TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC BÁO CÁO TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM BOTULINUM Môn học: Vi sinh đại cương GVHD: Vương Thị Việt Hoa Sinh viên: Nguyễn Văn Nhi MSSV: 13139119 Lớp: DH13HH I Đặt vấn đề Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page Từ xa xưa, người biết đến sử dụng vi sinh vật ứng dụng vi sinh vật thực phẩm Các trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm ứng dụng đặc tính sinh học chủng vi sinh vật Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò vi sinh vật, việc ứng dụng vi sinh vật sản suất ngày rộng rãi có hiệu Trong tự nhiên vi sinh vật có lợi có vi sinh vật có hại như: chuẩn vi khuẩn gây bệnh cho người, trồng, động vật thuỷ sản, nhóm vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm, gây ô nhiễm môi trường xung quanh Chính ta cần phải tìm hiểu toàn có liên quan đến vi sinh vật để sử dụng tối đa đặc tính có hại đề phòng ảnh hưởng chúng đem lại II Tổng quan *Tổng quan độc tố vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Thực phẩm chứa thành phần dưỡng chất, thích hợp cho phát triển số lớn vi sinh vật Chúng tồn tồn thực phẩm gây hư hỏng hay gây bệnh cho người Các loại vi sinh vật thường gặp công nghệ thực phẩm nấm mốc, vi khuẩn, nấm men, *Giới thiệu Clostridium botulinum *Lịch sử phát Vào năm 1895, Emile Van Ermengem người phát ngộ độc botulin dăm ruột già người bị chết ngộ độc thịt Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page Hình: Emile Van Ermengem Đến năm 1896, Emile Van Ermengem tìm mầm bệnh ngộ độc thịt (vi khuẩn Clostridium botulinum), loại sống kị khí, có nha bào, khó bị tiêu diệt Sau này, tác nhà khoa học khác thấy chúng đất, ruột cá, đồ hộp thịt cá, phân người Chúng có chất độc botulin, làm tổn thương hệ thần kinh trung ương (đặc biệt đến tín hiệu từ não đến bắp), gây liệt rõ liệt mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt vòm miệng, lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm gây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử vong cao (70%) Chúng có nhiều loại A, B, C, D, E loại A, B, E cho độc tố mạnh Nhưng sau chứng kiểu hình kiểu gen đáng kể tồn để chứng minh tính không đồng loài Điều dẫn đến việc phân loại lại Clostridium botulinum loại G giống loài Năm 2003 gen Clostridium botulinum công bố (công trình viện Sanger với Tiến sĩ Roger Huston Tiến sĩ M Peck) *Phân loại Hình: Vi khuẩn Closridium botulinum Phân loại Closridium botulinum: Ngành: Firmicutes Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page Lớp: Clostridia Bộ: Clostridiales Họ: Clostridiaceae Chi: Clostridium Clostridium botulinum gồm có chủng tùy thuộc vào loại độc tố A, B, C, D, E, F, G Khi phát triển thực phẩm, Clostridium botulinum tiết loại độc tố gây ngộ độc nguy hiểm, gây chết người tác động lên hệ thống thần kinh Trong số loại A, B, E F gây bệnh người.Types C and D cause disease in animals Các loại C D gây bệnh động vật.Type G has not yet been confirmed to cause illness in humans or animals.8, Type A is the most potent toxin known and an estimated dose of this toxin required to cause death in humans vary between 0.1 to 1.0 micrograms Loại G chưa xác nhận để gây bệnh người hay động vật *Đặc điểm *Đặc điểm chung Clostridium botulinum vi khuẩn kỵ khí di động da dạng, tồn đất, phân động vật, ruột cá Chúng vi khuẩn sinh độc tố botulin nguyên nhân gây tê liệt cơ, phát triển thuận lợi nhiệt độ 26-280C, sinh khí hydro sulfur (H2S) sinh Có đặc điểm chung kiểu hình hình thành nội bào tử nhiệt kháng cự hóa học, diện gram dương cấu tế bào sinh dưỡng, có trao đổi chất kỵ khí làm lên men Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum chủ yếu đặc trưng khả sản xuất độc tố ngoại bào protein nhiều nhóm vi khuẩn khác *Đặc điểm nuôi cấy/sinh hóa Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum