BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Võ Dương Thanh SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Võ Dương Thanh SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) IN VITRO Chuyên ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS BÙI TRANG VIỆT TS LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS Bùi Trang Việt tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn Cô TS Lê Thị Trung giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, động viên giúp đỡ em trình học tập làm luận văn Cô TS Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS Nguyễn Thị Mong, cô TS Trần Thanh Hương, Thầy PGS.TS Bùi Văn Lệ, Thầy TS Đỗ Minh Sĩ, cô TS Trần Lê Bảo Hà, Thầy PGS.TS Nguyễn Minh Công giảng dạy cho em kiến thức bổ ích Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa sinh học môn Sinh lý Thực vật tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập làm luận văn trường Các Thầy, Cô hội đồng dành thời gian đọc đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn em Em Hồ Thị Mỹ Linh nhiệt tình hướng dẫn cho em mượn dụng cụ; hoá chất để thực thí nghiệm Các anh chị chuyên ngành sinh học thực nghiệm khóa 20, bạn khóa 21, khóa 22 em học viên phòng môn Sinh lý Thực vật BGH tập thể giáo viên trường THPT Phú Quốc tạo điều kiện, giúp đỡ để em có thời gian hoàn thành chương trình học Cảm ơn tất người thân, người bạn bên cạnh tôi, dõi theo động viên em suốt trình học tập Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn ba mẹ anh chị,cả cu Bin yêu thương, động viên tạo điều kiện tốt cho hoàn thành chương trình học tập Một lần nữa, xin chân thành biết ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Võ Dương Thanh MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục hình Danh mục bảng MỞ ĐẦU Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Sự phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh học 1.1.4 Giá trị 1.1.5 Tình trạng 1.1.6 Những nghiên cứu Sưa 1.2 Sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.1 Khái niệm phát sinh hình thái thực vật 1.2.2 Sự phát sinh quan phát triển phôi hợp tử 1.2.2.1 Mô phân sinh chồi phát triển chồi 1.2.2.2 Mô phân sinh rễ hình thành rễ 1.2.2.3 Sự phát triển phôi hợp tử 1.2.3 Cơ sở phân tử phát sinh quan phát sinh phôi 10 1.3 Sự phát sinh hình thái thực vật in vitro 12 1.3.1 Sự tạo mô sẹo 13 1.3.2 Sự tạo dịch treo tế bào 14 1.3.3 Sự phát sinh quan 15 1.3.4 Sự phát sinh thu nhận phôi thể hệ 16 1.4 Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật 18 1.4.1 Auxin 18 1.4.2 Cytokinin 22 1.4.3 Sự kết hợp auxin cytokinin nuôi cấy in vitro 24 1.4.4 Gibberelline 25 1.4.5 Abscissic acid (ABA) 27 1.4.6 Etylene 28 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Vật liệu dùng nuôi cấy 29 2.1.2 Vật liệu sinh trắc nghiệm 29 2.2 Phương pháp 29 2.2.1 Nuôi cấy tạo Sưa in vitro 29 2.2.2 Sự tạo mô sẹo 30 2.2.2.1 Sự tạo mô sẹo từ Sưa in vitro 30 2.2.2.2 Sự tăng trưởng mô sẹo 31 2.2.3 Sự phát sinh quan từ mô sẹo 32 2.2.4 Quan sát hình thái giải phẫu 33 2.2.5 Đo cường độ hô hấp 33 2.2.6 Đo cường độ quang hợp 33 2.2.7 Đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật 33 2.2.7.1 Ly trích 33 2.2.7.2 Phân đoạn đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh 35 2.2.8 Áp dụng kết thay đổi hoạt tính chất điều hoà tăng trưởng thực vật trình tạo mô sẹo 36 2.2.9 Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo 37 2.2.9.1 Khảo sát khối lượng mô sẹo ảnh hưởng đến tạo dịch treo tế bào Sưa in vitro 37 2.2.9.2 Khảo sát nồng độ chất điều hoà tăng trưởng thực vật ảnh hưởng đến trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo Sưa in vitro 38 2.2.10 Phân tích số liệu 38 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết 39 3.1.1 Nuôi cấy tạo Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) in vitro 39 3.1.2 Sự tạo mô sẹo 39 3.1.2.1 Sự tạo mô sẹo từ Sưa in vitro 39 3.1.2.2 Sự tăng trưởng mô sẹo 55 3.1.2.3 Quan sát hình thái giải phẫu mô sẹo 57 3.1.2.4 Sự thay đổi cường độ hô hấp mẫu cấy trình tạo mô sẹo 64 3.1.2.5 Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trình tạo mô sẹo 65 3.1.2.6 Áp dụng