Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ACID AMIN .7 I PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ACID AMIN ĐẦU N, C II CÁC PHẢN ỨNG NHẬN BIẾT CÁC ACIDAMIN ĐẶC TRƯNG 12 III PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG ACID AMIN 21 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH PROTEIN 28 I PHẢN ỨNG BIURE 29 II PHƯƠNG PHÁP LOWRY 30 III PHƯƠNG PHÁP TẠO TỦA VỚI TCA (ACID TRICLOACETIC) 32 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN 34 I ĐỊNH LƯNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL:[4], [6] 34 II ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU: [4] 41 III ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID (BCA) [10] 49 IV ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ:[4] 50 V PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG O-PHTHALALDEHYDE (OPA): [10] 52 VI PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG AMONIAC.[4] 52 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang LỜI NÓI ĐẦU Protein thành phần thiếu tất thể sinh vật, cấu tạo từ nhiều nguyên tố: C, H, O, N… Chủ yếu bao gồm L-axit amin kết hôp với liên kết peptid Tỉ lệ phần trăm khối lượng nguyên tố phân tử Protein sau: C 50-55; O 21-24;N 15-18; H 6,5 - 7,3; S – 0.24 Ngoài nguyên tố số protein chứa lượng nguyên tố khác P,Fe,Zn,Cu, Mn,Ca… Protein có đặc tính đặc thù cao cho loài, quan mô cá thể Protein đa dạng cấu trúc chức thể sống Trong mô tế bào sinh vật thành phần Protein (chất đạm) tồn nhiều dạng khác như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein (comoniac muối amonium) Để xác đònh chúng có nhiều phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác tùy theo chiều hướng muốn khảo xác, người ta áp dụng phương pháp thích hợp trục tiếp gián tiếp Seminar trình bày số phương pháp dùng để đònh tính đònh lượng Protein, với số lưu ý sử dụng phương pháp cụ thể Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang PHẦN I TỔNG QUAN Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN Tất protein chứa nguyên tố C,O,N,H, số chứa lượng nhỏ S Tỉ lệ phần trăm khối lương nguyên tố phân tử protein sau: C 50-55; O 21-24;N 15-18; H 6,5 - 7,3; S – 0.24 Ngoài nguyên tố số protein chứa lượng nguyên tố khác P,Fe,Zn,Cu, Mn,Ca… Protein có thành phần phức tạp có nhiều bật cấu trúc khác nhau, mổi bật cấu trúc có cấu trúc chức khác giử vai trò quan trọng dối với tất thể sinh vật Để thuận tiện người ta thường cấu trúc thành bậc 1,2,3,4 Cấu trúc bậc 1: trình tự xếp gốc acid amin mạch polypeptide cấu trúc giữ vững nhờ liên kết peptide(liên kết cộng hoá trò) O H3N – CH – C + +H3N – CH – C + R1 O O- R2 O O + O H3N – CH – C – NH – CH – C R1 R2 + H2O O– Liên kết peptide H H H O H H H O H – HN – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – R1 O R2 H R3 O R4 H R5 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Cấu trúc bậc 2: Là tương tác không gian gốc acid amin gần mạch polypeptide Nói cách khác không gian cục phần mạch polypeptide Cấu trúc làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro tạo thành liên kết peptide gần cách khoảng xác đònh Cấu trúc bậc 3: Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Tương tác không gian gốc acid amin xa