ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã Số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người Hướng Dẫn Khoa Học: PGS TS Lê Thị Hồng Hảo Hà Nội – 2015 MỞ ĐẦU Việt Nam nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho phát triển thực vật coi kho tàng vô giá nguồn thuốc dược liệu quý Trong alkaloid thành phần hoạt tính nhiều thuốc Alkaloid amin nguồn gốc tự nhiên thực vật tạo ra, amin động vật nấm tạo gọi alkaloid Cấu trúc bao gồm carbon, hydro, nitơ, thường có oxy Các alkaloid bazơ hữu tương tự kiềm (bazơ vô cơ); tên có nghĩa kiềm Alkaloid xuất chủ yếu chi khác thực vật có hạt, chẳng hạn thuốc phiện thuốc lá, mã tiền… Chúng tìm thấy hầu hết phận loại thực vật này, bao gồm lá, rễ, hạt, vỏ Mỗi phần thực vật thường có chứa số chất hóa học liên quan đến alkaloid Chức alkaloids chuyển hóa thực vật chưa biết, hầu hết alkaloid có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ thống thần kinh người động vật khác Trong số hàng trăm alkaloid tìm thấy tự nhiên, có khoảng 30 chất sử dụng thương mại Một số alkaloid, chẳng hạn nicotin, sử dụng thuốc trừ sâu, số khác sử dụng làm thuốc thử hóa học Tuy nhiên, alkaloid sử dụng chủ yếu y học, chúng tác động cách nhanh chóng khu vực cụ thể hệ thần kinh Alkaloid thành phần hoạt tính nhiều thuốc gây mê, thuốc an thần, chất kích thích thuốc an thần Chúng dùng đường uống tiêm Ngoại trừ giám sát bác sĩ, sử dụng alkaloid nguy hiểm, hầu hết hình thành thói quen (ví dụ, gần tất chất ma tuý alkaloid) dùng liều lượng lớn độc hại Trong dân gian ta thường sử dụng thảo dược cà độc dược, mã tiền, củ ấu tàu… dùng để chữa bệnh loại có chứa hàm lượng không nhỏ chất độc nhóm alkaloid Hiện nay, số loại thực phẩm chức có nguồn gốc thảo dược sử dụng loại có thành phần chiết xuất từ thuốc có hoạt chất alkaloid, terpenoid, phenolic… biết đến hợp chất thứ cấp Sử dụng loại thực phẩm chức dao hai lưỡi, dùng với liều lượng vừa phải có tác dụng chữa số bệnh song dùng không cách liều dẫn đến ngộ độc biến chứng Vì sử dụng thực phẩm chức có chứa alkaloid độc phải cẩn trọng phải quản lý cho phép quan chức Tuy nhiên, Việt Nam việc xác định đồ ng thời alkaloid đô ̣c thực phẩm chức chưa nghiên cứu Do vậy, để góp phần kiểm soát nguy tiềm ẩn để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng giúp quan chức quản lý đưa khuyến cáo nhằm giảm nguy ngộ độc sử dụng thực phẩm chức có ngồn gốc thảo dược Chúng tiến hành đề tài: “Tách xác định số độc tố nhóm alkaloids thực phẩm chức phương pháp sắc ký lỏng khối phổ” CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nhóm alkaloid 1.1.1 Lịch sử phát Năm 1804- 1805, nhà hóa học Pháp Đức phân lập morphin điều chế dạng muối Đồng thời chứng minh morphin hoạt chất thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt Năm 1980, từ vỏ canhkina, chiết kết tinh chất đặt tên “cinchonino” sau hai nhà hóa học Pháp xác định cinchonino hỗn hợp hai alkaloid quinin cinchonin Năm 1918, phát alkaloid hạt mã tiền strychnin brucin; phát cafein chè, cà phê Sau tiếp tục phát nicotin thuốc lá, atropin cà độc dược, theobromin cacao, codein thuốc phiện, cocain coca Giữa năm 1973, người ta xác định 4959 alkaloid khác có 3293 chất xác định công thức hóa học Hiện phát nhiều alkaloid đưa vào ứng dụng y học ngày tăng [15] 1.1.2 Khái quát nhóm alkaloid 1.1.2.1 Khái niệm Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập kiềm Alkaloid là: - Những hợp chất hữu có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp nhiều loài thực vật tìm thấy vài loài động vật - Có