kết thay đổi hoạt tính chất điều hoà tăng trưởng thực vật trình tạo mô sẹo 66 3.1.3 Sự phát sinh quan 67 3.1.3.1 Sự phát sinh quan từ mô sẹo 67 3.1.3.2 Hình thái giải phẫu khối mô sẹo trình phát sinh quan 70 3.1.3.3 Sự thay đổi cường độ quang hợp trình phát sinh quan mô sẹo 73 3.1.3.4 Sự thay đổi cường độ hô hấp trình phát sinh hình thái mô sẹo 74 3.1.3.5 Sự thay đổi hoạt tính CĐHTTTV trình phát sinh quan 75 3.1.4 Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo Sưa in vitro 76 3.1.4.1 Ảnh hưởng khối lượng mô sẹo đến tạo dịch treo tế bào Sưa in vitro 76 3.1.4.2 Ảnh hưởng nồng độ chất điều hoà tăng trưởng thực vật đến trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo Sưa in vitro 78 3.2 Thảo luận 81 3.2.1 Sự tạo Sưa in vitro 81 3.2.2 Sự tạo mô sẹo 81 3.2.3 Sự tăng trưởng mô sẹo 82 3.2.4 Những biến đổi hình thái giải phẫu trình hình thành mô sẹo 82 3.2.5 Sự thay đổi cường độ hô hấp trình tạo mô sẹo 83 3.2.6 Vai trò chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trình tạo mô sẹo 83 3.2.7 Áp dụng kết thay đổi hoạt tính chất điều hoà tăng trưởng thực vật trình tạo mô sẹo 84 3.2.8 Sự phát sinh quan từ mô sẹo 84 3.2.9 Những biến đổi hình thái giải phẫu trình phát sinh quan từ mô sẹo 84 3.2.10 Sự thay đổi cường độ hô hấp quang hợp trình phát sinh quan từ mô sẹo 85 3.2.11 Vai trò chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trình phát sinh quan từ mô sẹo 85 3.2.12 Sự tạo dịch treo tế bào 85 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 87 4.1 Kết luận 87 4.2 Đề nghị 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 PHỤ LỤC 95 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4- dichlorophenoxyacetic acid ABA : abscissic acid BA : N6-Benzyladenine CĐHTTTV : chất điều hoà tăng trưởng thực vật DNA : deoxyribonucleic acid GA : gibberelline GA : gibberellic acid IAA : indol acetic acid IBA : indolbutyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources MS : Murashige Skoog NAA : α-napthalenacetic acid RNA : ribonucleic acid TDZ : thidiazuron VU : Vulnerable (bị đe doạ, nguy cấp) DANH MỤC CÁC HÌNH Hình1.2 Sơ đồ tổng quát vùng mô phân sinh Hình 1.3 Sự tổ chức vùng phát sinh hình thái để tạo mô phân sinh rễ Hình 1.4 Sự thành lập rễ (với AIA 10-6 M) mô sẹo (với 2,4-D 10-6) từ mảnh Sansevieria (Bùi Trang Việt 2000) 13 Hình 1.5 Các giai đoạn thu nhận phôi thể hệ 17 Hình 1.6 Cấu trúc phân tử số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm auxin 19 Hình 1.7 Cấu trúc phân tử số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm cytokinin 23 Hình 1.8 Cấu trúc phân tử số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm gibberelline 26 Hình 1.9 Cấu trúc phân tử abscissic acid 27 Hình 1.10 Cấu trúc phân tử etylene 28 Hình 2.2 Mẫu cấy Sưa tuần tuổi để tạo mô sẹo 30 Hình 2.3 Sơ đồ li trích cô lập chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh 34 Hình 2.4 Mẫu cấy Sưa tuần tuổi để tạo mô sẹo 36 Hình 3.1 Cây Sưa nảy mầm in vitro sau tuần môi trường MS 39 Hình 3.2 Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro môi trường MS sau tuần, không hình thành mô sẹo 40 Hình 3.3.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l 40 Hình 3.4.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 0mg/l 41 Hình 3.5.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 0mg/l 41 Hình 3.6.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 0,5 mg/l 42 Hình 3.7.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 1mg/l 42 Hình 3.8.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 0,5mg/l 43 Hình 3.9.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 1mg/l 43 Hình 3.10.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 0,5mg/l 44 Hình 3.11.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l 44 Hình 3.12.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l 45 Hình 3.13.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l 46 Hình 3.14.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l 46 Hình 3.15.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 0,1mg/l 47 Hình 3.16.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 1mg/l 47 Hình 3.17.