mạch polypeptide, dạng cuộn lại không gian mạch polypeptide (hình dạng chung chuỗi polypeptide) Trong nhiều protein hình cầu có chứa gốc Cys, tạo thành liên kết disunfua gốc Cys xa mạch polypeptide, làm cho mạch bò cuộn lại đáng kể Các liên kết khác liên kết Vandecvan,liên kết tónh điện, lk hidro mạch bên gốc acid amin … tham gia làm bền cấu trúc bậc Kết nguyên cứu nhiều protein cho thấy trình tự xếp gốc acid amin chuỗi polypeptide chứa thông tin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc Cấu trúc bậc 4: Đối với phân tử protein bao gồm hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu, tương tác không gian chuỗi phân tử gọi cấu trúc bậc Mỗi chuỗi polypeptide gọi là”phần đơn vò ” chúng gắn với nhờ liên kết hidro, lực Vandecvan nhóm phân bố bề mặt “phần đơn vò” Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang PHẦN II CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ACID AMIN Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang I Phương pháp xác đònh acid amin đầu N, C Việc xác đònh amino acid đầu N đầu C cho phép xác đònh số lượng sợi polypeptide tạo nên phân tử protein đánh giá mức độ đồng mẫu protein Ngoài biết amino acid đầu N cho phép kiểm soát trình tách phân đoạn phân tử protein I.1 Xác đònh amino acid đầu N: Phương pháp Sanger: Xác đònh amino acid đầu N Sanger đề xuất vào năm 1945 gồm bước chủ yếu sau: Dựa vào phản ứng nhóm ∝ - NH2 amino acid đầu N với 2,4 dinitroftorbenzol tạo dẫn xuất dinitrophenyl (DNP) amino acid cần xác đònh có màu vàng Sau tiến hành thuỷ phân acid HCl 5,7N cắt toàn amino acid có mặt sợi polypeptide dẫn xuất màu vàng DNP – aminoacid đầu N Tách dẫn xuất cách chiết suất eter xác đònh dẫn xuất amino acid phương pháp sắc ký mỏng Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Sơ đồ phương pháp Sanger O2N F+ Al Gl As Le Ar Th a y p u g r Al Gl As Le Ar Th a y p u g r NO2 O2N NO2 HCl As Gl p y O2N Al a NO2 Th Le Ar u g r Phương pháp Dansyl: Do harly đề vào năm 1963, chất phương pháp tương tự phương pháp Sanger gồm bước: Đầu tiên cho dansylchloride tác dụng với nhóm NH amino acid đầu N tạo dansyl-peptide Tiến hành thủy phân sợi polypeptide acid HCl 5,7N ởù 105°C khoảng 12- 16 h giải phóng phức dansyl-amino acid đầu N phát huỳnh quang λ = 365 nm Sau xác đònh dansyl- amino acid phương pháp sắc ký mỏng chiều gần người ta sử dụng phương pháp sắc ký cột lỏng ngược pha có độ phân giải cao sử dụng detector huỳnh quang Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Sơ đồ phương pháp Dansyl H R1 H2N H R3 H N O R2 H N H O H R1 H H R3 H N N N HN O O R2 H H H N O Cl O O O polypeptide S O S H3C N CH3 N H3C CH3 N-dansyl derivative of peptide HCl Dansyl chloride H H ⊕ ⊕ H3N – C –CO2H + H3N – C – CO2H …– + R2 O H H O = S – N – C – CO2H R1 R3 N H3C CH3 N- dansyl- amino acid Phương pháp Edman: Phương pháp cho phép xác đònh thứ tụ amino acid từ đầu N nhờ phản ứng nhóm NH2 amino acid đầu N với phenyllisothiocyanate (PITC ) Gồm hai giai đoạn: • Tạo phenylearbamat-peptide • Tách amino acid đầu N dạng dẫn xuất phenylthihydantoin (PTH ) 10 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Hình : Phản ứng Biure Cường độ màu phản ứng tỉ lệ thuận với lượng Cu số lượng liên kết