phát triển pH acid thấp 4,5 Nồng độ muối 1% ngăn cản phát triển vi khuẩn Clostridium botulinum sử dụng lactose nguồn carbon Clostridium botulinum chia thành bốn nhóm khác dựa đặc điểm sinh hóa sinh lý Những nhóm bao gồm: Nhóm I – nhóm bao gồm: - Chủng độc tố loại A Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page - Những biến dạng thủy phân protein độc tố loại B F - Những kiểu độc tố kép AB, AF, BF Đặc điểm nhóm bao gồm: cong với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 35 - 40 0C, sản xuất bào tử với khả chịu nhiệt cao, độ pH tối thiểu ức chế hoạt động vi khuẩn nước 0,94 - 4,6 Nhóm II – nhóm bao gồm: - Chủng độc tố loại E - Những biến dạng không thủy phân protein phân giải đường độc tố loại B F Đặc điểm nhóm bao gồm: thẳng với lông roi có lông rung rải rác, nhóm ưa lạnh nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 18 – 25 0C, sản xuất bào tử với khả chịu nhiệt thấp, độ pH tối thiểu ức chế hoạt động vi khuẩn nước 0,97 - Nhóm III – nhóm bao gồm: - Chủng độc tố loại C D - Những biến dạng nói chung thủy phân protein Đặc điểm nhóm bao gồm: thẳng với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 35 - 40 0C, sản xuất bào tử với khả chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu ức chế hoạt động vi khuẩn nước chưa biết Nhóm VI – nhóm bao gồm: thủy phân protein chủng độc tố loại G Đặc điểm nhóm bao gồm: thẳng với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 35 - 40 0C, sản xuất bào tử với khả chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu ức chế hoạt động vi khuẩn nước chưa biết *Cấu trúc Clostridium botulinum *Cấu trúc tế bào Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page Clostridium botulinum vi khuẩn Gram dương (+),kích thước khoảng 0,3 – 0,7µm × 3,5 – 7,0 µm, có roi Sinh bào tử, bào tử thường to chiều ngang tế bào a Thành tế bào Thành tế bào giúp trì hình thái tế bào, giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ trình phân cắt tế bào, cản trở xâm nhập số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể Thành phần b Bảng 2.1: Thành phần vi khuẩn gam (+) Tỷ lệ % khối lượng khô tế bào Peptidoglycan 30-95 Acid teicoic (Teichoic acid) Cao Lipid Hầu Protein Không có có Màng sinh chất Màng sinh chất vi khuẩn tương tự sinh vật khác Chúng cấu tạo lớp phospholipid, chiếm 30-40% khối lượng màng, protein (nằm trong, hay xen màng), chiếm 60-70% khối lượng màng Đầu phosphat PL tích điện, phân cực, ưa nước ; đuôi hydrocarbon không tích điện, không phân cực, kỵ nước Có chức chủ yếu sau đây: - Khống chế qua lại chất dinh dưỡng, sản phẩm trao đổi chất - Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường tế bào - Là nơi sinh tổng hợp thành phần thành tế bào polyme bao nhày (capsule) - Là nơi tiến hành trình phosphoryl oxy hoá trình phosphoryl quang hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng) - Là nơi tổng hợp nhiều enzym, protein chuỗi hô hấp Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page Hình : Cấu trúc đầu đuôi phospholipid c Tế bào chất Là phần vật chất dạng keo nằm bên màng sinh chất, chứa tới 80% nước Trong tế bào chất có protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, ion vô nhiều nhiều chất khác có khối lượng phân tử thấp Bào quan đáng lưu ý tế bào chất ribosom Ribosom nằm tự tế bào chất chiếm tới 70% trọng lượng khô tế bào chất, gồm tiểu phần (50S 30S) kết hợp với tạo thành ribosom 70S (S đơn vị Svedberg- đại lượng đo tốc độ lắng ly tâm cao tốc) Hình: Ribosom vi khuẩn Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page Trong tế bào chất vi khuẩn gặp chất dự trữ hạt glycogen, hạt PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat), Cyanophycin, Phycocyanin, hạt dị nhiễm sắc (metachromatic body), giọt lưu huỳnh d Thể nhân Thể nhân vi khuẩn dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên hình dạng cố định, gọi vùng nhân Khi nhuộm màu tế bào thuốc nhuộm Feulgen thấy thể nhân màu tím Đó nhiễm sắc thể dạng vòng chứa sợi ADN xoắn kép e Bao nhầy Thành phần chủ yếu bao nhầy polysaccarid, có polypeptid protein Trong thành phần polysaccarid glucose có glucozamin, ramnose, acid 2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic Ý nghĩa sinh học bao nhầy là: - Bảo vệ vi khuẩn điều kiện khô hạn - Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn thiếu thức ăn - Là nơi tích luỹ số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan ) - Giúp vi khuẩn bám vào giá thể *Cơ chế gây bệnh Clostridium botulinum Clostridium botulinum tiết độc tố sinh học mạnh ức chế phóng thích hoạt động bó cơ, tác động đến nơi tiếp hợp cholinergic qua trung gian Calcium vào khe synape làm khả chi phối hóa học chổ hoạt động thần kinh sợi nơron vận động thoi Hoạt chất tác động nơi tiếp hợp thần kinh nên ngăn cản phóng thích acetylcholine gây liệt Độc tố Clostridium botulinum tác dụng qua giai đoạn: Kết nối, thâm nhập, ức chế phóng thích chất dẫn truyền thần kinh Độc tố không ảnh hưởng vào tổng hợp hay dự trữ acetylcholine ảnh hưởng vào phóng thích chất sợi tận Nguyễn Văn Nhi 13139119 tiền tiếp hợp Page Cơ chế gây bệnh Clostridium botulinum *Bệnh triệu chứng Nguồn lây bệnh: Các thực phẩm dễ bị nhiễm Clostridium botulinum thường rau ướp muối, chế biến mứt gia đình, bán thành phẩm từ thịt, cá vài đồ hộp không đảm bảo yêu cầu vệ sinh chế biến khử khuẩn Biểu bệnh: Thời kỳ ủ bệnh thường 12 - 36 từ đến ngày với triệu chứng đau bụng, buồn nôn, đau đầu, chóng mặt, hoa mắt, khó nuốt, khó thở bệnh kéo dài từ - ngày tỷ lệ tử vong tới 60%-70% Ngộ độc Clostridium botulinum phụ thuộc vào nhiều điều kiện yếu tố môi trường, đặc tính thực phẩm, biện pháp bảo quản, tập quán sinh hoạt ăn uống cá nhân mà nguồn thực phẩm gây ngộ độc khác Ở Nga, ngộ độc chủ yếu cá, Mỹ đồ hộp rau quả, Đức ăn thức ăn làm thịt chế biến sẵn, ăn nguội, dăm bông, xúc xích Các triệu chứng: bệnh xuất với dấu hiệu lâm sàng chủ yếu liệt thần kinh tổn thương thần kinh trung ương hành tủy Triệu chứng sớm liệt mắt, mắt, có biểu song thị nhìn hóa hai; bị liệt vòm họng, lưỡi, yết hầu biểu rối loạn lời nói tiếng, phản xạ nuốt; bị liệt dày, ruột dẫn đến táo bón, chướng bụng, giảm tiết dịch, Bệnh nhân không sốt mạch nhanh, mạch tăng nhanh nhiệt độ thể bình thường, có tượng mạch-nhiệt phân ly Các loại thực phẩm nhiễm Clostidium botulinum: phát đồ hộp (thịt, cá, patê, xúc xích, rau ), lạp xưởng, thịt đùi lợn, cá ướp muối phơi khô xông khói thức ăn chế biến sẵn mật ong Thực phẩm nhiễm Clostridium botulinum khó nhận biết cảm quan, nhận biết sau sử dụng qua dấu hiệu lâm sàng Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page *Sự phân bố Clostridium botulinum Clostridium botulinum bào tử phổ biến rộng rãi môi trường xảy chủ yếu đất trầm tích biển Chúng bao gồm: - Đất trồng trọt đất rừng - Cặn đáy suối, hồ ven biển nước Tỷ lệ Clostridium botulinum toàn giới thay đổi tùy theo khu vực địa lý, mà nhiều khả có liên quan đến thành phần vật lý hoá học đất vi sinh vật nơi Ví dụ loại ưa lạnh loại không thủy phân protein nhóm B E tìm thấy phổ biến đất có độ lạnh thông thường cặn đáy loại thủy phân protein ưa nhiệt độ trung bình nhóm A va B tìm thấy phổ biến đất ẩm Ngoài ra, mầm bệnh bào tử có số nơi khác như: – Trong đường tiêu hóa loài cá, chim dày động vật có vú – Mang nội tạng động vật có vỏ cua loài sò hến – Trong mật ong loài ong – Bào tử Clostridium botulinum kháng cự căng thẳng môi trường (thì) tìm thấy vài thức ăn, bụi, chất xịt (bình xịt), chất thải môi trường khác *Tình hình nhiễm Clostridium botulinum thực phẩm giới Việt Nam – Tai Việt Nam: Hiện sinh hoạt hàng ngày, loại thực phẩm đóng hộp có mặt phổ biến thị trường nhiều người tiêu dùng sử dụng Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại quan tâm đến vấn đề dự trữ loại thực phẩm nhà để đối phó với khó khăn xảy Một thực phẩm thường dự trữ loại thực phẩm đóng hộp Nếu mua sử dụng loại đồ hộp không cẩn thận, người bị ngộ độc ăn phải mầm bệnh phát triển loại thực phẩm Ngộ độc thường ghi nhận bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum có đồ hộp, gây tử vong Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 10 – Tại số nơi giới: 161 dân làng tỉnh Nan (miền Bắc Thái Lan) phát bệnh sau ăn măng tre muối muối chua lễ hội Nhân viên y tế Thái Lan cho dịch bệnh tỉnh Nan bảo quản măng tre không tốt tạo vi khuẩn Clostridium botulium có độc tố chết người Độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum độc tố mạnh sử dụng làm vũ khí sinh học Độc tố gây tử vong làm tê liệt hô hấp làm người bệnh không thở III Các phương pháp phát Clostridium botulinum *Phương pháp truyền thống Thử nghiệm độc tố Clostridium botulinum chuột Trong tất phương pháp pháp xác định độc tố botulinum thực phẩm phương pháp phát thể chuột tiêu chuẩn để xác định độc tố Sự diện chất độc phát cách tiêm vào chuột trích xuất từ thực phẩm sau quan sát cho đặc tính triệu chứng bệnh ngộ độc chuột chết sau khoảng thời gian 48 A Thiết bị vật liệu Tủ lạnh Khăn khô Đèn Bunsen Gạc thấm vô khuẩn mở Cối chày vô trùng Chiếc kẹp vô trùng Những ống hút nút vô trùng Thiết bị pipet khí (không hút pipet miệng) Những ống nghiệm nuôi cấy 10 Bình kỵ khí 11 Dây cấy vòng Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 11 12 Vườn ươm 35 - 280C 13 Bình mẫu vô trùng 14 Những giá treo đồ ống nghiệm nuôi cấy 15 Những tiêu hiển vi 16 Kính hiển vi 17 Đĩa petri vô trùng 100 mm 18 Máy ly tâm ống 19 Máy ly tâm, làm lạnh, tốc độ cao 20 Tripsin 21 Những ống tiêm ml, gạc thấm vô khuẩn,với 25 số đo, 5/ kim inch để tiêm thuốc chuột 22 Chuột nặng 16-24 G 23 Những lồng chuột, thức ăn, bình lấy mẫu nước,… 24 Lọc Millipore kích thước lỗ 0,45 μm B Môi trường thuốc thử Dung dịch cồn iốt (4% iốt 70% ethanol) Canh gan thịt Dung dịch Trypticase trích xuất từ peptone-men glucose, canh thịt (TPGY) với trypsin (TPGYT) Lagg volk lagg volk agar kỵ khí Gạc thấm vô khuẩn, đệm phốt phát chất gien, độ pH 6.2 Ethanol tuyệt đối Chất phản ứng nhuộm gam tím crystal violet dung dịch methylene blue Nước muối sinh lý học vô khuẩn Chế phẩm thuốc kháng độc loại AF (lấy từ CDC) 10 Dung dịch Trysin 11 Dung dịch Sodium hydroxide N 12 Dung dịch Axít clohiđric N C Chuẩn bị mẫu Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 12 - Kiểm tra sơ bộ: Mẫu giữ lạnh thử nghiệm, trừ loại thực phẩm đóng hộp chưa mở, mà không cần phải làm lạnh Trước thử nghiệm, ghi tên sản phẩm, tên nhà sản xuất chủ sản xuất, nguồn gốc mẫu, loại container kích cỡ, nhãn mác, lô hàng sản xuất, mã sản xuất, tình trạng container Làm container đánh dấu với mã số nhận dạng phòng thí nghiệm - Thực phẩm rắn lỏng: Chuyển giao loại thực phẩm vô trùng lỏng Ngoài ra, cấy miếng nhỏ sản phẩm trực tiếp vào canh môi trường với kẹp vô trùng Cấy loại thực phẩm lỏng trực tiếp vào canh môi trường với pipet vô trùng Dự trữ mẫu sau nuôi cấy cho vào ống nghiệm để dành sau sử dụng lại - Mở loại thực phẩm đóng hộp: Kiểm tra bề sản phẩm mùi Ghi nhớ chứng phân hủy Đừng nếm sản phẩm trường hợp D Phát Clostridium botulinum Tăng sinh Loại oxy khỏi môi trường cách đun sôi môi trường 10 – 15 phút làm lạnh nhanh không cần lắc cấy ống môi trường thịt đun với – g thực phầm rắn – ml thực phẩm lỏng 15ml moi trường tăng sinh, ủ 350C Cấy ống TPGY trên,Incubate at 28°C ủ 280C Use TPGYT as alternative only when organism involved is strongly suspected of being a nonproteolytic strain of types B, E, or F Sử dụng TPGYT thay sinh vật phân hủy thuộc nhóm không phân giải protein loại B, E, F Tiêm thêm chất dẫn truyền độc tố từ bề mặt canh môi trường Sau ngày ủ bệnh kiểm tra canh môi