phản ứng kiềm cho muối với acid muối dễ kết tinh - Có hoạt tính sinh học quan trọng - Có số phản ứng chung tạo “tủa“ cần thiết cho xác định chúng Chúng nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng nhiều mặt Đặc biệt lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao độc đáo [15] [16] 1.1.2.2 Cấu tạo hóa học Về mặt hóa học, phong phú đa dạng alkaloid trở thành chuyên nghành, chiếm vị trí quan trọng lĩnh vực nghiên cứu tạp chí thông tin hóa học Đối với việc nghiên cứu alkaloid quan trọng chúng có hệ thực vật nhiệt đới phong phú nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có nguyên tử N phân tử, chủ yếu nằm vòng Sự có mặt nguyên tử N cấu trúc định tính bazơ alkaloid chỗ dựa quan trọng cho nhà hóa học nghiên cứu alkaloid [15] 1.1.2.3 Phân loại Các alkaloid biết có đến 250 dạng cấu trúc khác với 5.500 hợp chất alkaloid tự nhiên Vì cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân trước (khoảng 20 nhóm cấu trúc) chưa đáp ứng nên ngày có xu hướng chia chúng thành nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin, Strychnin, Echitamin Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin chia thành nhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin…Có ý kiến xếp hợp chất có N vòng Colchicin, Hordenin, protoalkaloid [15] [27] 1.1.2.4 Sự phân bố Cromwell (1995) ước tính alkaloid phân bố khoảng phần loài thực vật có hoa Một ước tính khác (Hegnauer, 1963) cho alkaloid có từ 12%-20% tổng số có nhựa Còn Willaman Schubert (1955) cho 300 họ nghành hạt kín 1/3 họ có chứa alkaloid Nhiều tổng kết cho thấy đại đa số có chứa alkaloid hai mầm Chỉ có số chứa alkaloid mầm nghành hạt trần Theo thống kê đến thuộc thảo bụi có nhiều alkaloid gỗ, trọng lượng phân tử alkaloid gỗ thường bé trọng lượng phân tử thuộc thảo Cây năm có nhiều alkaloid lưu niên (Levin, 1976) Alkaloid loài sống nước ngoại trừ họ sen (Nympheaceae) (Mc.Nair.1943) Thực nhiều loài có alkaloid mức độ dạng vết tỷ lệ phần vạn, mười vạn Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, xem có alkaloid phải chứa 0.05% alkaloid so với dược liệu khô Mối liên quan alkaloid với chất khác nghiên cứu Cây có chứa alkaloid vắng mặt tinh dầu ngược lại (Trelibs,1955) [27] 1.1.2.5 Tính chất Alkaloid bazơ yếu, có mặt nguyên tử N Nhưng độ kiềm alkaloid không giống ảnh hưởng khác lớp điện tích nguyên tử N gây ảnh hưởng nhóm chức khác Nói chung tính bazơ giảm dần theo thứ tự amoni bậc 4, amoni bậc 1, amoni bậc 2, amoni bậc Hầu hết alkaloid bazơ thực tế không tan nước tan dung môi hữu CHCl3, eter ancol bậc thấp (methanol, ethanol, butanol) Một số nhóm alkaloid có thêm nhóm phân cực nên tan phần nước kiềm Ví dụ: Morphine, Cephalin, có nhóm OH phenol nên tan dung dịch kiềm bazơ chúng gần không tan eter Ngược lại với bazơ, muối alkaloid nói chung tan nước cồn không tan dung môi hữu như: CHCl3, eter, benzene Có số trường hợp ngoại lệ Ephedrin, Cochicin, Ecgovonin, bazơ chúng tan nước tan dung môi hữu muối chúng ngược lại Alkaloid có N – Bậc N – oxide bazơ alkaloid có N – Bậc N – oxide khác tan nước kiềm tan dung môi hữu Các muối chúng có độ hòa tan khác tùy thuộc vào gốc acid tạo chúng Vì chiết chúng dung dịch kiềm kết tủa dạng muối có độ hòa tan thấp Đối với alkaloid N – oxide dùng phản ứng khử Oxy bột kẽm môi trường HCl để chúng chuyển thành alkaloid dạng thường sau kết tủa kiềm chiết dung môi hữu [14] 1.1.3 Cấu tạo số alkaloid độc Bảng 1.1 Cấu trúc hoá học số alkaloid độc xác định đề tài STT Alkaloid Công thức phân tử Khối lượng phân tử (g/mol) pKa