peptid chuỗi Polypeptid Cách tiến hành: Chuẩn bò nguyên liệu hóa chất: dung dòch Albumin tiêu chuẩn 1% Chuẩn bò thuốc thử Biure: Cân xác 1,5g CuSO4 6g Tartrat Kilium Natrium 500ml nước cất Cho vào bình lắc cho tan hoàn toàn đònh mức đến 1000ml Lập đồ thò chuẩn: Lấy ống nghiệm đánh số từ đến cho vào chất theo bảng sau: Nồng độ STT Protein1%(ml) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 H2O(ml) Protein 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 (mg/ml) 10 Thuốc thử Biure (ml) OD 5 5 5 42 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Bảng 3: lập đồ thò chuẩn nồng độ Protein Lắc ống nghiệm để yên 30 phút nhiệt độ phòng Đem đo độ hấp thu ống bước sóng 540nm ghi nhận mật độ quang Chuẩn bò dung dòch nghiên cứu Cho vào ống nghiệm 1ml dung dòch nghiên cứu 4ml thuốc thử Biure lắc để yên 30 phút nhiệt độ phòng Sau đem đo mật độ quang bước sóng 540nm Ghi nhận mật độ quang Tính toán: Lập đồ thò chuẩn ống nghiệm từ 26 Trò số mật độ quang ống nghiệm từ 26 mật độ mật độ quang ống nghiệm từ 26 đo trừ cho mật độ quang ống Sau lập đồ thò biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn Tương tự độ hấp thu thật Protein có ống thí nghiệm trò số mật độ quang ống thí nghiệm trừ ống đối chứng Sau đối chiếu vào đường cong mẫu suy lường Protein có mẫu thí nghiệm Độ nhạy khả ứng dụng: Phương pháp nhạy phương pháp Lowry không phương pháp Bradford sử dụng mẫu nghiên cứu có khối lượng Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg/ml II.2 Đònh lượng Protein phương pháp Lowry (Biure cải tiến) [4],[6] Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu Protein thuốc thử Folin Phương pháp sử dụng phối hợp phản ứng Biure phản ứng với thuốc thủ Folin tác dụng lên gốc tyrozin, tryptophan, histidin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại 43 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang bước sóng 750nm dựa vào đường chuẩn Protein để từ dònh lượng hàm lượng Protein Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein Hình : Phản ứng Lowry Tiến hành Chuẩn bò nguyên liệu, hóa chất, thiết bò • Dung dòch Protein chuẩn có 10 – 100 µg Protein/1ml • Dung dòch nghiên cứu có 50 - 300 µg Protein/1ml • Dung dòch chuẩn: Albumin 0,1%, thường huyết bò (BSA – bovine serum albumin) Hóa chất : pha • Dung dòch A : Na2CO3 2% hòa NaOH 0,1N • Dung dòch B : CuSO4.5H2O 0,5% pha dung dòch natri citrat 1% • Dung dòch C : hỗn hợp dung dòch A dung dòch B với tỉ lệ 49:1 • Dung dòch Folin Cách pha dung dòch Folin: Pha bình cầu có V= 2l Cân 100g natri tungstat (natri wonframat (Na2WO4.2H2O) 25g natri molypdat ( Na2MoO4.2H2O) Thêm vào 700ml nước cất 50ml axit orto phosphoric 85% ( H3PO4) Khuấy cho tan thêm vào 100ml HCl đậm đặc 44 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang tinh khiết tiếp tục khuấy Đun sôi hỗn hợp có ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu 10h Sau đun hồi lưu thêm vào 150g lithium sulfat ( Li 2SO4.H2O) tinh khiết Khuấy tan hoàn toàn cho vào – 10 ml nước Brom khuấy đun sôi tủ hotte 15 phút để đuổi lượng Brom thừa Dung dòch phải có màu vàng,nếu dung dòch có màu xanh phải xử lý với Brom lần thứ sau làm nguội dung dòch nhiệt độ thường Để vào bình đònh mức 1l đònh mức