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA0,5mg/l 48 Hình 3.18.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l 48 Hình 3.19.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l 49 Hình 3.20.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 0,5mg/l 49 Hình 3.21.Mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l 50 Hình 3.22.Mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l 51 Hình 3.23.Mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l 51 Hình 3.24.Mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 0,5 mg/l 52 Hình 3.25.Mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 1mg/l 52 Hình 3.26.Mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 0,5mg/l 53 Hình 3.27.Mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 1mg/l 53 Hình 3.28.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l 54 Hình 3.29 Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro môi trường MS sau tuần, không hình thành mô sẹo 54 Hình 3.30 Sự tăng trưởng mẫu cấy tạo mô sẹo (trọng lượng tươi trọng lượng khô) môi trường khác theo thời gian 55 Hình 3.31 Sự tăng trưởng mô sẹo (trọng lượng tươi trọng lượng khô) môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l BA 1mg/l theo thời gian nuôi cấy 56 Hình 3.32.Lát cắt ngang thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro tuần tuổi 57 Hình 3.33 Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l sau ngày, có phản phân hóa tế bào nhu mô phân chia tế bào tượng tầng (mủi tên) 57 Hình 3.34 Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l sau ngày, tế bào mô sẹo phân chia để hình thành khối mô sẹo 58 Hình 3.35 Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l sau ngày, tế bào mô sẹo tách rời 58 Hình 3.36 Hình thái tế bào mô sẹo Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l sau tuần nuôi cấy, tế bào có hình dạng không ổn định kéo dài 59 Hình 3.37 Hình thái tế bào mô sẹo Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l sau tuần nuôi cấy, tế bào có hình dạng không ổn định kéo dài 59 Hình 3.38 Hình thái tế bào mô sẹo Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l sau tuần nuôi cấy, tế bào có hình dạng không ổn định kéo dài 60 Hình 3.39 Hình thái tế bào mô sẹo Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 0,5mg/l sau tuần nuôi cấy, tế bào có hình dạng không ổn định kéo dài 60 Hình 3.40 Hình thái tế bào mô sẹo Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 1mg/l sau tuần nuôi cấy, tế bào có hình dạng không ổn định 61 Hình 3.41 Hình thái tế bào mô sẹo Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 0,5mg/l sau tuần nuôi cấy, tế bào có hình dạng không ổn định 61 Hình 3.42 Hình thái tế bào mô sẹo Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 1mg/l sau tuần nuôi cấy, tế bào có hình dạng không ổn định, có tế bào kéo dài tế bào hình cầu 62 Hình 3.43 Hình thái tế bào mô sẹo Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 0,5mg/l sau tuần nuôi cấy, tế bào có hình dạng không ổn định 62 Hình 3.44 Hình thái tế bào mô sẹo Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l sau tuần nuôi cấy, tế bào có dạng hình cầu ổn định 63 Hình 3.45 Sự thay đổi cường độ hô hấp mô sẹo từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l theo thời gian 64 Hình 3.46 Sự thay đổi hoạt tính CĐHTTTV nội sinh khối mô sẹo qua tuần tuổi môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l 65 Hình 3.47 Sự tăng trưởng mẫu cấy tạo mô sẹo (trọng lượng tươi) môi trường khác theo thời gian 66 Hình 3.48 Mô sẹo hoá nâu chết sau tuần môi trường MS có bổ sung NAA 0,5mg/l BA 0,1mg/l 67 Hình 3.49 Mô sẹo phát triển mạnh hoá nâu dần môi trường MS có bổ sung NAA 0,5mg/l BA 0,5mg/lsau tuần 68 Hình 3.50 Mô sẹo phát sinh quan, bắt đầu xuất màu xanh môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l sau tuần, 68 Hình 3.51 Mô sẹo phát sinh hình thái môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l sau tuần, hình thành quan 69 Hình 3.52 Mô sẹo phát sinh hình thái môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l sau tuần, quan phát triển 69 Hình 3.53 Các cấu trúc sơ khởi chồi hình thành môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l 70 Hình 3.54 Sơ khởi chồi kéo dài môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l 70 Hình 3.55 Cơ quan chồi phát triển hình thành hệ mạch dẫn môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l 71 Hình 3.56.Cơ quan chồi phát triển mạnh hình thành látrên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l 71 Hình 3.57 Cơ quan chồi phát triển mạnh hoàn thiện môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l 72 Hình 3.58 Sự thay đổi cường độ quang hợp mô sẹo môi trường tạo quan MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l theo thời gian 73 Hình 3.59 Sự thay đổi cường độ hô hấp mô sẹo môi trường tạo quan MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l theo thời gian 74 Hình 3.60 Sự thay đổi hoạt tính CĐHTTTV nội sinh khối mô sẹo nuôi cấy tạo quan môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l theo thời gain nuôi 75 Hình 3.61 Dich treo nghiệm thức 2,0 gam mô sẹo phát triển môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l sau tuần 76 Hình 3.62 Dich treo nghiệm thức 500 mg mô sẹo phát triển môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l sau tuần 77 Hình 3.63 Cụm tế bào dịch treo nghiệm thức 2,0 gam mô sẹo môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l sau tuần 77 Hình 3.64 Cụm tế bào dịch treo nghiệm thức 500 mg mô sẹo môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l sau tuần 78 Hình 3.65 Cụm tế bào dịch treo nghiệm thức 500 mg mô sẹo môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 0,5mg/l sau tuần 79 Hình 3.66 Cụm tế bào dịch treo nghiệm thức 500 mg mô sẹo môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 1mg/l sau tuần 79 Hình 3.67 Cụm tế bào dịch treo nghiệm thức 500 mg mô sẹo môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 0,5mg/l sau tuần 80 Hình 3.68 Cụm tế bào dịch treo nghiệm thức 500 mg mô sẹo môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 1mg/l sau tuần 80 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nồng độ chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo từ Sưa in vitro 31 Bảng 2.2 Nồng độ chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào môi trường phát sinh quan từ mô sẹo Sưa 32 Bảng 2.3 Nồng độ chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo từ Sưa in vitro 37 Bảng 2.4 Nồng độ chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào môi trường tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo từ Sưa in vitro 38 Bảng 3.1 Sự thay đổi trọng lượng tươi khô mô sẹo có nguồn gốc từ khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro theo thời gian nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l BA 1mg/l 55 Bảng 3.2 Sự thay đổi trọng lượng tươi khô mô sẹo Sưa môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l BA 1mg/l theo thời gian nuôi cấy 56 Bảng 3.3 Sự thay đổi cường độ hô hấp mô sẹo từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l theo thời gian 64 Bảng 3.4 Sự thay đổi hoạt tính CĐHTTTV nội sinh khối mô sẹo qua tuần tuổi môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l 65 Bảng 3.5 Sự tăng trưởng (trọng lượng tươi) mẫu cấy tạo mô sẹo môi trường có bổ sung 2,4-D BA nồng khác theo thời gian 66 Bảng 3.6 Sự thay đổi cường độ quang hợpcủa mô sẹo môi trường tạo quan MS có bổ sung 2,4-D 0,1mg/l BA 3mg/l theo thời gian 73 Bảng 3.7 Sự thay đổi cường độ hô hấp mô sẹo môi trường tạo quan MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l theo thời gian 74 Bảng 3.8 Sự thay đổi hoạt tính CĐHTTTV nội sinh khối mô sẹo nuôi cấy tạo quan môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l BA 3mg/l theo thời gian nuôi cấy 75 MỞ ĐẦU Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) loài gỗ quý, hiếm, có giá trị kinh tế cao Gỗ thuộc loại nặng, cứng, có vân đẹp, không bị mối mọt có mùi thơm đặc biệt ( Đỗ Văn Bản cs 2009).Chính gỗ Sưa dùng để đóng đồ đạc gia đình cao cấp, làm đồ mỹ nghệ chạm khắc Cây có tán đẹp, hoa thơm nên trồng làm đường phố vườn hoa (Bộ Khoa học Công nghệ Việt Nam 1996) Trong y học cổ truyền Việt Nam Trung Quốc, nhiều loài chi Dalbergia