trường gồm kiểm tra độ đục, sinh phân hủy hạt thịt, mùi Kiểm tra môi trường nuôi cấy kinh hiển vi, nhuộm gram crystal violet dung dịch methylene blue Quan sát hình thái học sinh vật lưu ý tồn tế bào Clostridium botulinum điển hình, phạm vi hình thành bào tử vị trí bào tử tế bào Vào thời điểm quan sát thấy có độc tố thi ta làm theo mục F bên Thông thường, sau ủ ngày thời kỳ thích hợp cho hình thành Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 13 độc tố botulin Nếu sau ngày mà không phát thấy độc tố ta nên ủ thêm 10 ngày để phát bào tử nảy mầm trễ trước đem bỏ mẫu thử Phân lập Clostridium botulinum phân lập từ dịch tăng sinh mẫu gốc hình thành bào tử tốt Tiền xử lý mẫu trước cấy ria Thêm thể tích cồn tuyệt đối, hay ml vào môi trường tăng sinh, trộn ủ 1h nhiệt độ phòng Xử lý bề mặt môi trường nuôi cấy Sử dụng dây cấy vòng khử trùng cấy lên môi trường phân lập để thu khuẩn lac riêng lẽ Nếu cần thiết, để có khuẩn lạc riêng lẽ pha loãng môi trường Ủ 35 OC khoảng 48 h điều kiện kỵ khí E Lựa chọn vùng C colonies botulinum điển hình Chọn lọc Select about 10 well-separated typical colonies, which may be raised or flat, smooth or rough Lựa chọn khoảng 10 khuẩn lạc đặc trưng có đặc điểm lồi On egg yolk medium, they usually exhibit surface iridescence when examined by oblique light.Trên môi trường lagg vokl, chúng thường có sáng bề mặt quan sát ánh sáng This luster zone, often referred to as a pearly layer, usually extends beyond and follows the irregular contour of the colony.Vùng sang thường kéo dài rộng đường viền bất định vùng Clostridium botulinum Besides the pearly zone, colonies of Vùng sáng khuẩn lạc Clostridium botulinum loại C, D, E bình thường bao quanh khu vực rộng (2-4 mm) kết tủa màu vàng Colonies of types A and B generally show a smaller zone of precipitation.Khuẩn lạc loại A B nói chung có vùng phát triển nhỏ Considerable difficulty may be experienced in picking toxic colonies since certain other members of the genus produce colonies with similar morphological characteristics but not produce toxins Khó khăn chọn vùng chứa độc tố có Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 14 vùng khác chi Clostridium botulinum với đặc điểm hình thái tượng tự không sản sinh độc tố .Tiêm chủng Use sterile transfer loop to inoculate each selected colony into tube of sterile broth.Sử dụng dây cấy vòng chuyển cấy chuyển vô trùng để cấy chuyển vùng chọn vào ống nuôi cấy vô trùng Inoculate Cấy Clostridium botulinum loại E vào canh môi trường TPGY Inoculate other toxin types of Cấy loại độc tố khác Clostridium botulinum vào canh trường gan xắt nhỏ môi trường thịt Incubate as described in D1, above, for days.Ủ mô tả phần ngày Test for toxin production as described in F, below Sau xác định sản xuất độc tố mô tả phần F phía To determine toxin type, F-3, below Phân lập Cấy chuyển chủng sinh độc tố đĩa Restreak toxic culture in duplicate on egg yolk agar mediummôi trường thạch lagg vokl Incubate one plate anaerobically at 35°C.Ủ đĩa thứ kỵ khí 35 ° C Incubate second plate aerobically at 35°C Ủ đĩa thứ hiếu khí 35 ° C If colonies typical of Nếu vùng điển hình Clostridium botulinum tìm thấy đĩa kỵ khí (không có tăng trưởng đĩa hiếu khí) khuẩn lạc môi trường khiết Việc phân lập Clostridium botulinum thất bại việc chọn khuẩn lạc đặc trưng Repeated serial transfer through additional enrichment steps may increase the numbers sufficiently to permit isolation.Lặp lặp lại qua bước tăng sinh làm tăng số lượng đủ để trình phân lập.Store pure culture in sporulated state either under refrigeration, on glass beads, or lyophilized F.Detection and identification of botulinal toxin Phát xác định độc tố botulin Chuẩn bị mẫu thực phẩm Culture one portion of sample for detection of viable Mẫu môi trường phát có độc tố C ; remove another portion