đến vạch Có thể lọc dung dòch không Đựng chai thủy tinh nút nhám có màu nâu, cất giữ nơi lạnh, sau – tháng,dung dòch chuyển sang màu xanh thêm vài giọt Brom đun sôi 15 phút dung dòch lại có màu vàng trở lại Trước dùng phải pha loãng thuốc thử nước cất đến nồng độ 0,5N Thiết bò : máy so màu quang điện Tiến hành: Chuẩn bò mẫu thí nghiệm nghiên cứu: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dòch mẫu ,thêm vào ống nghiệm 4ml dung dòch C, lắc đều, để yên 10 phút nhiệt độ phòng.Sau thêm 0,5ml thuốc thử Folin, lắc để yên 30 – 90 phút,lúc dung dòch chuyển từ màu vàng sang màu xanh Sau đem đo độ hấp thu bước sóng 750nm ghi nhận mật độ quang học dung dòch nghiên cứu Thực tương tự với ống đối chứng cách thay 1ml dung dòch mẫu 1ml nước cất Lập đồ thò chuẩn Lấy ống nghiệm đánh số từ đến cho vào chất theo bảng sau: ng số Protein Nước cất 0,1% (ml) (ml) 0,0 0,5 1,0 1,5 10 9,5 9,0 8,5 Nồng độ Protein (mg/ml) 50 100 150 Dung dòch Thuốc thử C (ml) Folin (ml) 2 2 0,5 0,5 0,5 0,5 OD 45 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang 2,0 2,5 8,0 7,5 200 250 2 0,5 0,5 Bảng 1: lập đồ thò nồng độ Protein Trình tự thao tác tương tự phần dung dòch thí nghiệm Sau đem đo độ hấp thu ống bước sóng 750nm Từ xây dựng đồ thò chuẩn Tính toán: Từ bảng lập đồá thò ta lấy trò số mật độ quang ống từ – trừ mật độ quang ống Đó độ hấp thu thực dung dòch Protein chuẩn, từ ta lập đồ thò biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn Với trục hoành nồng độ Protein trục tung mật độ quang Tương tự độ hấp thu thật Protein có ống thí nghiệm trò số mật độ quang ống thí nghiệm trừ ống đối chứng Sau đối chiếu vào đường cong mẫu suy lường Protein có mẫu thí nghiệm Độ nhạy khả ứng dụng: Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác đònh dung dòch mẫu chứa vài chục µg Protein thường nhạy cảm khoảng từ – 2,000mg Protein Tuy nhiên phương pháp không dùng để đònh lượng Protein không chứa acid amin vòng thơm gelatin, hợp chất có chứa ion kali tạo kết tủa ảnh hưởng đến kết II.3 Đònh lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie Brilliant Blue G - 250): [4],[6] Nguyên tắc: Dựa phản ứng màu Protein với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G - 250) khả hấp thụ ánh sáng bước sóng 595nm Trong môi 46 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang trường axit Coomassie Brilliant Blue G - 250 liên kết chặt chẽ với Protein, tương tác với nhóm kỵ nước nhóm mang điện tích dương phân tử Protein làm dung dòch có màu xanh Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein dung dòch Dựa vào đường chuẩn Protein suy hàm lượng Protein mẫu Phản ứng cho màu Coomassie Tiến hành: Hóa chất: Chuẩn bò dung dòch mẫu Protein cần xác đònh Dung dòch Albumin chuẩn 1mg/ml Cách pha dung dòch Albumin: Cân xác 10mg Albumin pha 1ml nước cất lắc cho tan hết giữ 20oC Khi dùng pha loãng 100 lần để dung dòch Albumin 0,1mg/ml Pha thuốc thử Bradford: Cân 0,001g Coomassie Brilliant Blue 4,7g Ethanol 99 o 8,5g Acid Phosphoric 85%, đònh mức tới 100ml nước cất Đựng chai có nút đậy kín Thiết bò: máy đo màu quang điện Tiến hành: Lập đồ thò chuẩn: 47 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Lấy ống nghiệm đánh số từ đến cho vào chất