sử dụng để chữa trị bệnh xương khớp, tiêu hoá, mụn nhọt, ngoại thương xuất huyết (Võ Văn Chi 1999).Những năm gần đây, giới thương gia Trung Quốc đổ xô săn lùng gỗ Sưa, giá gỗ Sưa đắt, vào thời điểm “ sốt” nhất, giá 1kg gỗ Sưa lên đến hàng chục triệu đồng, chí đến 11 tỉ đồng/m3 Chính gỗ Sưa bị khai thác mức Cây Sưa ghi nhận danh mục sách đỏ Việt Nam phủ Việt Nam quy định nhóm IA nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng năm 2006 loại đặc biệt quý có nguy đe dọa tuyệt chủng Theo đánh giá hiệp hội bảo tồn thiên nhiên giới, Sưa VU A1 cd – nguy cấp (UICN 1997) Đề tài “Sự tạo mô sẹo dịch treo tế bào từ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) in vitro”, nhằm tạo tiền đề cho nhân giống Sưa sau Nội dung đề tài tập trung nghiên cứu tạo mô sẹo, phát sinh quan từ mô sẹo bước đầu tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo Sưa in vitro 2 Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 1.1.1 Phân loại Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Fabales Họ : Fabaceae Phân Họ : Faboideae Chi : Dalbergia Loài : Dalbergia tonkinensis Prain Cây Sưa gọi Trắc thối (Võ Văn Chi 2003) 1.1.2 Sự phân bố Ở Việt Nam, Sưa phân bố tỉnh: Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Tây, Ninh Bình, Phú Yên, Khánh Hòa, Đồng Nai, Gia Lai Trên giới, Sưa có mặt Trung Quốc (đảo Hải Nam) Cây có tán đẹp, hoa thơm nên trồng làm đường phố vườn hoa (Bộ Khoa học Công nghệ Việt Nam 1996) 1.1.3 Đặc điểm sinh học Cây Sưa (Dalbergia tonkinesis Prain) thuộc gỗ nhỡ, rụng lá, cao 15 – 20 m, đường kín thân 0,5 – 0,7 m Vỏ màu xám trắng, thịt vàng, dày mm (Bộ khoa học công nghệ Việt Nam 1996) Gỗ Sưa có dác lõi phân biệt Gỗ dác có màu xám vàng nhạt Gỗ lõi có nhiều màu sắc, từ đỏ vàng đến nâu hồng tím, thường có sọc màu sẫm tạo thành vân đẹp mặt cắt Tia gỗ nhỏ hẹp, có cấu tạo tầng Gỗ sưa có mùi thơm đặc biệt mà gỗ trắc cẩm lai Trên mặt cắt ngang phần gỗ lõi vừa cắt ngang thường thấy có chất nhựa màu nâu đỏ đùn Gỗ sưa chủ yếu có lỗ mạch đơn đến kép ngắn 2-3 (gỗ trắc, cẩm lai có mạch kép 5-7) Chất nhựa chứa mạch nhiều, màu nâu đỏ đến nâu vàng Mô mền không dính mạch thường tụ hợp thành đám, đặc biệt có chứa chất hữu màu nâu đỏ đến nâu vàng (Đỗ Văn Bản cs 2009) Lá kép lông chim lần, mang – 17 chét, mọc cách, hình bầu dục rộng, đầu có mũi nhọn ngắn, gốc tròn, gân bậc hai khoảng 10 đôi, mặt màu mốc.Hoa trắng thơm Cụm hoa chùy nách Đài dạng chuông, xẻ thùy.Quả đậu hình bầu dục dài – cm, rộng – 2,5 cm, mùa hoa tháng – 3, mùa chín – 11 Quả mang – hạt hình thận, dài mm, rộng mm Tái sinh hạt chồi (Bộ khoa học công nghệ Việt Nam 1996) 1.1.4 Giá trị Gỗ Sưa loại gỗ quý, nước ta, có giá trị kinh tế cao Gỗ thuộc loại nặng, cứng, có vân đẹp, không bị mối mọt có mùi thơm đặc biệt (Đỗ Văn Bản csv 2009).Chính gỗ Sưa dùng để đóng đồ đạc gia đình cao cấp, làm đồ mỹ nghệ chạm khắc Cây có tán đẹp, hoa thơm nên trồng làm đường phố vườn hoa (Bộ Khoa học Công nghệ Việt Nam 1996) Trong y học cổ truyền Việt Nam Trung Quốc, nhiều loài chi Dalbergia sử dụng để chữa trị bệnh xương khớp, tiêu hoá, mụn nhọt, ngoại thương xuất huyết (Võ Văn Chi 1999) 1.1.5 Tình trạng Sưa bị tận diệt khai thác Theo IUCN cấp đe dọa VU A1cd - nguy cấp (năm đánh giá 1997) Dalbergia tonkinensis Prain ghi nhận danh mục sách đỏ Việt Nam phủ Việt Nam quy định nhóm IA nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng năm 2006 loại đặc biệt quý có nguy đe dọa tuyệt chủng Giá gỗ Sưa đắt Năm 2007, “sốt” gỗ Sưa bùng phát Việt Nam Ban đầu vài trăm ngàn đồng 1kg, thời gian ngắn, vào thời điểm “sốt” nhất, giá 1kg sưa lên đến hàng chục triệu đồng, chí đến 11 tỉ đồng/m3 1.1.6 Những nghiên cứu Sưa Tại số trại giống, Sưa nhân giống hom, với điều kiện: phải có giàn phun sương, hom đánh tẻ sử dụng số chất kích thích rễ IBA, NAA (Trần Vinh 2007) Trên giới Việt Nam nghiên cứu Sưa chưa công bố Tài liệu Sưa không nhiều chưa chuyên sâu Những nghiên cứu mớivề Sưa: Xác định trình tự đoạn gen tRNA – Leu cho hai loài gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) gỗ Trắc đỏ (Dalbergiacochinchinensis ) phục vụ việc phân loại mẫu vật bảo tàng thiên nhiên Việt Nam