for toxicity testing, and store remainder in refrigerator botulinum, lấy phần để thử nghiệm độc tính, phần lại lưu trữ tủ lạnh Centrifuge samples containing suspended Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 15 solids under refrigeration and use supernatant fluid for toxin assay.Ly tâm mẫu có chứa chất rắn lơ lửng điều kiện lạnh sử dụng chất lỏng mặt cho thử nghiệm độc tố Extract solid foods with equal volume of gel-phosphate buffer, pH 6.2, by macerating food and buffer with pre-chilled mortar and pestle Xác định tính độc tố mẫu thực phẩm môi trường - Xử lý trypsin: Độc tố loại không phân hủy protein, có diện, cần hoạt tính trypsin để phát Do đó, việc xử lý dịch thực phẩm, thực phẩm lỏng nuôi cấy môi trường TPGY với trypsin trước kiểm tra độc tố Không xử lý môi trường nuôi cấy TPGYT trypsin môi trường có chứa sẵn trypsin việc xử lý nhiều làm phân hủy hoàn toàn độc tố Điều chỉnh lại pH dịch mẫu đến 6,2 cách sử dụng NaOH HCl 1N Thêm 0,2 ml dung dịch trypsin vào 1,8 ml dịch mẫu cần kiểm tra độc tố Ủ 35 – 37 0C h lắc nhẹ - Kiểm tra độc tố: Conduct parallel tests with trypsin-treated materials and untreated duplicaTiến hành thử nghiệm song song mẫu không xử lý trypsin với mẫu xử lý trypsisn Dilute a portion of untreated sample fluid or culture to 1:5, 1:10, and 1:100 in gel-phosphate buffer Pha loãng phần mẫu chất lỏng không xử lý trypsin với nồng độ 1:5, 1:10 1:100 gel-phosphate buffer Thực tương tự mẫu xử lý trypsinMake the same dilutions of each trypsinized sample fluid or culture Mỗi độ pha loãng tiến hành Inject each of separate pairs of mice intraperitoneally (ip) with 0.5 ml untreated undiluted fluid and 0.5 ml of each dilution of untreated test sample, using a or ml syringe with 5/8 inch, 25 gauge needle.tiêm vào cặp chuột bụng với 0,5 ml dung dịch không pha loãng không xử lý 0,5 ml độ pha loãng mẫu thử nghiệm không xử lý Repeat this procedure with trypsin-treated duplicate samples Lặp lại thao tác với mẫu xử lý với trypsin Heat 1.5 ml of untreated supernatant fluid or culture for 10 at 100°C.Đun nóng 1,5 ml dịch không xử lý 10 phút 100°C Làm lạnh mẫu gia nhiệt tiêm vào đôi chuột Cool heated sample and inject each of a pair of mice with 0.5 ml undiluted fluid.0,5 ml dung dịch không pha loãng These mice should not die, Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 16 because botulinal toxin, if present, will be inactivated by heating.Những chuột không chết, có độc tố botulin, bất hoạt nhiệt - Observe all mice periodically for 48 h for symptoms of botulism.Quan sát tất chuột định kỳ 48 h cho triệu chứng bệnh ngộ độc Record symptoms and deaths Ghi lại triệu chứng tử vong Typical botulism signs in mice begin usually in the first 24 h with ruffling of fur, followed in sequence by labored breathing, weakness of limbs, and finally total paralysis with gasping for breath, followed by death due to respiratory failure Dấu hiệu ngộ độc điển hình chuột bắt đầu xuất 24 h lông, khó thở, yếu chân tay, cuối tê liệt với thở nhanh, sau tử vong suy hô hấp Death of mice without clinical symptoms of botulism is not sufficient evidence that injected material contained botulinal toxin Cái chết chuột mà triệu chứng lâm sàng bệnh ngộ độc không đủ chứng cho thấy chứa độc tố tiêm botulin On occasion, death occurs from other chemicals present in injected fluid, or from trauma Đôi khi, chết xảy từ hóa chất khác có dung dịch tiêm, từ chấn thương It is necessary to have dilutions that kill and dilutions that not kill in order to establish an endpoint or the minimum lethal dose (MLD) as an estimate of the amount of toxin preseNếu sau 48h quan sát, ngoại trừ tất chuột chết, lặp lại thử nghiệm độc tính cách sử dụng dịch pha loãng nồng độ cao Cần phải pha loãng dung dịch từ không giết chết chuột đến giết chết chuột để thiết lập liều tối thiểu gây chết người (MLD) trước ước tính số lượng độc tố có mặt The MLD is contained in the highest dilution killing both mice (or all mice inoculated) Các MLD có độ pha loãng cao giết chết hai chuột (hoặc tất chuột tiêm),From these data, the number of MLD/ml can be calculated từ liệu số ml / MLD tính toán *Store pure culture in sporulated state either under refrigeration, on glass beads, or lyophilized.To determine toxin type, F-3, below.