theo bảng sau: ng số Dung dòch Albumin Nước cất Nồng độ Albumin 0.1mg/ml (ml) (ml) (µg) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 10 20 30 40 50 Thuốc thử Bradford (ml) 5 5 5 Bảng 2: lập đồ thò chuẩn dung dòch Albumin Lắc điều để yên lúc sau đem đo độ hấp thu ống bước sóng 595nm Từ xây dựng đồ thò chuẩn Chuẩn bò ống thí nghiệm: Ống thí nghiệm: 0,1ml dd Protein + 5ml dd Bradford Ống đối chứng: 0,1ml nước cất + 5ml dd Bradford (Có thể thay nước cất NaCl 0,15M) Đem đo độ hấp thu bước sóng 595nm ghi nhận mật độ quang (mật độ quang phải nằm khoảng đường chuẩn) Tính toán Từ bảng ống ống đối chứng ,vì lập đồá thò ta lấy trò số mật độ quang ống từ – trừ mật độ quang ống Đó độ hấp thu thực dung dòch Protein chuẩn,từ ta lập đồ thò biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn Với trục hoành nồng độ Protein trục tung mật độ quang Tương tự độ hấp thu thật Protein có ống thí nghiệm trò số mật độ quang ống thí nghiệm trừ ống đối chứng Sau đối chiếu vào đường cong mẫu suy lượng Protein có mẫu thí nghiệm 48 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Độ nhạy khả ứng dụng Phương pháp dùng cho Protein tan nước, phản ứng xảy nhiệt độ phòng Phương pháp nhạy 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh đơn giản nhiều cho phép xác đònh tới vài µg protein/ml đồng tời làm giảm ảnh hưởng muối, đệm, chất khử…Tuy nhiên phương pháp không dùng với chất có chứa surfactants gây kết tủa chất phản ứng Những chất có tính kiềm mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết Màu Coomassie làm bẩn cuvet thạch anh nên dùng cuvet thủy tinh để đo mật độ quang III Đònh lượng Protein phương pháp dùng Bicinchoninic Acid (BCA) [10] III.1 nguyên tắc: Dựa vào phản ứng Protein thuốc thử BCA môi trường kiềm tạo màu đỏ tía (tím), có độ hấp thu cực đại bước sóng 562nm Hình : Phản ứng cho axit bincinchoninic (BCA) Đầu tiên Protein khử Cu2+ thành Cu+ tạo thành phức có màu xanh môi trường kiềm Sau hai phân tử BCA kết hợp với Cu + tạo cho màu đỏ tía (tím) có độ hấp thu bước sóng 562nm 49 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang III.2 cách tiến hành: Cách tiến hành tương tự phương pháp Biure thay thuốc thử Biure thành thuốc thử BCA III.3 tính kết Cách tính kết tương tự phương pháp Biure III.4 độ nhạy khả ứng dụng Phương pháp nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure Nó phát long Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg nhưng tạp chất có hàm lượng Cu dù bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết hợp chất hữu cỏ phân tử có aminoacid, Cystine, Cystein, Tyrosine, Tryptophan bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết IV Đònh lượng Protein phương pháp quang phổ:[4] IV.1 Nguyên tắc: Dựa vào hấp thụ tia cực tím bước sóng 280nm Protein Các Protein hấp thụ tia cực tím cực đại bước sóng 280nm acidamin Tryptophan, Tyrozin phần Phenylalanin Sự hấp thu bước sóng 280nm chúng thay đổi tùy loại Protein hệ số tắc đo cho Protein cho phép tính nồng độ Protein tinh (hệ số tắc độ hấp thụ dd Protein 1% với đường truyền sóng qua 1cm) Protein IgG Hệ số tắt 13,6 Protein Chuỗi γ Hệ số tắt 13,7 IgM 11,8 Chuỗi µ 13,9 IgA 13,2 Chuỗi α 12,3 Protein Oncanavalin A Lactin Lens Calinaris