể f.Tái kết tinh Hòa tan tinh thể thu bước nước cất (tạo dung dòch có nồng độ protein khoảng 1%) nhiệt độ phòng Sau cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dòch NaCl bão hòa (10ml/300ml) dung dòch protein).Khi 75% thể tích 16 dung dòch NaCl cho vào, papain bắt đầu kết tinh nhiệt độ phòng Dòch huyền phù giữ 4oC qua đêm, Sau ly tâm thu tủa bước Hoạt độ rêng enzym tăng nhẹ tiến hành tái kết tinh thêm lần g Sấy chân không Sấy chân không nhiệt độ phòng khoảng 400C thu nhận papain tinh chế Để tăng hoạt tính enzym, trước tái kết tinh hòa tan tinh thể enzym dung dòch đệm photphate chứa cysteine,sau tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000Ao Kết tinh dìch lỏng thu sau siêu lọc VI Những tiêu chuẩn tinh khiết ezyme Để xác đònh xem protein chiết tách có phải ezyme tinh khiết hay không hay chứa tạp chất protein không họat động, người ta sử dụng số phương pháp chủ yếu dựa việc nghiên cứu tính chất vật lý protein Làm lắng(kết tủa) dung dòch protein phần quay phân tích máy siêu ly tâm: phát đỉnh protein protein Tuy nhiên số protein khác có lượng phân tử có hình dạng tiểu phân(hoặc có có bù phụ ảnh hưởng khối lượng hình dạng)thì có số lắng trùng Vì siêu ly tâm, chúng lắng với tốc độ cho đỉnh chung Điện di( phương pháp ranh giới di động):phương pháp hiệu quả.Tuy nhiên khó mong phân biệt protein giống trò số di động điện di Dung dòch enzyme điện di khu vực jela tinh bột thạch đỉnh cân đối dấu hiệu enzyme Thế hàm lượng protein tạp nhỏ([...]... tháng, quả đu đủ chín, có thể lấy ra khỏi cây Đu đủ chín có thể ăn được nhưng khó bán vì bề ngoài không đẹp Tuy nhiên quả đu đủ chín xanh có chứa khoảng 10% pectin, do đó có thể dùng quả để thu nhận pectin IV.2.Mố số phương pháp thu nhâïn papain bán tinh khiết Vấn đề tinh sạch papain đã được nghiên cướu rộng rãi từ trước tới nay, chủ yếu dùng dung môi hữu cơ đẻ tinh sạch papain Nhựa đu đủ đủ tuổi sau... nghiên cướu và kết quả đã được một giống cây đu đủ mới từ giống CP-15 có hàm lượng papain cao và đặt tên CO-5 CO-5 là giống đặt biệt thích hợp để lấy papain Trong bốn mùa liên tiếp nó cho papain đạt mức kỷ lục (mỗi quả 14-15 g papain thô) Đây thật sự là một bước khai thông trong cây đu đủ và là mức kỷ lục của thế giới về sản xuất papain 19 Giá trò xuất khẩu của papain tren thò trường quốc té rát cao, theo... phá huỷ + Ở dạng tinh thể thì độ bền nhiệt thấp hơn ở trong mủ nhựa do trong mủ nhựa còn có những protein khác có tác dụng bảo vệ nó + Ở trong dung dòch NaCl 4o C, trong dung dòch dẫn xuất thuỷ ngân thì papain được giữ bền trong nhiều tháng Tuỳ loại protein mà có nhiệt độ thuỷ phân thích hợp VD : đối với casein là 37 o C b)pH : papain hoạt động được trong khoảng 4.5-8.5 , nhưng bò bất hoạt khi pH