Kết nghiên cứu xác định trình tụ nucleotide thuộc gen tRNA – Leu (trnL) cho loài D.tonkinensis Việt Nam D.cochinchinensis Việt Nam có độ dài 476bp 432bp (tương ứng) mức độ tương đồng di truyền 99,8% Mức độ tương đồng di truyền hai loài Dalbergia Việt Nam với 13 loàiDalbergia khác giới dao động từ 94,6% (giữa D.tonkinensis Việt Nam D foliolosa; D.cochinchinensis Việt Nam D foliolosa) đến 100% (giữa D decipularis D frutescens) (Vũ Thị Thu Hiền cs 2009) Những kết nghiên cứu ban đầu thành phần hoá học isoflavon dihydrophenanthren Sưa (Dalbergia tonkinensis) Đây lần khung dihydrophenanthren tìm thấy chi Dalbergia(Trần Anh Tuấn cs 2009) 1.2 Sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.1 Khái niệm phát sinh hình thái thực vật Sự phát sinh hình thái thực vật trình phát triển thể thực vật, tế bào, mô, quan theo thời gian, thông qua phân chia, tăng trưởng phân hóa tế bào Bao gồm trình (Bùi Trang Việt 2000): + Phát sinh mô (histogenesis) + Phát sinh quan (organogenesis) + Phát sinh phôi (embryogenesis) Sự phát sinh hình thái phụ thuộc vào hai trình bản: điều hòa hướng kéo dài tế bào, kiểm soát vị trí hướng mặt phẳng phân chia tế [...]... (UICN 1997) Đề tài Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) in vitro , nhằm tạo tiền đề cho sự nhân giống Sưa sau này Nội dung đề tài tập trung nghiên cứu sự tạo mô sẹo, sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo và bước đầu tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của cây Sưa in vitro 2 Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 1.1.1 Phân loại... mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 7 ngày, các tế bào mô sẹo đang tách rời nhau 58 Hình 3.36 Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định và kéo dài 59 Hình 3.37 Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường... mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 3 ngày, có sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô và sự phân chia của tế bào tượng tầng (mủi tên) 57 Hình 3.34 Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 5 ngày, các tế bào mô sẹo đang phân chia để hình thành khối mô sẹo ... vào các môi trường tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro 31 Bảng 2.2 Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường phát sinh cơ quan từ mô sẹo cây Sưa 32 Bảng 2.3 Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro 37 Bảng 2.4 Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường tạo dịch. .. môi trường tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo từ cây Sưa in vitro 38 Bảng 3.1 Sự thay đổi trọng lượng tươi và khô của mô sẹo có nguồn gốc từ khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro theo thời gian nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l và BA 1mg/l 55 Bảng 3.2 Sự thay đổi trọng lượng tươi và khô của mô sẹo cây Sưa trên môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l và BA 1mg/l theo thời... 61 Hình 3.42 Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định, có những tế bào kéo dài và những tế bào hình cầu 62 Hình 3.43 Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 0,5mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn... nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định và kéo dài 59 Hình 3.38 Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định và kéo dài 60 Hình 3.39 Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng... bào có hình dạng không ổn định và kéo dài 60 Hình 3.40 Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định 61 Hình 3.41 Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định... thức 2,0 gam mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần 77 Hình 3.64 Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần 78 Hình 3.65 Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5mg/l sau 1 tuần 79 Hình 3.66 Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm... Hình 3.44 Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có dạng hình cầu ổn định nhất 63 Hình 3.45 Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l theo thời gian 64 Hình 3.46 Sự thay đổi hoạt tính