BSA Hệ số tắt 120 12.5 6.7 50 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang IgD 15,3 Chuỗi nhẹ 12,3 Bảng 3: Hệ số tắt loại Protein liên quan với hệ miễn dòch bước sóng 280nm IV.2 Cách tiến hành: Nguyên liệu: Dung dòch Protein để đo, đệm hòa tan Protein Thiết bò: Máy đo quang phổ UV có Cuvet thạch anh đường truyền sóng 1cm Quá trình gồm bước sau: Bước 1: Ly tâm mẫu để loại bỏ phân tử phức hợp khác có thể huyền phù Lấy dòch để xác đònh mật độ quang học Bước 2: Chỉnh máy quang phổ bước sóng 280nm điều chỉnh độ hấp thụ với cuvet chứa đệm Bước 3: Đo mẫu đọc độ hấp thụ mẫu Nếu giá trò thu > 2,0 pha loãng mẫu (1/5 1/10) đường sáng truyền ngắn (2mm) số đọc nằm khoảng 0,5 đến 1,5 Bước 4: Lặp lại bước bước sóng 260nm Bước 5: Tính tỉ số hấp thụ 260nm/280nm Tỉ số nên nhỏ 0,6 Nếu lớn 0,6 Protein không có lẫn tạp chất khác đặc biệt với acid nucleic IV.3 Tính kết quả: Nồng độ Protein = độ hấp thụ 280nm hệ số tắt 280nm Với hỗn hợp Protein với loại Protein mà hệ số tắc tính sau: Nồng độ Protein = (1,55 x Độ hấp thụ 280nm) – (0,77 x Độ hấp thụ 260nm) Đơn vò: mg/ml Có thể đoán lượng acid nucleic dựa vào (độ hấp thu 280nm/độ hấp thu 260nm) 51 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang IV.4 Độ nhạy khả ứng dụng Đây phương pháp đơn giản để đo nồng độ Protein dung dòch Phương pháp không dùng cho dung dòch có nồng độ Protein thấp (dưới 0,05- 0,1 mg/ml) có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ m6t5 vùng cực tím (ví dụ: đệm, acid nucleic số chất béo) Protein dung dòch huyền phù So với phương pháp so màu phương pháp đơn giản hơn, nhanh hơn, mẫu dùng lại thường ổn đònh hóa phần lớn Protein V Phương pháp huỳnh quang O-Phthalaldehyde (OPA): [10] V.1 Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng O-Phthalaldehyde (OPA) với amin có mặt chuổi polypeptide (từ đầu đến cuối mạch kể phụ) Phản ứng xảy nhanh có mặt mercaptoethanol tạo sản phẩm huỳnh quang có màu xanh hấp thụ cực đại bước sóng 340nm -450nm V.2 Độ nhạy khả ứng dụng: Độ nhạy cao đạt tới 50ng/ml Có thể phát đắn peptide chí nhỏ Phương pháp sử dụng cho chất không chứa amin khác với amin chuỗi polypeptide VI Phương pháp đònh lượng amoniac.[4] VI.1 Nguyên tắc: Trong nguyên liệu chứa nitơ thường chứa loại nitơ nằm dạng vô (muối ammonium hay amin dễ bay ) Đây dạng nitơ tạo thành phân hủy protein (bò lên men thối trình khử carbonxyl amino acid) Những loại nitơ thường có tính kiềm yếu, cho tác dụng 52 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang với MgO loại nitơ nói bò đuổi khỏi dung dòch, nên chúng lôi theo nước qua bình đựng lượng thừa axit Sau đem đònh phân lượng axit dư, cho phép ta xác đònh loại nitơ 2(NH4)+ + Mg(OH)2 2NH3 + H2SO4 2NH3 + 2H20 + Mg2+ (NH4)2SO4 VI.2 Cách tiến hành: Hoá chất : • Dung dòch H2SO4 0,1N • DD NaOH 0,1N • DD alizarin natri sunfonat 1% nước • Dầu parafin hay cồn octylic • Thiết bò : máy cấy ammoniac Tiến hành : Bước : Rửa máy Cho nước cất vào bình A khoảng 2/3 thể tích bình, giọt thò alizarin natri sunfonat, cho H2SO4 0,1N giọt đến dung dòch chuyển sang vàng Cho nước bình B khoảng ½ thể tích bình, lắp nguồn nước làm lạnh vào ống sinh hàn, đun sôi bình A B cất kéo nước nước chảy trung tính Bước : cất đạm 