****** Phương pháp đại a Phương pháp Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 17 Đựợc sử dụng để phát độc tố hoạt tính sinh học dò tìm độc tố không tích cực.Những tiến kỹ thuật vài thập niên vừa qua thúc đẩy phát triển nhiều kỹ thuật chuẩn đoán huyết nhanh nhạy, xác bệnh truyền nhiễm Mặt khác, phát triển kỹ thuật tự động cho phép đơn giản hóa thao tác thực Nguyên tắc phương pháp miễn dịch phản ứng kết hợp tế bào (kháng nguyên) với kháng thể đặc hiệu Tín hiệu phản ứng miễn dịch nhận biết thông qua ngưng tủa hay kết dính kháng nguyên – kháng thể cách sử dụng kháng thể đánh dấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme) Trong số phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay: ELISA) quan tâm nhiều có tính đơn giản hiệu cao Phương pháp sử dụng cho hầu hết loại kháng nguyên với độ nhạy độ đặc hiệu cao Nguyên tắc kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên đĩa giếng Nếu có diện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên giữ lại bề mặt giếng kháng nguyên phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme horseradish peroxydase hay alkaline phosphate Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu phát diện định lượng kháng nguyên ELISA sử dụng rộng rãi dạng kit thương mại cải tiến để tự động hóa ELISA sử dụng phát định lượng vi sinh vật thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh b Phương pháp lai phân tử Hiện nhiều hệ thống thiết lập dựa DNA để định lượng vi sinh vật độc tố Tuy nhiên, có phương pháp lai phân tử (hay gọi phương pháp mẫu dò, probes) phương pháp PCR thương mại hóa dạng kit phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát vi sinh vật thực phẩm dựa phát đoạn gen đặc trưng vi sinh vật Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 18 Cơ sở việc sử dụng mẫu dò phương pháp lai phân tử Quá trình bao gồm tách rời hai mạch đôi chuỗi xoắn kép DNA nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy (Tm) phân tử DNA tái bắt cặp trình tự nucleotide bổ sung nhiệt độ trở lại bình thường Sự lai phân tử xảy đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với vùng trình tự DNA mục tiêu gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ Quá trình lai phân tử chiu ảnh hưởng nhiều yếu tố: nồng độ DNA môi trường, nhiệt độ thời gian phản ứng, kích thước trình tự lai lực ion môi trường Ví dụ: Ở hệ thống dò Gen – trak (Framingham, USA), hệ thống sử dụng que thử với mẫu dò để phát Listeria mẫu bơ sữa mẫu môi trường mẫu dò đoạn oligomer AND đánh dấu hóa chất phát quang Quy trình phân tích chia làm bước: 1) Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA 2) Mẫu dò phát chứa fluorescein isothiocyanate đầu 5` 3` phân tử đặt vào phản ứng 3) Que thử bao bọc polydeoxythymidine (dT) để gắn với oligodA mẫu dò 4) Que thử đặt ống đo chứa mẫu dò phát đánh dấu enzyme 5) Sau rửa loại phần enzyme thừa, que thử đặt vào ống đo chứa chất tạo màu 6) Sau ủ để màu, màu phát bước sóng 450nm c Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Kỹ thuật Karl Mullis mà cộng phát minh vào năm 1985 Hiện nay, kỹ thuật sử dụng rộng rãi để phát hiện, Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 19 tạo đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát mầm bệnh vi sinh vật có thực phẩm… Tất DNA polymerase cần mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn Mạch khuôn thường trình tự