C23H26N2O4 394,46 8,28 C21H22N2O2 334,41 8,26 C34H47NO11 645,74 5,88 Brucin 10,11Dimethoxystrychnine Strychnin (4aR,5aS,8aR,13aS,15aS, 15bR)4a,5,5a,7,8,13a,15,15a,15 b,16-decahydro-2H-4,6methanoindolo[3,2,1ij]oxepino[2,3,4de]pyrrolo[2,3h]quinoline-14-one Aconitin Acetylbenzoylaconine Công thức cấu tạo Atropin (RS)-(8-Methyl-84 azabicyclo[3.2.1]oct-3-yl) C17H23NO3 289,37 4,35 C17H21NO4 303,35 7,75 C20H22N2O 306,41 _ C22H25N O6 399,44 12,35 C10H14N2 162,23 8,5 3-hydroxy-2phenylpropanoate Scopolamin (–)-(S)-3-hydroxy-2phenylpropionic acid(1R,2R,4S,7S,9S)-9methyl-3-oxa-9azatricyclo[3.3.1.02,4]no n-7-yl ester Koumin 7,20(2H,19H)6 Cyclovobasan, 1,2,18,19tetradehydro-3,17-epoxy, (3R,7alpha,20alpha)- Colchicin N-[(7S)-1,2,3,107 Tetramethoxy-9-oxo5,6,7,9tetrahydrobenzo[a]heptal en-7-yl]acetamide Nicotin (−)-1-Methyl-2-(3- pyridyl)pyrrolidine,(S)-3(1-Methyl-2-pyrrolidinyl) pyridine 1.1.4 Tác dụng độc tính số alkaloid Các chất nghiên cứu thuộc nhóm alkaloid chúng có tác dụng lên hệ thần kinh, tim mạch hô hấp [3] [12] Khi dùng với hàm lượng nhỏ chúng có tác dụng chữa bệnh dùng với hàm lượng lớn gây ngộ độc dẫn đến tử vong alkaloid độc Bảng 1.2 giới thiệu giá trị LD50 (liều lượng chất độc gây chết cho nửa số cá thể nghiên cứu) [24] Bảng 1.2 Các giá trị LD50 chất phân tích Tên chất Brucin Strychnin Colchicin Koumin Scopolamin Nicotin Aconitin Atropin LD50 chuột đường LD50 chuột đường uống (mg/kg) tiêm (mg/kg) 150 12 2,2 0,16 5,886 100 1270 650 0,12 75 30 1.1.4.1 Brucin strychnin Brucin strychnin alkaloid đắng, brucin có liên quan chặt chẽ với strychnin Hai chất xuất số loài thực vật, biết đến nhiều alkaloid vỏ, lá, hạt mã tiền tìm thấy Đông Nam Á Hạt chứa khoảng 1,5% strychnin, hoa khô chứa khoảng 1,023 %, vỏ chứa hợp chất độc, bao gồm brucin [5] Strychnin alkaloid không màu, tan dầu lửa nước, không tan ethyl eter Strychnin trích từ hạt mã tiền hay nhân, độc, chất strychnin ghi vào bảng A dược điển Trong y học dân gian, mã tiền dùng thuốc bổ lành bệnh kích thích thèm ăn loại thuốc vi lượng đồng căn, dùng cho vấn đề tiêu hóa thông thường, nhạy cảm với nhiệt độ lạnh, cáu kỉnh khó chịu sử dụng thuốc bổ cho hệ thống tuần hoàn trường hợp bị chứng suy tim Strychnin dạng tinh thể sử dụng làm thuốc trừ sâu, đặc biệt để giết chết động vật có xương sống nhỏ loài chim động vật gặm nhấm Strychnin gây co giật bắp cuối chết ngạt ÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Quốc Bình, Đỗ Thị Oanh (2011), "Góp phần nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu bán thành phẩm cà độc dược sử dụng chế phẩm Camat", tạp chí Dược học,421,tr.45-49 Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Khoa dược (2008), "Giáo trình dược liệu", tập II, NXB ĐH Y Dược TP.HCM Phạm Thanh Kỳ (1998), "Bài giảng dược liệu", tập II, NXB Đại học Dược Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao, ĐH Quốc Gia Hà Nội Lương Thị Phấn (2014), Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin brucin huyết tương phương pháp HPLC, khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà nội Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 9 Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng hóa học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê Hóa học phân tích, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 11 Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh (2011), "Nghiên cứu phân lập nhận dạng cấu trúc alkaloid dịch chiết từ vông nem Thừa Thiên Huế", tạp chí Khoa học Đại học Huế, 65, tr.225-230 12 Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 1, NXB Y học 13 Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 2, NXB Y học 14 Trường Đại học Dược Hà Nội (2001), Dược liệu, Nhà xuất Y học 15 TS Đỗ Thị Tuyên Viện CNSH Việt Nam , Bài giảng công nghệ tách chiết hợp chấ t thứ sinh 16 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, NXB khoa học kỹ thuật 17 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, NXB khoa học kỹ thuật 18 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), "Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật", NXB Khoa học Kỹ thuật Tiếng Anh 19 AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requirements for method verification, USA 20 Borbla Boros, Agnes Farkas, Silvia Jakabova, Ivett Bacskay (2000), “LC-MS Quantitative Deterrmination of Atropine and Scopolamine in the Floral Nectar of Datura Species”, Journal of Chromatographia, 58, 1–37 21 Dirk Steinmann, Markus Ganzera (2011), “Recent advances on HPLC/MS in medicinal plant analysis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 55, 744-757 22 Hua-Tao Feng, Sam F.Y Li (2002), “Deterrmination of five toxic alkaloids in two common herbal medicines with capillary electrophoresis”, Journal of Chromatography A, 1-2, 243–247 23 Huiqin Wu, Xiaoting Xiong, Xiaolan Huang, Zhixin Zhu (2013), “ Simultaneous deterrmination of 17 toxic alcaloids in human fluids by liquid chromatography coupled whith electrospray ionization tandem mass spectrometry”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 36:9, 1149-1162 24 Goodman, L (2006), “Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics” (11 ed.), New York: McGraw-Hill 25 José Diana Di Mavungu, Svetlana V Malysheva, Melanie Sanders, Daria Larionova (2012), “Development and validation of a new LC–MS/MS method for the simultaneous deterrmination of six major ergot alcaloids and their corresponding epimers Application to some food and feed commodities”, Food Chemistry, 135, 292–303 26 Miao Li, Xiao-Fang Holi, Jie Zhang, Si-Cen Wang, Qiang Fu, Lang-Chong He (2011), “Applications of HPLC/MS in the analysis of traditional Chinese medicines”, Journal of Pharmacertical Analysis, 1:2, 81- 91 27 Lounasmaa M.; Tamminem T.(1993), The Alkaloids, Academic Press: New York, 114 28 Peihong Qiu, Xiaohong Chen, Xiang Chen (2008), “Simultaneous deterrmination of five toxic alkaloids in body fluids by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 875(2), 471–477 29 R.E Ardrey (2003), “Liquid chromatography-mass spectrometry: an introduction”, New York, J Wiley 30 Somenath Mitra (2003), “Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry’’, John Wiley & Sons 31 Tadeusz Aniszewski (2012), Alcaloids - Secrets of Life, Alkaloid Chemistry, Biological Significance and applications and ecological Role, Elsevier Science 32 Xie Y, Jiang ZH, Zhou H, Xu HX, Liu L (2005), “ Simultaneous deterrmination of six Aconitum alkaloids in proprietary Chinese medicines by high-performance liquid chromatography’’, Journal Chromatography A, 1093(1-2), 195-203 33 Kang XQ1, Fan ZC, Zhang ZQ (2010), “Simultaneous deterrmination of three Aconitum alkaloids in six herbal medicines by high-performance liquid chromatography”, Journal Chromatography Science, 48(10),860-865 34 Yu L, Xu Y, Feng H, Li SF (2005), “Separation and deterrmination of toxic pyrrolizidine alkaloids in traditional Chinese herbal medicines by micellar electrokinetic chromatography with organic modifier’’, Electrophoresis, 26(17), 397-404