53 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Cân lấy lượng xác m(g) hay V mẫu(ml) thực phẩm, cho vào bình B với nước trung tính cất kéo nước để rửa máy trên, sau cho thêm 0,5ml thò màu Cho MgO bột vào tới có phản ứng kiềm rõ rệt (màu tím) Để tránh bọt sủi phồng lên, cho thêm vào giọt dầu paraffin hay cồn octylic Đun sôi, nước từ bình A qua bình B kéo NH3 theo qua ống sinh hàn đọng lại, rơi xuống, bình chuẩn độ D đựng sẵn nước trung tính, thò màu V(ml) H 2SO4 thành (NH4)2SO4.H2SO4 thừa chuẩn độ NaOH 0,1N VI.3 Tính kết quả: Hàm lượng NH3 100g thực phẩm 1, *(v − vx ) *100 1000* m Hoặc 1000ml thực phẩm: 1, *(v − vx ) vm Trong đó: V : thể tích H2SO4 0,1N cho vào bình chuẩn độ Vx : thể tích NaOH O,1N dùng để chuẩ độ H2SO4 thừa M : khối lượng mẫu dùng để đònh lượng Vm : thể tích mẫu lấy để đònh lượng VI.4 Khả ứng dụng: Khi xác đònh lượng ammoniac thực phẩm, mặt xác đònh độ hư hỏng thực phẩm, mặt đánh giá giá trò protein, axit amin thực phẩm 54 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Thò Trân Châu, Hóa sinh đại cương, NXB Đại Học Sư Phạm [2] Phạm Thò Trân Châu, Nguyễn Thò Hiền, Phùng Gia Tường, Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo Dục (1997) [3] Phạm Thò Trân Châu, tạp chí sinh học, tập 9, 1981 [4] Phạm Thò nh Hồng, kỹ thuật sinh hóa, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM [5] Phạm Thò nh Hồng, Nguyễn Thò Huyên, Trần Mỹ Quang, thực tập sinh hóa sở, tủ sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM [6] TS Lê Thò Thanh Mai, Giáo trình thực tập sinh hóa [7] Nguyễn Văn Mùi, thực hành hóa sinh học, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội (2001) [8] PGS TS Đồng Thò Thanh Thu, Giáo Trình Sinh Hóa Cơ Bản [9] Vaxcrixenxki.P, Kỹ Thuật Phòng Thí Nghiệm – Phần I, NXB Đại Học Và Trung Học Chuyên Nghiệp [10] Các Wedsite www Proteomics-Protein Assays.htm www Page Protein Assays,pg.htm www Biochemistry-Protein-the chemistry of Protein www Biophysical chemistry G4170 Protein Visualization.htm 55 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang HCl 56 [...]... kết tủa sẽ thu được Protein III.2 khả năng ứng dụng: phương pháp này chỉ dùng cho các Protein tan trong nước và có độ chính xác tương đối cao 32 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang 33 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang PHẦN IV CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN I Đònh lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl:[4], [6] Theo nguyên tắc Protein được đònh lượng bằng cách xác đònh lượng nitơ tổng số... Sau khi làm khô các vùng có acid amin sẽ hiện thành màu tím trên nền trắng Dựa vào các thành phần acid amin xuất hiện trên giấy sắc ký.Xác đònh thành phần acid amin có trong dung dòch 27 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang PHẦN III CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH PROTEIN 28 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Ngoài các phản ứng trên có thể dùng để đònh tính Protein còn có các phương pháp sau đây: I Phản... dẫn xuất bằng phương pháp sác ký bản mỏng ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp enzyme aminopeptidase I.2 Xác đònh amino acid đầu C: Phương pháp