DNA gen (gọi trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu gen quy định việc tổng hợp loại độc tố chuyên biệt vi sinh vật Mồi đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu đoạn mạch khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn mồi nối dài để hình thành mạch Phương pháp PCR hình thành dựa đặc tính DNA polymerase Khi có diện hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA phản ứng PCR, điều kiện đảm bảo hoạt động DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai mồi khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích thao tác gen Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thông tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn đủ để tạo mồi bổ sung chuyên biệt Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước: - Bước 1: Biến tính Trong dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao T m phân tử, thường 94 – 95 oC 30 – 60 giây Mạch đôi DNA tách thành dạng mạch đơn - Bước 2: Bước lai Nhiệt độ hạ thấp Tm mồi cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn, nhiệt độ khoảng 40 – 70oC, khoảng 30 – 60 giây - Bước 3: Tổng hợp Nhiệt độ tăng lên đến 72 oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt Thời gian bước tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 20 Trong phản ứng PCR, chu kỳ gồm bước lặp lại nhiều lần, lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước khuếch đại theo cấp số nhân Theo tính toán sau 30 đến 40 chu kỳ khuếch đại tạo 10 Sau phản ứng PCR, DNA nhuộm ethidium bromide quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR gel agarose quan sát tia UV (bước sóng 320nm) Quy trình chung cho việc phát vi khuẩn gây bệnh mẫu thực phẩm phương pháp PCR sau: - Bước 1: Tăng sinh môi trường không chọn lọc thời gian từ 10 – 20 - Bước 2: Thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào dung dịch TE (10mM Tris – HCl pH= 8,0, 1mM EDTA) với thể tích 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý nhiệt 100 oC 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR - Bước 3: Thực phản ứng PCR - Bước 4: Điện di gel agarose 1,5% xem kết đèn UV *Biện pháp kiểm soát Clostridium botulinum thực phẩm Không dùng đồ conserve đựng lon mà nắp phồng lên, chảy nước Cẩn thận với rau cải, tỏi ngâm dầu vô keo vô hũ nhà Nếu trường hợp tự làm conserve nguyên liệu tươi cần phải cất tủ lạnh phải quăng sau 10 ngày Không dùng thực phẩm hư, bọt, thúi bốc mùi lạ lúc nấu Không nên ăn, nghi ngờ đồ conserve không vô keo vô lọ cẩn thận phép vệ sinh Không nên cho cháu tuổi ăn mật ong kể loại sản phẩm có ghi nhãn hiệu như…đã hấp khử trùng pasteurized… Giữ vệ sinh tối đa giai đoạn làm đồ conserve nhà Nếu có máy autoclave để hấp khử lý tưởng Nếu nhà máy hấp autoclave Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 21 tạm áp dụng phương pháp nước nóng cần vô keo làm đồ conserve Keo nắp cần nấu nước sôi để diệt trùng Sau bỏ nguyên vật liệu vào keo, đậy nắp lại cho thật kỹ sau đem bỏ vào nồi nước thật sôi để khử trùng lần chót IV Kết luận Clostridium botulinum vi khuẩn nguy hiểm chúng tiết độc tố botulin tác động ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương gây tê liệt phần thể dần toàn thể người động vật Tuy nguy hiểm độc tố botulin có vài ứng dụng ích lợi y khoa trị liệu: Độc tố A sử dụng để trị xáo trộn thần kinh gây co thắt cơ, bệnh chứng gây ngứa ngái da, đau vùng mặt (douleur myofaciale), tiết nhiều mồ hôi (hyperhidrose), nhức đầu (migraine) Tuy bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum xảy mà quên phòng tránh, mà phải tuân thủ biện pháp kiểm soát chúng độc tố vi khuẩn mạnh bi nhiễm tỷ lệ tử vong cao V Tài liệu tham khảo http://case.vn/vi-VN/26/27/233/details.case http://tai-lieu.com/tai-lieu/khoa-luan-tong-quan-ve-clostridium-botulinum-va-doc-to-botulin7025/ Nguyễn Văn Nhi 13139119 Page 22