hydrazyl hoá : Do giáo sư Akabori đề xuất Bản chất của phương pháp này là người ta cho hydrazine tác động với nhóm cacbonyl của amino acid đầu C tách phức trên bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và xác đònh tên của amino acid Tuy nhiên phương pháp này có hạn... tổng số và nitơ phi Protein sau đó xác đònh nitơ Protein Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein  Nitơ protein = Nitơ tổng số – Nitơ phi protein I.1 Đònh lượng Nitơ tổng số theo phương pháp KJELDAHL:[4] Nguyên tắc: Quá trình gồm 2 giai đoạn: • Giai đoạn vô cơ hóa: (quá trình tiến hành trong tủ hotte) nhiệt độ cao và dưới tác dụng của H 2SO4 thì các hợp chất có chứa nitơ sẽ bò phân hủy và bò... là coi Protein luôn chứa 16% là nitơ (vì trong phân tử Protein thì hàm lượng nitơ tương đối cao và khá ổn đònh khoảng 15 – 17%) 34 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang Trong thực tế bên cạnh Protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric… .Các chất này gọi là nitơ phi Protein Vì vậy trong trường hợp này cần phải xác đònh nitơ tổng số và nitơ phi Protein. .. cả các chất có chứa từ hai liên kết peptid trở lên đều có phản ứng này Trong môi trường kiềm mạnh,liên kết peptid trong phân tử protein phản ứng với CuSO 4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím đỏ Màu của dung dòch tùy thuộc vào lượng Cu và số lượng các liên kết peptid trong phân tử chất tham gia phản ứng Phản ứhg Biure: Biure là một dẫn xuất của ure có chứa liên kết peptid Phản ứng với protein: các. .. Cuối cùng phun lên giấy dung dònh Na 2CO3 10% quan sát, so sánh và giải thích các kết quả nhận được II.9 Phản ứng với acid nitơ (HNO2) (phương phápVan Slyke) [4] Nguyên tắc Dưới tác dụng của HNO2 , acid amin bò dezamin dezamin hóa tạo thành nitow ở dạng khí Phản ứng này được sử dụng để đònh lượng các α-acid amin( phương pháp Van Slyke) Phản ứng xảy ra như sau: COOH | H2N – CH + O=N – OH | R → COOH... acid đầu C trên nhờ phương pháp chụp phóng xạ Ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp thủy phân nhờ enzym carboxypeptidase để cắt riêng và xác đònh amino acid đầu C 11 Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thò Thu Sang II Các phản ứng nhận biết các acidamin đặc trưng II.1 Phản ứng ninhydrin :[4] Nguyên tắc: Tất cả các α-acid amin của protein đều phản ứng với ninhydrin tạo thành hợp chất màu xanh tím(hấp thụ cực... CH – C O OH Phương pháp oxazolone: Do nhà khoa học người Nhật Matsuo đề xuất Bản chất của phương pháp này là: cho nhóm COOH của amino acid đầu C tác động với acetate anhydride tạo ra cấu trúc mạch vòng oxazolone Trong môi trường kiềm cho một nguyên tử H của mạch vòng này trao đổi với đông vò H 3 tạo ra dẩn xuát phóng xạ Tiến hành sắc ký để tách và xác đònh amino acid đầu C trên nhờ phương pháp chụp phóng... natri Các acid amin Acid amin chứa lưu da cam N2 bay ra Đỏ tía 12 nitropruxit Lowry nitropruxit hùynh Acid phosphmolidic Tryptophan,tyrozin, 8 Isatin 9 Acid protein chứa acid phosphovonphramic amin vòng xanh III Phương pháp tạo tủa với TCA (acid tricloacetic) III.1 nguyên tắc: TCA là một acid hữu cơ có khả năng làm kết tủa Protein trong dung dòch Khi cho TCA vào dung dòch thì nó làm kết tủa Protein